Summary
在这里，我们提出了在实验室饲养的中间胚芽甲虫， 白腹皮蠹 （ 四纹豆象 ）协议。我们还同胚胎和父母的RNAi方案和方法分析表型的胚胎基因功能研究该物种。
Introduction
在1998年，消防和Mello报道，双链RNA（dsRNA）的可诱导基因功能的抑制线虫 1。通过双链RNA触发此响应被命名为RNA干扰（RNAi），并且据报道这种RNAi介导的基因沉默在动物，植物和真菌2-7是保守的。在植物和一些动物，RNA干扰的功能全身的，这意味着影响可以传播到的dsRNA不直接导入其它细胞/组织（在8-10中综述）。科学家利用通过设计的dsRNA的目标感兴趣的基因这种内源性细胞RNAi应答，从而击倒基因功能，无需直接操纵基因组（11-14综述）。
RNA干扰是由于以下优点功能研究的强有力的工具。首先，甚至以最小的基因序列信息，一个基因可以通过使用RNA干扰的目标。这是圣特别重要缺乏的基因组或转录组数据的非模式生物udies。第二，在生物体，其中所述RNAi响应是鲁棒全身性的，RNAi介导的基因敲除，可以在几乎任何发育阶段进行。此功能是用于研究多效基因的功能非常有用的。第三，在一些情况下，RNA干扰效果扩散到性腺和后代，使得表型在后代15,16观察到。这种现象，被称为亲RNA干扰（pRNAi），为基因影响胚胎发育特别有利的，因为由单个注射亲本产生的大量后代可以不鸡蛋的直接操作进行检查。由于这些原因，pRNAi是选择的方法。然而，如果pRNAi是无效的，例如用于对卵子发生所需的基因，那么胚胎RNA干扰（eRNAi）必须使用。第四，RNAi技术可以用来产生在一个等位基因系列dsRNA的量交付可以在一定范围内变化的等效，以产生弱到强的缺陷。表型的这种灰度可以是用于理解基因功能，当基因参与一个复杂的过程和/或功能的完全丧失是致死有帮助的。第五，dsRNA的交付通常是很容易的，可行的，尤其是在动物显示出强大的系统性的RNAi反应。双链RNA可以通过显微注射1,5，喂食/ 17,18摄入，浸泡，19,20和病毒/细菌介导的递送21,22引入。第六，不像一些基因打靶/编辑方法，没有必要以筛选携带突变生物体或开展遗传杂交使用的RNAi时生成纯合子。因此，与许多其他技术用于研究基因功能，RNAi是快速，廉价，并且可以应用于大型屏幕23-25。
RNAi技术的广泛实用程序提供了手段，广泛的生物进行功能研究，扩大品种范围可供研究博扬ð为其遗传工具已经开发的传统模式系统。例如，使用非模型系统的研究是必需由种代表不同的发展模式，或表现出不同的形态特征比较26-29同源基因的功能给予见解的基因和基因网络的演进。这些类型的研究将提供一个更好的理解生物多样性的，与两个应用和基础研究的影响。
作为地球上最大的动物群，昆虫提供了一个很好的机会，探讨其作用机制基本多样性。此外，昆虫一般都比较小，生命周期很短，繁殖力高，而且很容易在实验室后方。在过去的二十年中，RNA干扰已成功应用于昆虫跨越的订单，其中包括双翅目（真苍蝇）5，鳞翅目（蝴蝶和飞蛾）30，鞘翅目（甲虫）16,31，膜翅目（声表面波滤波器谎言，黄蜂，蚂蚁和蜜蜂）32，半翅目（真正的错误），等翅目（白蚁）34，蜚蠊目（蟑螂）35，直（蟋蟀，蚱蜢，蝗虫，螽斯和）36 Phthiraptera（虱子）37。 RNA干扰的成功应用，提供了用于在早期胚胎图案形成的研究功能数据（前后轴32，背腹轴28，分割26,38），性别决定39,40，壳多糖/角质层生物合成41，蜕皮激素信令42，社会行为43，等等。对于不同的昆虫物种开发RNAi的方法可能的，因为它们很可能是对虫害控制（在44-46综述）有用的附加的好处。 RNAi的影响将是基因特异性以及种特异性，只要非保守区被选择用于靶向。对于益虫物种，如蜜蜂和蚕，目标基因的生存至关重要病毒或寄生虫感染控制可提供保护这些物种47,48的新策略。
白腹皮蠹 （ 四纹豆象 ），俗名隐藏的甲虫，是分布在世界各地，除了南极洲。作为holometabolous昆虫中，D.斑生命周期包括胚胎，幼体，蛹和成虫阶段（ 图1）。因为它的肉源，D.斑被博物馆用来缩略动物尸体和法医昆虫学家可以用它来估计死亡49,50的时间。 D.斑饲料对动物产品，包括尸体，风干肉，奶酪和蛹/其他昆虫的茧，从而造成损害的家庭，储存食物，丝绸，奶酪和肉类行业51,52。在这种甲虫应用RNAi技术可以提供一个高效和环保的方式，以尽量减少其经济影响。我们的实验室使用了斑D.作为一个新的M奥德尔昆虫研究的分割53。除了是服从实验室饲养，D.纹豆象是基础研究的兴趣，因为它是一个中间胚芽开发，使之成为一个有用的物种，研究短期和长期牙胚发育之间的过渡。
