Summary
여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.
Introduction
1998 년 화재와 멜로는 이중 가닥 RNA (dsRNA를이) 예쁜 꼬마 선충 1 유전자 기능의 억제를 유도 할 수 있다고보고했다. dsRNA에 의해 유발이 반응은 RNA 간섭 (RNAi의) 명명하고, 이러한 RNAi를 매개 된 유전자 사일런 싱은 동물, 식물, 균류 및 2-7에서 보존되는 것으로보고되었다. 일부 식물 및 동물에서의 RNAi 기능 전신적 의미 효과 (8-10에서 검토) dsRNA를 직접 도입되지 않은 다른 세포 / 조직으로 확산 될 수있다. 과학자하여 직접 (11-14에서 검토) 게놈을 조작없이 유전자 기능을 쓰러 뜨린, 관심의 유전자를 대상으로 dsRNA에를 설계하여이 내생 세포의 RNAi 응답의 사용을 만들었습니다.
RNAi의는 다음과 같은 장점으로 인해 기능 연구를위한 강력한 도구입니다. 먼저도 최소한의 유전자 서열 정보하는 유전자의 RNAi를 사용하여 타겟팅 될 수있다. 이 일에 특히 중요하다게놈 또는 transcriptomic 데이터가없는 비 모델 생물의 udies. 둘째, RNAi의 응답이 견고 전신 인 유기체에서 RNAi를 매개하는 유전자 녹다운 거의 모든 발육 단계에서 수행 될 수있다. 이 기능은다면 발현 유전자의 기능을 연구하는데 매우 유용하다. 셋째, 어떤 경우에는, RNAi의 효과 표현형 자손 15,16 관찰되도록 상기 생식선 및 자손에 퍼졌다. 단일 주입 부모에 의해 생성 된 수많은 자손 계란을 직접 조작하지 않고 검사 할 수있는 부모의 RNAi (pRNAi)로 알려진이 현상은,,, 배아 발달에 영향을 미치는 유전자에 특히 유리하다. 이러한 이유로, pRNAi는 선택의 방법입니다. pRNAi 비효율적 인 경우, oogenesis 필요한 유전자, 예를 들어 다음의 RNAi 배아 (eRNAi)이 사용되어야한다. 넷째, RNAi의 강력한 결함 약한 생산하는 dsRNA의 양은 범위에 걸쳐 변화 될 수있는 전달하는 대립 시리즈의 등가를 생성하는데 사용될 수있다. 표현형 그러한 계조 유전자가 치명적인 복잡한 프로세스 및 / 또는 기능을 완전히 상실 포함될 때 유전자 기능을 이해하는데 도움이 될 수있다. 다섯째, dsRNA를 전달 특히 강력한 조직의 RNAi 반응을 나타내는 동물, 일반적으로 쉽게 가능하다. dsRNA를이 미세 주입 1,5, 공급 / 섭취 17, 18, 침지, 19, 20 및 바이러스 / 박테리아 매개 배달 (21, 22)에 의해 도입 될 수있다. 여섯째, 일부 유전자 타겟팅 / 편집 방법과 달리, 돌연변이를 운반 생물을 선별하거나 RNAi의 사용시 동형 접합체를 생성하기 위해 유전 교배를 실시 할 필요가 없다. 따라서, 유전자 기능을 연구하기위한 다양한 다른 기술에 비해 저렴 RNAi를 빠르게하고, 대형 화면 (23-25)에 적용될 수있다.
의 RNAi의 다양한 유틸리티 beyon 연구 가능한 종의 범위를 확대하고, 생물의 광범위한 기능적 연구를 수행하는 방법을 제공한다유전 적 도구가 개발되어있는 기존의 모델 시스템 거라고. 예를 들어, 비 - 모델 시스템을 사용하여 연구가 다른 개발 모드를 표시하거나 별개의 형태 적 특징 26-29을 나타내는 종 orthologs의 기능을 비교하여 유전자 및 유전자 네트워크의 발전에 대한 통찰력을 제공해야한다. 연구 이러한 유형의 응용 및 기본적인 두 연구의 영향이 생물학적 다양성의 더 나은 이해를 제공 할 것이다.
