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Genetics

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Introduction

1998 berichtete Fire and Mello , daß doppelsträngige RNA (dsRNA) Hemmung der Genfunktion in Caenorhabditis elegans 1 induzieren kann. Diese Antwort , ausgelöst durch dsRNA wurde RNA - Interferenz (RNAi) genannt, und solche RNAi-vermittelte Gen - Silencing wurde berichtet , in Tieren, Pflanzen konserviert zu sein, und Pilze 2-7. In Pflanzen und einige Tiere, systemisch RNAi - Funktionen, was bedeutet , dass der Effekt auf andere Zellen / Gewebe ausbreiten , wo wird dsRNA nicht direkt eingeführt ( zusammengefasst in 8-10). Wissenschaftler haben von dieser endogenen zellulären RNAi - Antwort von dsRNAs Gestaltung Gene von Interesse zu zielen, wodurch Klopfen nach unten Genfunktion , ohne direkt die Manipulation des Genoms ( zusammengefasst in 11-14) gemacht.

RNAi ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle Studien aufgrund der folgenden Vorteile. Erstens, selbst bei minimaler Gensequenz Informationen kann ein Gen gezielt RNAi verwendet. Dies ist besonders wichtig für studies von Nicht-Modellorganismen genomischen oder Transkriptom-Daten fehlen. Zweitens in Organismen, die RNAi-Antwort robust systemisch ist, kann RNAi-vermittelte Knock-Down bei fast jedem beliebigen Entwicklungsstadium durchgeführt werden. Diese Funktion ist sehr nützlich, um die Funktion von pleiotropen Gene zu studieren. Drittens, in einigen Fällen spreizen RNAi - Effekte auf die Gonaden und Nachkommen, so dass Phänotypen in Nachkommen 15,16 beobachtet werden. Dieses Phänomen, bekannt als elterliche RNAi (pRNAi), ist besonders vorteilhaft für Gene Embryonalentwicklung beeinflussen, zahlreiche Nachkommen von einem einzigen injiziert Mutter hergestellt ohne direkte Manipulation von Eiern untersucht werden. Aus diesen Gründen ist pRNAi die Methode der Wahl. Wenn jedoch pRNAi unwirksam ist, beispielsweise für die Gene für Oogenese erforderlich, dann embryonale RNAi (eRNAi) verwendet werden. Viertens kann RNAi verwendet werden, um das Äquivalent einer allelischen Serie, dass zur Erzeugung der Menge an dsRNA geliefert über einen Bereich variiert werden kann schwach bis stark Defekte zu produzieren. Eine solche Abstufung von Phänotypen können für das Verständnis der Genfunktion hilfreich sein, wenn das Gen in einem komplexen Prozess und / oder vollständigen Verlust der Funktion beteiligt ist, ist letal. Fünftens Lieferung von dsRNA ist in der Regel einfach und machbar, vor allem bei Tieren robusten Reaktionen systemischen RNAi zeigt. dsRNA kann durch Mikroinjektion 1,5, Fütterung / Aufnahme 17,18, Einweichen, 19,20 und Viren / Bakterien-vermittelte Abgabe 21,22 eingeführt werden. Sechstens, im Gegensatz zu einigen Gen-Targeting / Bearbeitungsmethoden, gibt es keine Notwendigkeit für Organismen tragen die Mutation zu screenen oder genetische Kreuzungen durchzuführen Homozygoten zu erzeugen, wenn RNAi verwendet wird. Daher kann im Vergleich zu vielen anderen Techniken zur Untersuchung der Genfunktion ist RNAi schnell, kostengünstig und kann für großflächige Bildschirme 23-25 aufgebracht werden.

Die breite Anwendung von RNAi stellt Mittel bereit, funktionelle Studien in einem breiten Spektrum von Organismen durchzuführen, um den Bereich der Arten für das Studium zur Verfügung expandierenden beyond die traditionellen Modellsysteme für die genetische Werkzeuge entwickelt worden. Zum Beispiel können nicht-Modellsysteme Studien mit benötigt Einblicke in die Evolution von Genen und Gen - Netzwerken zu geben , indem die Funktionen von Orthologen von Spezies zu vergleichen , die unterschiedliche Entwicklung Modi oder ausstellenden verschiedene morphologische Merkmale 26-29. Diese Art von Studien wird ein besseres Verständnis der biologischen Vielfalt zur Verfügung stellen, mit Auswirkungen sowohl für angewandte und Grundlagenforschung.