图1：D斑的生命周期。 D.斑的照片在不同的生命阶段，如图所示。从卵到成年生命周期需要在30℃C三星期，但不再在较低温度下。 （A，F）刚打下胚胎白色至浅黄色和椭圆形，约1.5毫米长。胚胎发育需要〜30℃下55小时。 （B，C和G）幼虫有深色色素条纹和覆盖着刚毛。幼虫通过根据环境和其长度几龄可以延伸到超过1厘米。 （D，H） （E，I）羽化后不久，深色素沉着出现在成虫体。成人能活到数月，一名女性能在她的一生打下数百胚胎。 请点击此处查看该图的放大版本。
以前，我们发现，RNAi是有效的，在D. 53 斑撞倒基因功能。这里我们的经验饲养D.斑菌落在实验室用一步一步协议胚胎和亲RNAi的设置，注射，注射后护理，和表型分析沿共用。这里介绍的dsRNA介导的基因敲低和分析方法不仅为D.斑寻址问题提供详细的信息，但也有FO潜在意义R IN其他非模型甲虫/昆虫RNAi的应用。
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Protocol
1. D.斑的饲养
注：D斑的繁殖地使用成人设立在作者的实验室和幼虫购得。使用DNA条形码53种身份进行了验证。
- 要建立实验室新笼，传播刨花薄薄的一层到一个中等大小的虫笼（30.5×19×20.3厘米3）。将保丽龙的约10×6×3厘米3块在笼子里，让对化蛹的幼虫隐藏。添加20 - 50甲虫（成人或晚龄幼虫）。甲虫将在刨花隐藏。
- 加湿猫粮在培养皿或称量船上。盖上网眼布笼，并把笼子中的孵化器。
- 用于在实验室中保持繁殖地，设置25和30℃之间的温度。 D.斑生长在较高的温度下更快，但是，这也促进了真菌和螨虫的生长。为了维持治疗你的殖民地，使用25 - 28°C进行定期保养的股票和30℃迅速扩大的殖民地。生命周期需要在三周至四个月取决于环境因素50（ 图2）。
图 2：D斑 实验室殖民地。一个典型的D.斑虫笼的照片所示。刨花散布让甲虫隐藏。猫的食品在小培养皿或称重舟说。泡沫塑料放入笼最终龄幼虫化蛹的避难所。这里示出的保持架是30.5×19×20.3厘米3和容纳几百幼虫，蛹和成虫。 请点击此处查看该图的放大版本。
- LEA鸡蛋已经在笼中走向成熟。为扩大殖民地，如上，幼虫，成虫或（如第2节所述收集），鸡蛋建立新的笼子。 D.纹豆象产卵整个笼子里，特别是靠近食物来源。
- 更换大约一个星期两次湿的猫食。
注：由于湿猫粮的难闻的气味，可替代食物来源也进行了测试（见讨论）。
2.胚胎收集
- 要建立一个集合，分开，至少50名男性和从殖民地女性50。年轻人是最好的。发生在成年人没有刨花一个小规模的笼子（17.8 X 10.2×12.7厘米3）。添加猫粮在称量船。
- 在开始收集前应仔细检查腾笼换任何存在的胚胎，并删除它们。把一个延伸棉花球入笼，并留下笼在30℃培养箱。适当的时间窗后，棉球将准备胚胎收集。
- 折在半片黑纸建筑（A4尺寸）来创建一个折痕，然后展开。
- 从笼中取出拉长棉花球。从棉球取出成人，并把它们放回笼子。
- 虽然轻轻捏拉伸的棉花球，把它拆开缓缓驶入棉薄丝，让鸡蛋落在黑纸。
注：D.斑胚胎是脆弱的，很难在棉花地看到。他们可以持有，如果棉球过于牢固轻易粉碎。
3.准备双链RNA
- DNA模板制备的合成双链RNA
- 运行4 - 使用含有T7启动子的序列在两个5的引物6 50微升的PCR反应'端根据制造商的协议来扩增DNA模板。
- 净化用市售PCR纯化试剂盒，按照制造商的说明PCR产物。 DNA模板的理想最终浓度为≥100纳克/微升。
- 注射缓冲液的制备
- 制备100ml注射缓冲液（0.1毫的NaH 2 PO 4，5mM的KCl）中。调节pH至6.8用5M NaOH中。
- 商店等分于-20℃。
- 合成双链RNA
- 设置在冰上0.2mL的PCR管的反应，并进行用T7聚合酶，按照生产商的说明在体外转录反应中，使用〜每反应500纳克的模板。
- 在37℃孵育管过夜。
- 消化用DNase DNA模板，按照生产商的说明。