지구상에서 가장 큰 동물 그룹이기 때문에, 곤충 메커니즘을 기본 다양성을 탐험 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 또한, 곤충은 일반적으로 작고 짧은 수명주기, 높은 생산력을 가지고 있고, 실험실에서 뒤쪽으로 쉽습니다. 지난 20 년에, RNAi의 성공적 파리목 (사실 파리) 5, 나비목 (나비와 나방) (30)를 포함하여 주문에 걸쳐 곤충 적용되어, 딱정벌레 목 (딱정벌레) 16,31, 벌목 (sawf거짓말, 말벌, 개미와 꿀벌) (32), 매미목 (사실 버그), Isoptera (흰개미) (34), Blattodea (바퀴벌레) (35), 메뚜기 (귀뚜라미, 메뚜기, 메뚜기, 그리고 katydids) 36 Phthiraptera (이가) 37. RNAi를 성공적으로 응용 프로그램, 에크 디손 (42) 신호, 초기 배아에서 패턴의 연구 기능 데이터 (전후방 축 (32), 지느러미 - 복부 축 (28), 세그멘테이션 26,38), 성별 결정 39, 40, 키틴 / 표피의 생합성 (41)를 제공하고있다 사회적 행동 (43), 그리고 더. 다른 곤충 종 개발의 RNAi 방법은 (44-46 검토) 방제에 유용 할 가능성이 있다는 점에서 추가적인 이점이 될 수있다. RNAi의 효과는 비 보존 지역을 타겟팅 선택되는만큼, 유전자 특이뿐만 아니라 종 특이 할 것이다. 의 생존을위한 필수적인 유전자를 대상으로 꿀벌과 누에와 같은 유익한 곤충 종에 대한감염을 제어하는 바이러스 또는 기생충이 종 (47, 48)을 보호하기위한 새로운 전략을 제공 할 수있다.
Dermestes maculatus (D. maculatus), 일반 이름 숨기기 딱정벌레, 남극 대륙을 제외하고 전 세계적으로 배포됩니다. holometabolous 곤충으로, D. maculatus 수명주기는 배아, 애벌레, 번데기 및 성인 단계 (그림 1)을 포함한다. 그것은 육체에 공급하기 때문에, D. maculatus는 죽은 동물을 해골로하는 박물관으로 사용되며, 법의학 곤충 학자 죽음 49,50의 시간을 예상하는 데 사용할 수 있습니다. D. maculatus는 시체, 말린 고기, 치즈, 그리고 번데기 / 다른 곤충의 고치를 포함한 동물 제품을 공급함으로써 가정의 손상, 저장 음식, 그리고 실크, 치즈, 육류 산업 51,52됩니다. 이 딱정벌레에서의 RNAi를 적용하면 경제에 미치는 영향을 최소화하기 위해 효율적이고 환경 친화적 인 방법을 제공 할 수있다. 우리 연구소는 새로운 m로 D. maculatus을 사용하고있다ODEL 곤충 세그먼트 (53)를 연구한다. 그것은 단기 및 장기 생식 개발 사이의 전환을 공부하고 그것에게 유용한 종을, 중간 - 생식 개발자로 실험실 양육 의무가있을뿐 아니라, D. maculatus는 기초 연구에 대한 관심이다.
그림 1 : D. maculatus의 수명주기. 나타낸 바와 같이, 서로 다른 삶의 단계에서 D. maculatus의 사진. 성인에 계란에서 라이프 사이클은 낮은 온도에서 세 30 ° C에서 주하지만 더 오래 걸립니다. (A, F) 갓 배치 배아의 길이는 약 1.5 mm, 밝은 노란색 타원형에 흰색입니다. 배아는 ~ 30 ° C에서 55 시간이 걸립니다. (B, C와 G) 애벌레 어두운 색소 줄무늬가 있고 강모로 덮여있다. 애벌레는 1 이상 cm까지 확장 할 수있는 환경과 길이에 따라 여러 령충을 통해 이동합니다. (D, H) (E, I)는, 어두운 색소 침착은 성인 딱정벌레 몸에 나타납니다. 성인은 몇 개월까지 살 수있는 한 여성은 그녀의 일생을 통해 배아의 수백을 배치 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이전에, 우리는 RNAi의는 D. maculatus (53)에 유전자 기능을 쓰러 뜨린에 효과가 있음을 보여 주었다. 다음은 실험실에서 D. maculatus 식민지를 양육 경험은 배아와 부모 모두 RNAi의 설정, 사출, 포스트 분사 관리 및 표현형 분석을위한 단계별 프로토콜과 함께 공유됩니다. 여기에 소개 된 dsRNA를 매개 유전자 최저 및 분석 방법 D. maculatus에 문제를 해결에 대한 자세한 정보를 제공 할뿐만 아니라, FO 잠재적 인 의미가 아니라R 아닌 다른 모델 딱정벌레 / 곤충 종의 RNAi를 적용.