Als die größte Tiergruppe auf dem Planeten, Insekten bieten eine große Chance, die zugrunde liegenden Mechanismen Vielfalt zu erkunden. Darüber hinaus sind Insekten im Allgemeinen klein, haben kurze Lebenszyklen, hohe Fruchtbarkeit und sind leicht nach hinten im Labor. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich RNAi erfolgreich bei Insekten Spanning Aufträge angewendet worden, einschließlich Diptera (Zweiflügler) 5, Lepidoptera (Schmetterlinge und Motten) 30, Coleoptera (Käfer) 16,31, Hautflügler (SAWFLügen, Wespen, Ameisen und Bienen) 32, Hemiptera (true Bugs), Isoptera (Termiten) 34, Blattodea (Schaben) 35, Orthoptera (Grillen, Heuschrecken, Heuschrecken und katydids) 36 und Phthiraptera (Läuse) 37. Die erfolgreiche Anwendung von RNAi hat sich für die Untersuchung der Musterung in der frühen Embryonalentwicklung (anterior-posteriore Achse 32, dorsalen-ventralen Achse 28, Segmentierung 26,38) funktionelle Daten zur Verfügung gestellt, die Geschlechtsbestimmung 39,40, Chitin / Kutikula Biosynthese 41, Ecdyson 42 signalisiert, Sozialverhalten 43 und mehr. RNAi Methoden für verschiedene Insektenarten entwickelt werden , können von zusätzlichen Vorteil sein, dass sie geeignet sind , für die Schädlingsbekämpfung , nützlich zu sein ( zusammengefasst in 44-46). RNAi-Effekte werden genspezifische sowie artspezifischen, solange nicht konservierten Regionen für die Ausrichtung gewählt. Für nützlichen Insektenarten wie Honigbienen und Seidenwürmer, Gene von entscheidender Bedeutung für das Überleben der TargetingViren oder Parasiten - Infektion zu kontrollieren kann eine neue Strategie bieten diese Spezies 47,48 zu schützen.

Dermestes maculatus (D. maculatus), gebräuchliche Bezeichnung verbergen Käfer, ist weltweit mit Ausnahme der Antarktis verteilt. Als holometabolous Insekt umfasst das D. maculatus Lebenszyklus embryonale, Larven, Puppen und adulten Stadien (Abbildung 1). Weil es auf Fleisch ernährt, ist D. maculatus in Museen verwendet tote Tiere zu skeletonize und forensische Entomologen können es verwenden Zeitpunkt des Todes 49,50 abzuschätzen. D. maculatus ernährt sich von tierischen Erzeugnissen einschließlich Kadaver, getrocknetes Fleisch, Käse, und die Puppen / Kokons von anderen Insekten und somit verursacht Schäden an Haushalte, Vorrats und die Seide, Käse und Fleischindustrie 51,52. RNAi in diesem Käfer Anwendung könnte eine effiziente und umweltfreundliche Art und Weise zur Verfügung stellen ihre wirtschaftlichen Auswirkungen zu minimieren. Unser Labor hat D. maculatus als neues m verwendetodel Insekt zu studieren Segmentierung 53. Neben den Lab - Aufzucht zugänglich ist, ist D. maculatus von Interesse für die Grundlagenforschung , wie es ein Zwischenkeim - Entwickler ist es eine nützliche Art den Übergang zwischen kurz- und langfrisKeim Entwicklung zu studieren.

Abbildung 1
Abbildung 1: Lebenszyklus von D. maculatus. Fotografien von D. maculatus in verschiedenen Lebensphasen, wie angegeben. Der Lebenszyklus vom Ei bis zum erwachsenen dauert drei Wochen bei 30 ° C, jedoch bei niedrigeren Temperaturen länger. (A, F) frisch gelegten Embryonen sind weiß bis hellgelb und oval, etwa 1,5 mm in der Länge. Embryonalentwicklung dauert ca. 55 Stunden bei 30 ° C. (B, C und G) Larven haben dunkle pigmentierte Streifen und sind mit Setae bedeckt. gehen Larvae durch mehrere instars abhängig von der Umgebung und deren Länge bis über 1 cm verlängern kann. (D, H) (E, I) Kurz nach dem Schlüpfen, erscheint dunkle Pigmentierung über die erwachsenen Käfer Körper. Erwachsene können bis zu mehrere Monate leben und eine Frau Hunderte von Embryonen über ihr Leben legen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bisher haben wir gezeigt , dass RNAi in Klopfen nach unten Genfunktion in D. wirksam ist maculatus 53. Hier unsere Erfahrung Aufzucht D. maculatus Kolonien im Labor wird zusammen mit Schritt- für -Schritt - Protokolle geteilt sowohl für die embryonale und die elterliche RNAi Set-up, Injektion, Nacheinspritzung Pflege und phänotypische Analyse. Die dsRNA-vermittelte Knock-Down und Analyseverfahren hier eingeführt nicht nur detaillierte Informationen zu Fragen in D. maculatus Adressierung, sondern auch potenzielle Bedeutung haben for RNAi in anderen nicht-Modell Käfer / Insektenarten anwenden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

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