- 加热管至94℃，并在94℃保持3分钟。
- 退火的双链RNA，慢慢由1℃/分钟，直至1小时后达到45℃冷却该管。
注意：步骤3.3.2通过3.3.5可以在热循环仪中进行。 - 乙醇dsRNA的沉淀，加入280微升无RNase水到20微升的反应，并调整到300微升的最终体积。加入30微升的3M醋酸钠（pH5.2）和650微升乙醇。放置在-20℃冷冻试管过夜。
- 在4℃以15,682 xg离心离心30分钟后，洗所述dsRNA沉淀用70％乙醇。干颗粒和20微升溶解注射缓冲液。
- 测量使用分光光度计在260的dsRNA的浓度。理想的浓度为3 - 5微克/微升。通过在90 V上运行5微升在1％琼脂糖凝胶1:25稀释的dsRNA的30分钟检查质量。预期大小的单条带，将容易地看到。
- 存储双链RNA在-20℃或更低的温度。
注：对于每RNAi敲低实验中，包括一个控制的dsRNA，其中预期不会冲击正在研究的过程。 GFP的dsRNA是大多数实验的一个很好的控制。准备并与experime注入控制的dsRNA侧由端ntal双链RNA。
4.微量注射器和微操作机器人的组装
注：参见图3。
- 连接氮气或其它供气气动泵仪器的压力输入。如果一个气动泵不可用，使用50毫升注射器连接于细管施加压力。
- 脚踏开关连接到泵控制弹出压力流量的遥控接口。
- 附加的玻璃毛细管保持器与管泵的排出压力端口。
- 固定在接近解剖显微镜一个显微毛细管持有人。
5.胚胎RNA干扰
注意： 图4示出四纹豆象胚胎的RNAi的流程图。
- eRNAi准备
- 准备一个胚胎收集培养皿的盖子（90毫米直径）。将一张黑色的滤纸到c在盖的内部。把一个标准的显微镜载玻片上的黑纸。
- 稀释到双链RNA注射缓冲适当的浓度。使用2 - 3微克/初始实验微升。始终注射前保持在冰上的dsRNA。
- 添加食用色素1:40稀释的双链RNA和吸管轻轻几次拌匀。
- 收集胚胎注射
注：在25°C，在胚胎细胞核6 - 8小时后产蛋（AEL）向卵子周围53迁移。 10小时AEL 53 -蜂窝胚是8内建立。以确保前蜂窝胚期胚胎用于注射，0 - 3小时AEL胚推荐使用53。胚胎收集，准备和注射通常需要不到2小时，如果玻璃毛细管都处于良好状态。因此，整个过程可在5小时AEL内完成。- 如步骤收集胚胎2.2-2.5。
- 点击黑色建筑用纸胚胎转移到收集培养皿的盖子。
- 粘双面胶带沿着滑动的边缘。
- 使用油漆刷，对准磁带上的胚胎垂直于与在边缘的前或后端滑块边缘。需要注意的是早期胚胎的前部和后部端部不容易区分，因而平均的一半将在后端这是理想的注入。
- 加载双链RNA进入玻璃毛细管
- 占用2 - 4微升的dsRNA成20微升微加载的枪头。
- 插入的尖端进入预拉玻璃毛细管（称为针），并轻轻地吸取所述dsRNA溶液注入毛细管中。从准备使用微量拉马商用玻璃毛细管针。一种理想的拔出针的一个例子示于图5。长度和针的锥形可能需要被对焦优化之三注射试验。
- 固定玻璃毛细管导入玻璃毛细管保持器。
- 组装毛细管持有人到显微。
- 双链RNA注射胚胎成
- 小心地用胚胎滑动转印到解剖显微镜的阶段。
- 移动滑板带来一个胚胎到外地和焦点显微镜的中心。
- 而寻找到解剖显微镜毛细管的尖端与显微定位。带来附近的行中的第一个胚胎的端部的尖端。
- 交换机上的氮气或其它气源。
- 设置电磁输入选择开关真空。
- 调整弹出调压器10 - 15磅。调整取决于该装置的压力。
- 如有必要，打开毛细管。一旦该尖端部是开放的，有色的dsRNA溶液将填补小费。
- 向前移动毛细管尖端穿刺电子商务mbryo。如果压力设置是理想的，无胚胎的流体将流入所述毛细管。
- 步骤脚踏开关上以喷射的dsRNA溶液进入胚胎直到溶液适量喷出。 图5示出的溶液适当和不适当的量被注射后胚胎形态的例子。
- 保持毛细管尖端胚胎的〜2秒内，然后将其删除。
- 移动毛细管到下一个胚胎，并重复步骤5.4.8 - 5.4.10，直到所有的胚胎注入。更换玻璃毛细管，如果它被堵塞或破裂。
- 注射后恢复和培养
- 注射后，放置在培养皿中的幻灯片。
- 添加湿棉球培养皿。不要让棉花球碰的幻灯片。
- 盖培养皿中，用封口膜包裹。标签的盘用的dsRNA，浓度，日期，时间，和数量的注入的名称胚胎。
- 放置在30℃的培养箱中，直到胚胎孵化培养皿。