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Protocol
D. maculatus 1. 부양
참고 : D. maculatus의 번식 식민지는 성인을 사용하여 저자의 실험실에서 설정하고 유충은 상업적으로 구입했다. 종 ID는 DNA 바 코딩 (53)을 이용하여 확인 하였다.
- 실험실에서 새 케이지를 설정하려면, 중간 크기의 곤충 케이지 (30.5 X 19 X 20.3 cm 3)에 나무 부스러기의 얇은 층을 확산. 번데기에 대한 애벌레 숨기기 수 있도록 케이지에 스티로폼의 ~ 10 × 6 × 3cm 3 덩어리를 놓습니다. (50) 딱정벌레 (성인이나 늦은 령 유충 중) - (20)를 추가합니다. 딱정벌레는 나무 부스러기에 숨어 있습니다.
- 페트리 접시 또는 무게 보트에 젖은 고양이 음식을 추가합니다. 메쉬 천으로 케이지를 덮고 인큐베이터에 케이지를 놓습니다.
- 실험실에서 사육 식민지를 유지, 25 및 30 °의 C 사이의 온도를 설정합니다. D. maculatus 빠르게 고온에서 성장하지만, 이것은 또한 곰팡이 및 진드기의 성장을 촉진한다. 치유를 유지하기 위해빠르게 식민지를 확장하기위한 정기적 인 재고 유지 보수 및 30 ° C, 28 ° C - 네 식민지, 25을 사용합니다. 라이프 사이클은 환경 적 요인 (50) (그림 2)에 따라 사개월에 약 3 주 정도 소요됩니다.
그림 2 : D. maculatus 연구소 식민지. 일반적인 D. maculatus 곤충 케이지의 사진이 표시됩니다. 나무 부스러기는 딱정벌레 숨길 수 있도록 확산됩니다. 고양이 음식은 작은 페트리 접시 또는 무게 보트에 추가됩니다. 스티로폼은 번데기하는 최종 령 유충을위한 피난처로 케이지에 배치됩니다. 여기에 표시된 케이지는 30.5 X 19 X 20.3 cm 3이고 몇 백 애벌레, 번데기, 어른 주택. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 넓은 땅성숙 케이지에 계란을했습니다. , 식민지를 확장 위와 같이, 애벌레, 또는 성인 (제 2 절에 설명 된대로 수집) 계란 새 케이지를 설정합니다. D. maculatus 특히 음식 소스 근처 케이지에 걸쳐 알을 낳는다.
- 일주일에 두 번에 대해 젖은 고양이 먹이를 교체합니다.
참고 : 젖은 고양이 먹이의 불쾌한 냄새에, 다른 음식 소스도 시험 하였다 인해 (토론 참조).
2. 배아 컬렉션
- 컬렉션을 설정하려면, 적어도 50 명의 남성과 식민지에서 50 명의 여성을 구분합니다. 젊은 성인은 최고입니다. 나무 부스러기가없는 미니 사이즈의 케이지 (17.8 X 10.2 X 12.7 cm 3)에 넣어 성인. 무게 보트에 고양이 먹이를 추가합니다.
- 수집을 시작하기 전에 존재하는 배아에 대해 조심스럽게 케이지를 확인하고 제거합니다. 케이지로 뻗어 목화 공을 넣고 30 ° C 배양기에서 케이지를 둡니다. 적절한 시간 창 후, 코튼 볼은 배아 수집을위한 준비가 될 것입니다.
- 겹반 검은 건설 용지 (A4 크기)의 조각은 주름을 만든 다음 전개합니다.
- 케이지에서 뻗어 목화 공을 제거합니다. 면화 공에서 성인을 제거하고 케이지에 다시 넣어.
- 아주 부드럽게 뻗어 목화 공을 곤란하게하는 동안, 계란은 검은 종이에 떨어질 수 있도록 얇은면 섬유로 떨어져 천천히 눈물.
주 : D. maculatus 배아는면에서 볼 깨지기 어렵다. 너무 단단히면 공을 들고 한 경우에는 쉽게 분쇄 할 수있다.