6.家长的RNAi
- 隔离蛹为pRNAi
- 从殖民地收集蛹。
- 排序男性并在显微镜下雌性蛹（ 见图6）。保持它们在30℃的培养箱中两个单独的培养皿，以确保在注射前没有配合发生。
- 检查每天eclosed成年人。化蛹通常需要5 - 7天30℃。
- 转让eclosed男性和女性（ 见图6），以两个独立的培养皿中，并喂它们猫粮隔日，直到他们准备注射。
- 继续注射，一旦有足够多的女性，并在适当的年龄男性。女4〜8天后羽化是最好的。对于一个典型的分析，8 - 使用12位女性。都需要配合54男性数目相等。
- 冰（5.1.2和5.1.3）准备的dsRNA。
- 附加32号针头至10微升的注射器。
- 麻醉对CO 2阶段的女性。
- 加载的dsRNA溶液到注射器而不占用任何空气。
- 举办女腹侧用一只手，并与其他注射器。
- 轻轻穿透腹板2和3之间的segmacoria（膜）与针的尖端。 图7示出在注射过程中女性。如果针不容易穿透组织，角度针向上和慢慢向下压。插入针的大约2mm到体内。
- 检查注射器刻度一边慢慢推柱塞，注射每雌〜2微升。
- 注射后，从女性的腹部取出前保持针仍然为至少5秒。
- 转移注入雌性至培养皿（直径90mm），并用猫食饲料。
- 标签的培养皿所述dsRNA名称，注射量，日期，和女性的数目。
- 注射后恢复和配合
- 孵育在30℃的培养箱中的培养皿。
- 24小时后，转移注入雌性到迷你笼。
- 添加到笼子未注射年轻男性的数量相等，并贴上标签笼。
- 添加与猫的食物称重船入笼。
- 离开笼在30℃的培养箱中，以允许配合。 24小时后，女性应开始产卵和胚胎可以每日或在所需的时间间隔来收集。
7.表型分析后的RNAi
注：在30°C，它需要〜55小时的鸡蛋孵化50。
- eRNAi生存力分析
- 通过孵出幼虫的数目进行比较，以总NU计算孵化率注射胚胎的MBER。一定要包括阴性对照作为注入胚胎可能受到伤害或注射过程杀害。 60％ - 典型的孵化率为30％而有所不同。谨防孵幼虫吃未孵化的蛋。
- pRNAi生存力分析
注意：如果女性生存能力是通过RNAi靶向基因的影响，女性注射特定的双链RNA，但不是阴性对照双链RNA就会开始死亡。如果产蛋或产蛋受到影响，女性会表现出部分或完全无菌。相对于阴性对照评分女性的生存或通过比较实验和控制女性（7.2.3）产卵的总数。- 接下来的步骤2.2建立胚胎收集。
- 24小时后，收集以下步骤2.4胚胎 - 2.5。
- 算胚胎的总数。
- 胚胎转移至90毫米的培养皿。标签培养皿有针对性的基因，采集日期和胚胎数。 孵育胚胎在30℃的培养箱中直到孵化。由于对未孵化的胚胎孵化出仔鱼饲料，使用镊子（见讨论）从胚胎未孵化的检查培养皿经常和独立孵幼虫。
- 计数孵出的胚胎的数目和计算孵化率。
- 检查角质层缺陷孵幼虫
- 在1.5 ml离心管收集孵幼虫。
- 在通风橱中，加入1 ml固定溶液中。
- 离开，在4℃下的离心管中至少过夜以让该溶液渗透幼体组织。
- 可视化，从管中删除尽可能多的固定液。
- 漂洗幼虫至少三次用PBST。
- 转移幼虫与使用PBST与端的P 1000枪头多井玻璃板切断扩大它。
- 在解剖显微镜下，使用镊子来检查缺陷舒展幼虫。一世t是伸出幼虫检查缺陷固定液他们的身体合同的关键。
- 检查角质层缺陷未孵化的幼虫
注意：此过程是早期胚胎表型的考试有用的，尤其是对于那些不求生存，以孵化的胚胎。- 为pRNAi，添加PBST入培养皿（7.2.4）和利用P-1000枪头未孵化的胚胎转移到1.5ml微量离心管中与端切断。对于eRNAi，加入PBST到培养皿（5.5.4），刷未孵化的胚胎关闭显微镜载玻片，并将它们转移到一个离心管中。
- 修正了固定液的胚胎，并用PBST冲洗一下可视化下面的步骤7.3.2 - 7.3.6。
- 使用镊子，解剖胚胎出蛋壳的在PBST在解剖显微镜下。
- 胚胎转移回1.5 ml离心管（〜200μl的胚胎在每个管）。
- 删除尽可能多的溶胶ution越好。
- 加入1ml 90％的乳酸/ 10％EtOH中。留在60℃的培养箱离心管至少过夜。
注：胚胎可以在60℃下放置数天。 - 挂载胚胎，利用P-1000枪头与端切断吸取他们到显微镜载玻片。
- 用钳子将胚手动定位到一个理想的方向。
- 盖上盖玻片胚胎，并使用DIC显微镜下可视化。