3. dsRNA를 준비
- dsRNA를 합성하기위한 DNA 템플릿 준비
- 4 실행 - 모두 5에서 T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 6 내지 50 ㎕의 PCR 반응을 '제조사의 프로토콜에 따라 DNA 템플릿 증폭 종료한다.
- 제조자의 지시에 따라 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. DNA 템플릿의 이상적인 최종 농도는 ≥입니다100 NG / μL.
- 사출 버퍼 준비
- 주입 완충액 100㎖를 준비 (0.1 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 5 mM의 KCl을). 5 M NaOH로 6.8으로 산도를 조정합니다.
- -20 ° C에서 보관 씩.
- dsRNA를 합성
- ~ 반응 당 500 ng의 템플릿을 사용하여, 얼음에 0.2 ㎖의 PCR 튜브의 반응을 설정하고 제조업체의 지침에 따라 T7 중합 효소와 시험 관내 전사 반응을 수행한다.
- 하룻밤 37 ° C에서 튜브를 품어.
- 제조업체의 지침에 따라 DNase를 가진 DNA 템플릿을 소화.
- 94 ° C에 튜브를 가열하고 3 분 동안 94 ° C에서 개최합니다.
- 그것은 1 시간 후 45 ° C에 도달 할 때까지의 dsRNA를 어닐링, 천천히 1 ° C / 분으로 튜브를 냉각.
참고 : 3.3.5 통해 3.3.2은 열 순환기 수행 할 수 있습니다 단계. - dsRNA에의 침전물을 에탄올 280 μl를 추가반응의 RNase 무료로 물 20 μL 300 μL의 최종 볼륨을 조절합니다. 3 M의 NaOAc (산도 5.2) 및 에탄올 650 μL의 30 μl를 추가합니다. 하룻밤 -20 ° C 냉장고에 튜브를 놓습니다.
- 39 ° C에서 30 분 동안 15,682 × g으로 원심 분리 후, 70 % 에탄올과 dsRNA에 펠렛을 세척 하였다. 건조 펠릿은 사출 μL 버퍼 (20)에 녹인다.
- 260에서 분광 광도계를 사용하는 dsRNA의 농도를 측정한다. 5 μg의 / μL - 이상적인 농도는 3입니다. 30 분 동안 90 V에서 1 % 아가 로스 젤에 dsRNA에의 1시 25분 희석의 5 μl를 실행하여 품질을 확인합니다. 예상 크기의 단일 밴드는 쉽게 볼 수 있습니다.
- -20 ° C 또는 추워에서 dsRNA를 저장합니다.
주 : 매의 RNAi 녹다운 실험을 위해, 연구되는 방법에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않을 것이다 제어하는 dsRNA를 포함한다. GFP dsRNA를 대부분의 실험을위한 훌륭한 컨트롤입니다. 준비하고 experime으로 제어하는 dsRNA를 나란히 주입ntal dsRNA를.
마이크로 인젝터 및 미세 조작기 4. 조립
주 : 그림 3을 참조하십시오.
- 공기 펌프 기기의 압력 입력에 질소 또는 다른 공기 공급 장치를 연결합니다. 공기 펌프를 사용할 수없는 경우, 미세 튜브에 접속 된 50 ㎖ 주사기를 사용하여 압력을 적용한다.
- 배출 압력의 흐름을 제어하는 펌프의 원격 커넥터 풋 스위치를 연결한다.
- 튜브 펌프의 배출 압력 포트에 유리 모세관 홀더를 연결합니다.
- 해부 현미경에 가까운 미세 조작기에 모세관 홀더를 고정합니다.
5. 배아의 RNAi
참고 :도 4는 D. maculatus 배아의 RNAi의 흐름도를 도시한다.
- eRNAi 준비
- 페트리 접시 뚜껑 (90mm 직경) 수집 배아를 준비합니다. C 검정 여과지를 놓고뚜껑의 내부 위에. 검은 종이에 표준 현미경 슬라이드를 넣습니다.
- 주입 버퍼가 적절한 농도에 dsRNA를 희석. 초기 실험 3 μg의 / μL - 2를 사용합니다. 항상 이전에 주입 얼음에 dsRNA를 유지합니다.
- 잘 혼합하는 dsRNA를 피펫 부드럽게 여러 번에 1시 40분 희석에 식용 색소를 추가합니다.
- 주입을위한 수집 배아
참고 : 25 ° C에서, 배아 (6)의 핵 - 8 시간은 계란이 누워 후 (AEL) (53) 주변 계란을 향해 이동한다. 10 시간의 AEL (53) - 셀룰러 배반 엽 8 내에서 설정됩니다. 3 시간의 AEL 배아 사용 53 권장합니다 - 보장하기 위해 세포 배반 엽 단계 이전의 배아는 0, 주입에 사용됩니다. 유리 모세 혈관이 건강한 상태에있는 경우 배아 수집, 준비, 주입은 보통보다 2 시간이 걸릴. 따라서, 전체 프로세스는 5 시간의 AEL 내에 완료 될 수있다.- 단계에 설명 된대로 배아를 수집 2.2-2.5.
- 페트리 접시의 뚜껑을 수집로 배아를 전송하는 검은 건설 용지를 누릅니다.
- 슬라이드의 가장자리를 따라 양면 테이프를 스틱.
- 페인트 브러시를 사용하여 가장자리에서 전방 또는 후방 단부와 슬라이드 에지에 수직 테이프 배아 정렬. 평균의 절반이 이상적입니다 후방 끝 부분에 주입 될 것입니다 때문에에, 초기 배아의 앞쪽과 뒤쪽 끝이 쉽게 구별되지 않습니다.
- 글래스 모세관에 dsRNA를로드
- 20 μL microloader 피펫 팁으로 dsRNA를 4 μL - 2를 차지합니다.
- 미리 인출 된 유리 모세관으로 팁을 삽입 (바늘이라고 함)과 부드럽게 모세관으로의 dsRNA 용액을 피펫. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 상업용 유리 모세관에서 바늘을 준비합니다. 이상적인 뽑아 바늘의 일례는도 5에 도시되어있다. 길이와 바늘의 테이퍼 AF 최적화 될 필요가있다터 주입 시험.
- 유리 모세관 홀더에 유리 모세관을 수정합니다.
- 미세 조작기에 모세관 홀더를 조립합니다.
- 태아에 dsRNA를 주입
- 조심스럽게 해부 현미경의 무대에 배아와 슬라이드를 전송합니다.
- 필드 초점 현미경의 중심에 하나의 배아를 가지고 슬라이드를 이동합니다.
- 해부 현미경으로 보면서 미세 조작기와 모세관의 끝을 놓습니다. 행의 첫 번째 배의 단부 부근에 팁을 준비한다.
- 질소 또는 다른 공기 공급에 전환합니다.
- 진공에 전자 입력 셀렉터 스위치를 설정합니다.
- 15 PSI - 10 꺼내기 압력 조절기를 조정합니다. 장치에 따라 압력을 조절합니다.
- 필요한 경우 모세관을 엽니 다. 선단이 개방되면, 착색 된 dsRNA 용액 팁을 채울 것이다.
- 전자에 구멍을 앞으로 모세관 팁을 이동mbryo. 압력 설정 이상적인 경우에는 배아 유체는 모세관에 유입 않는다.
- 용액의 적당량을 꺼낼 때까지의 dsRNA에 배아 용액을 토출하는 풋 스위치 단계. 솔루션의 적절하고 부적절한 양이 주입 된 후 그림 5는 배아 형태의 예를 보여줍니다.
- ~ 2 초 동안 배아 내부의 모세관 팁을 유지하고 다음을 제거합니다.
- 다음 배아에 모세관을 이동하고를 반복 5.4.8 단계 - 모든 배아가 주입 될 때까지 5.4.10을. 이 막히거나 중단되는 경우 유리 모세관을 변경합니다.
- 포스트 분사 복구 및 배양
- 주입 후, 페트리 접시에서 슬라이드를 배치합니다.
- 페트리 접시에 젖은 솜을 추가합니다. 코튼 볼 슬라이드 접촉하지 마십시오.
- 페트리 접시를 덮고 필름을 밀봉으로 포장. 주입의 dsRNA를, 농도, 날짜, 시간 및 숫자의 이름으로 접시 레이블배아.
- 배아 부화 할 때까지 30 ° C를 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다.
6. 부모의 RNAi
- pRNAi에 대한 번데기를 분리
- 식민지에서 번데기를 수집합니다.
- 정렬 남성과 현미경 여성 번데기 (그림 6 참조). 어떤 상대가 주입 이전에 발생하지 않도록 30 ° C를 인큐베이터에있는 두 개의 배양 접시에 보관하십시오.