- 检查细胞与分子缺陷
注：此过程对于调查未伴有表皮角质层的缺陷或表型杀伤力的根本原因很有用。- 对于pRNAi，从棉球独立的胚胎在适当的发展阶段，并将它们转移到一个胚胎收集筐。收集筐可以是相同或类似的用于果蝇胚胎集合。
- 使从去除小瓶的底部25毫升塑料闪烁小瓶蛋篮，和一个圆切口盖（大约直径为1厘米）的。地方超细一圈网状约2.5厘米的盖子内径，然后拧上闪烁瓶中，用颠倒。
- 作为网眼可以一次将胚洗涤容易地除去，浸入网格在一个离心管中与水以回收附着在网状任何胚胎。
- 为eRNAi，在适当的阶段，添加PBST到培养皿。刷过的胚胎在显微镜载玻片，并将它们转移到一个胚胎收集筐。
注：固定，原位杂交，抗体染色和核染色协议可以在Xiang 等中找到。 2015年53。
- 对于pRNAi，从棉球独立的胚胎在适当的发展阶段，并将它们转移到一个胚胎收集筐。收集筐可以是相同或类似的用于果蝇胚胎集合。
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Representative Results
作者的实验室已用RNAi技术来研究基因调节昆虫53,55分割功能的进化。虽然所有的昆虫被分割，调节这一过程的基因出现在昆虫辐射26,38,56-63有分歧。在果蝇遗传筛选确定了一组九个是负责促进主体段64-70的形成一对规则分割基因。这里，这些基因中的一个的直向同源物， 成对 （PRD），用于记录的RNAi的用途为在D斑研究基因功能。
eRNAi和pRNAi分别有效地显示对DMAC的角色-在这个物种形成细分珠三角 。 2 - dsRNA的3微克/微升设计为靶向DMAC - PRD（ 图8B，8D和8F GFP双链RNA，注射为阴性对照（ 图8A，8C和8E）。
控制孵出的后代与每段一个色素带。相邻着色条纹是由一个未着色的间隙（ 图8A）分离。 珠三角 pRNAi后，受影响的后代孵化与熔融周边色素条纹，说明段的界限存在缺陷（ 图8B）。根据表型的严重程度，一个或多个融合在受影响的幼虫进行检测。然而，融合体始终出现在/ T3中，A1 / A2，A3 / A4，A5 / A6，A7 / A8 T2之间的边界区域，这表明对规则状缺陷。 PRD击倒后角质层表型表明腹节的损失以及缩短体长度（ 图8D）。进行ENGRAILED（EN）抗体染色检查早期的分子缺陷珠三角击倒后的胚胎。虽然控制胚胎表现出条纹恩表达在每一个环节（ 图8E）等强度，从DMAC珠三角 dsRNA的后代交替的条纹检测减少恩表达注射女性（ 图8F星号）。减少恩表达模式与受影响孵幼虫观察到有缺陷的角质层格局相一致。对于D. 珠三角 斑击倒后的表型的更详细的结果，请参见翔等人。 2015年53。
图3：喷射装置。用于注入D.斑胚胎解剖显微镜和显微操纵器的照片所示。供氮被连接到一个气动泵的压力输入端口。玻璃毛细管保持器被连接到ejec泵的压力牛逼端口。脚踏开关被连接到所述泵。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：为D.斑胚胎RNAi的流程图。 （AD）收集的胚胎用于注射。雌虫在棉球胚胎（橙色）（灰色圆圈）。从棉球独立的胚胎，让他们拖放到一块黑色的建设纸。白色条表示泪水在棉花球。转移胚胎到收集培养皿的盖子，用黑纸衬里。 （E，F）注射的dsRNA成胚胎。对准的双面胶带幻灯片胚胎，并在解剖显微镜下分别注入其中。针绿色食品染料所示。 （GJ）注射后的恢复和incub通货膨胀。放置湿棉球培养皿提供湿度。盖培养皿中，用封口膜（浅蓝色）包裹。放置在培养皿中的孵化器，并删除孵幼虫为表型分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：好的和坏胚注塑的例子。 （一）未注射胚胎。 （B）胚胎注射了太少的dsRNA。 （C）的胚胎注射dsRNA的适当的量。 （D）破碎胚胎与双链RNA四溢造成过注射。食用色素添加到dsRNA的可视化。 （E）作为针注射拉毛细管的例子。注意锥度和小费为f或功能针的两个例子。 AD的刻度条表示200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：雌雄成虫和蛹。 （A）男蛹的腹面观。 （A'）A.（A“）男性生殖器蛹插图的后部的放大倍率。