- eclosed 성인 매일 확인합니다. 30 ° C에서 칠일 - 번데기는 일반적으로 5합니다.
- 전송 eclosed 남성과 여성은 두 개의 배양 접시에 (그림 6 참조)가 주입을위한 준비가 될 때까지 매일 그들에게 고양이 먹이를 공급.
- 충분히 여성과 적절한 나이에 남자가 한 번 주입으로 진행합니다. 후 우화 여성 4 ~ 8 일 최고입니다. 일반적인 분석을 위해, 8-12 여성이 사용된다. 남성의 동일한 수의 54 짝짓기 필요합니다.
- 얼음 (5.1.2과 5.1.3)에 dsRNA를 준비.
- 10 μL 주사기에 32 게이지 바늘을 연결합니다.
- CO 2 단계에서 여성을 마취.
- 어떤 공기를 차지하지 않고 주사기로 dsRNA에 솔루션을로드합니다.
- 한 손으로 여성의 복부 측면을 잡고 다른 손으로 주사기를 개최합니다.
- 부드럽게 바늘 끝 sternites 2와 3 사이의 segmacoria (막)을 관통. 그림 7은 주입하는 동안 여성을 보여줍니다. 바늘이 쉽게 조직을 관통하지 않은 경우, 각 바늘이 상하 천천히 누른다. 몸에 바늘의 약 2mm를 넣습니다.
- 천천히 여성 당 ~ 2 μl를 주입, 플런저를 누른 상태에서 주사기의 눈금을 확인합니다.
- 주입 후, 여성의 복부에서 제거하기 전에 적어도 5 초 동안 계속 바늘을 개최합니다.
- (페트리 접시에 주입 된 암컷 이동90mm 직경) 고양이 음식을 공급.
- dsRNA에 이름, 주입 금액, 날짜, 여성의 수와 페트리 접시 레이블.
- 포스트 분사 복구 및 결합
- 30 ° C를 인큐베이터에서 배양 접시를 품어.
- 24 시간 후, 전송은 미니 케이지에 여성을 주입.
- 케이지에 uninjected 젊은 남성의 동등한 수를 추가하고 케이지 레이블을 붙입니다.
- 새장에 고양이 먹이와 무게 보트를 추가합니다.
- 짝짓기를 할 수 있도록 30 ° C를 인큐베이터에 케이지를 남겨주세요. 24 시간 후, 암컷은 알을 낳기 시작해야하며, 배아는 매일 또는 필요한 시간 간격으로 수집 할 수 있습니다.
7. 표현형 분석 후 RNAi의
참고 : 계란 (50) 부화 30 ° C, 그것은 ~ 55 시간이 걸립니다.
- eRNAi 생존 분석
- 총 플레이에 부화 유충의 수를 비교하여 부화 속도를 계산주입 된 배아의 mber. 배아 피해 또는 주입 절차에 의해 살해 될 수 있으므로 음성 대조군 주입을 포함해야합니다. 60 % - 일반 해치 비율은 30 %에서 다릅니다. 깐 계란을 먹는 부화 유충의 조심하십시오.
- pRNAi 생존 분석
참고 : 여성의 생존 능력이 RNAi의 대상이 유전자에 의해 영향을 경우, 여성 특정 dsRNA를 주입하지만 음성 대조군 dsRNA를 죽기 시작합니다. 계란 생산 달걀 누워이 영향을 경우, 여성은 부분 또는 전체 불임을 전시 할 예정이다. 음성 대조군에 비해 여성의 생존을 점수 또는 실험 및 제어 여성 (7.2.3)에 의해 마련 계란의 총 수를 비교합니다.- 단계 2.2 다음 배아 수집을 설정합니다.
- 2.5-24 시간 후, 단계 2.4 다음 배아를 수집합니다.
- 배아의 총 수를 계산.
- 90mm 페트리 접시에 배아를 전송합니다. 배아의 표적 유전자, 수집 날짜 및 번호 페트리 접시 레이블. 그들이 부화 할 때까지 30 ° C 배양기에서 배아를 품어. 깐 배아의 부화 유충 공급하기 때문에, 집게를 (토론 참조)를 사용 깐 배아에서 배양 접시 자주 별도의 부화 유충을 확인합니다.
- 배아 부화의 수를 카운트하고, 창구 비율을 계산한다.
- 부화 유충의 표피 결함 검사
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 부화 유충을 수집합니다.