（B）女蛹腹面（B'）B.女蛹后部的放大倍数有两种生殖乳突（白箭头）。（B“）的女蛹生殖器插图。 （三）成年男性的腹面观。 （C'）C的后部的放大图需要注意的是男性成年人三叉戟像生殖器和在第 4 次腹板（白色和黑色箭头分别的）圆形瓣状结构。 （D）一个成年女性的腹面观。 （D'）D的脑后部对于所有面板的放大图，比例尺表明1毫米。有关详细信息，请参阅翔等人。 2015年53。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：注入期间女性。雌性麻醉并置于腹侧。针进入第二和第三腹板注入双链RNA之间的segmacoria所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：DMAC珠三角 pRNAi后代表的表型。 （A）控制注入。一个孵化野生型样GFP pRNAi后代有三个胸节和十个腹节的侧面观。每一段都有刚毛和色素条纹。 （B）中的阴影珠三角 pRNAi后代横向视图。标邻近色素条纹之间的差距缩小或完全缺失。一个未孵化的控制野生型状的胚胎（C）型角质层。一个未孵化的珠三角 pRNAi后代更少的腹节的（D）型角质层。 （E，F）从解剖germband：（E）控制，GFP pRNAi已经均匀地涂抹在每一个环节恩表示，（F） 珠三角 pRNAi，恩表达在交替段（星号）减少。对于所有窗格LS，规模横道500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
虽然在20 世纪期间，开发了先进的模型系统（老鼠，苍蝇，蠕虫）的一小部分，21 世纪已经出现在世界各地的实验室正在开发新的动物系统的浪潮。这些新系统让科学家来解决不能只使用“标准”模式的系统可以探测比较，进化的问题。新车型这一部署要求，为培养实验室，基因鉴定，并在新种功能的方法方法的快速发展。这里，分别提出了在实验室和一步一步协议胚胎的RNAi，父母的RNAi，并且在此甲虫表型分析饲养D.斑程序。我们的目标是，这些描述鼓励其他人使用D.在斑自己的实验，并利用这里介绍的方法来开发更多的新车型品种。
虽然D.斑升AB菌落非常容易维护，养殖该种类的一个限制是给甲虫作为食物来源的湿猫粮的难闻的气味。为了避免这种情况，可替代的食物，如乳清/大豆蛋白粉，奶酪，地面狗食和奶粉，用或不用湿棉测试，以改变湿度。地面狗食是最有效的替代，可用于常规菌落喂养。生存是优秀的（> 90％），从卵到成虫在80％的相对湿度饲养刚干狗粮，加或不加湿棉笼。然而，收集了大量的鸡蛋时，鸡蛋收集来提高繁殖力时用湿猫食补充这种饮食可能是必要的。如果使用狗粮，老的食物应定期删除，因为空调的狗食被发现抑制产蛋54。狗食粗磨（KR，初步结果），软木，木材，纸张和其他材料也可以用作避难所71。有趣的是，使用保丽龙粉虫甲虫幼虫的生物降解已有报道72。因此，这是为D.斑幼虫测试。年轻D.斑幼虫存活直到只有泡沫塑料或含石棉材料和湿棉成年（数据未显示），但他们是否吃和消化这些材料仍有待确定。
这份报告是在四纹豆象开展功能基因研究的第一个详细的协议。使用的RNAi这里表示这种技术的一个新的模型系统的扩展。一些具体意见是值得相对于D.斑和其他非模式生物RNAi抑制实验中指出。第一，保证的RNAi将有效地D.斑 ，这里使用的，应采用四斑的相同菌株。有证据表明，从赤拟谷盗不同菌株表现出的RNAi p变化henotypes 24,73和突变表型常表现在遗传背景模型种74-76的依赖。此外，还有在其他协议应变依赖性，包括在原位杂交轶事证据。第二，喷射的适当的时刻是在D斑成功的RNAi的关键。有点直觉相反，经过角质层完全硬化的，羽化后至少两天segmacoria最容易侵入。因此，处女女4 - 羽化后8天应使用。老年女性比体验新eclosed女性繁殖力较低，因此不适合注入。第三，注射的dsRNA可以得到由阴腹部的内压压出。为了尽量减少注射后失去了大量的dsRNA的可能性，保持针在腹部注射后〜5秒，然后缓慢取出（6.2.8）。同时，避免在短期内或压制女性的腹部注射后。为了规避由此造成的偏颇结果，注入女性至少有8对每个向双链RNA（每日〜200胚）得到足够的后代的表型分析。四，高产蛋量是注射后提供公正数据的表型分析非常重要。平均每个D.斑的女性每天产生大约35-55胚胎。产蛋量取决于人口规模，女年龄，湿度，食物供应，温度（数据未显示），以及其他环境因素54。通常情况下，女性躺在更在30℃高于25℃。五，未孵化的胚胎可以通过孵幼虫被蚕食。由于孵幼虫通常是野生型状或仅轻度影响，而胚胎未孵化通常更严重的影响，这种习惯D.纹豆象幼虫可引起定量表型分析偏差结果。因此，强烈建议尽早切除孵仔鱼。
我们的实验室一直专注于D.斑分割，虽然在许多方面这个物种，包括生理学，生态学，病虫害防治，是极大的兴趣。为了研究胚胎发育和分割，一系列关于D.纹豆象幼虫的背侧重水复疑无路色素条纹可以作为发育异常的自然标记。此外，根上幼虫的色素条纹特性的刚毛可以用作段的指示。这些形态特征，同时与轻度或中度影响胚胎可以存活孵化的发现，是D.斑模型的优势，学习与之相关的图案基本体计划的机制。
最后，进行高度控制的实验，包括阴性对照，如绿色荧光蛋白的dsRNA和每个测试两个非重叠的目标区域的重要性基因是至关重要的，以避免误解由于短跑运动员注射本身的TS和脱靶效应。为D.斑 ，4 - 6微克（2微升的2或3微克/微升）的dsRNA注射到每只雌性和所述dsRNA为200-250碱基对长。量和协议的其他细节，可能需要如靶向基因后面的发展或在不同的生理/代谢过程起作用进行优化。以前的发现表明，RNA干扰效果可以超越F1代线虫 15转嫁到后代。 D.孵出幼虫斑与因RNA干扰分割的缺陷少数可存活至成年，可以重现。初步实验未能揭示在F2代明显缺陷。未来的研究可以揭示该物种的RNAi的跨代的影响。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
- Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
- Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
- van Roessel, P., Brand, A. H.
- Grishok, A.
- Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
- Hannon, G. J.
- Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
- Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M.
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
- Whitten, M. M., et al.
- Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
- Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
- Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
- Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
- Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
- Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
- Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
- Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
- Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
- Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
- Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
- Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
- Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
- Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
- Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
- Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
- Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
- Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
- Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
- Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
- Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
- Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
- Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
- Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
- Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
- Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
- Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
- Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
- Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
- Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
- Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
- Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
- Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
- Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
- Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
- Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
- Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
- Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
- Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
- Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
- Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
- Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
- Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
- Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
- Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
- Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).