- 흄 후드에서 고정 용액 1ml를 추가합니다.
- 이 솔루션은 애벌레 조직을 침투 할 때까지 최소한 4 박 °의 C에서 microcentrifuge 관 둡니다.
- 시각화, 가능한 한 튜브에서 많은 정착액을 제거합니다.
- PBST와 린스 유충은 적어도 세 번.
- PBST 최종와 P-1000 피펫 팁을 사용하여 함께 멀티 웰 유리판에 전사 유충을 넓혀 절단.
- 해부 현미경, 결함을 검사하는 집게를 사용 유충 스트레칭. 나는t는 정착액의 몸 계약 등의 결함을 검사 유충을 스트레칭하는 것이 중요합니다.
- 깐 유충의 표피 결함 검사
참고 :이 절차는 특히 부화에 생존하지 않는 배아를 들어, 초기 배아 표현형 검사에 유용합니다.- pRNAi 들어, 페트리 접시 (7.2.4)에 PBST를 추가 끝을 절단와 P-1000 피펫 팁을 사용하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 해칭 배아 옮긴다. eRNAi 들어, 현미경 슬라이드 오프 페트리 접시 (5.5.4), 브러쉬 해칭 배아로 PBST를 추가 한 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다.
- 고정 솔루션을 통해 배아를 수정하고 단계 7.3.2 다음 시각화를위한 PBST로 씻어 - 7.3.6.
- 집게를 사용하여 PBST에서 해부 현미경 껍질에서 배아를 해부.
- 다시 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (~ 각 튜브에 배아의 200 μL)에 배아를 전송합니다.
- 많은 졸을 제거최대한의 ution.
- 90 % 젖산 / 10 %의 EtOH 1 ML을 추가합니다. 적어도 하룻밤 60 ° C를 인큐베이터에서 원심 분리기 튜브를 남겨주세요.
주 : 배아 몇 일 동안 60 ° C에서 방치 될 수있다. - 배아를 탑재하기 위해, 끝이 절단와 P-1000 피펫 팁을 사용하여 현미경 슬라이드 상을 피펫.
- 수동으로 이상적인 방향으로 집게로 배아를 놓습니다.
- 커버 슬립와 배아를 덮고 DIC를 사용하여 현미경으로 시각화.
- 세포 및 분자 결함 검사
참고 :이 절차는 표피 결함이 동반되지 않은 표피 표현형 또는 치사의 근본 원인을 조사하는 데 유용합니다.- pRNAi를 들어, 적절한 개발 단계에서 면화 공에서 별도의 배아 및 배아 수집 바구니로 전송합니다. 수집 바스켓은 동일하거나 초파리 배아 수집에 사용되는 것과 유사 할 수있다.
- 하다제거 된 유리 병의 바닥에 25 ml의 플라스틱 섬광 유리 병에서 계란 바구니, 뚜껑 (약 1cm 직경) 중 원으로 잘라. 초 고화질의 원은 뚜껑 내부 직경 약 2.5 cm 메쉬 놓은 다음에 섬광 유리 병 나사와 거꾸로 사용합니다.
- 배아가 세정되면 메쉬를 용이하게 제거 할 수있는 바와 같이, 메시에 나와있는 배아를 복구하기 위해 물을 미세 원심 분리 관에 메쉬 젖어.
- eRNAi를 들어, 적절한 단계에서, 페트리 접시에 PBST를 추가합니다. 현미경 슬라이드 오프 배아를 브러시 및 배아 수집 바구니로 전송.
참고 : 고정, 현장 하이브리드, 항체 염색, 핵 염색 프로토콜에 시앙 등에서 찾을 수 있습니다. 2015 53.
- pRNAi를 들어, 적절한 개발 단계에서 면화 공에서 별도의 배아 및 배아 수집 바구니로 전송합니다. 수집 바스켓은 동일하거나 초파리 배아 수집에 사용되는 것과 유사 할 수있다.
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Representative Results
저자의 실험실은 곤충 53, 55의 분할을 조절하는 유전자의 기능 진화를 연구하는 RNAi의 기술을 사용하고있다. 모든 곤충이 분할되어 있지만, 이러한 과정을 조절하는 유전자를 곤충 방사선 26,38,56-63 동안 갈라 것으로 보인다. 초파리 유전자 스크린 바디 세그먼트 64-70의 형성을 촉진하는 책임 아홉 쌍 룰 분할 유전자 세트를 식별. 여기서, 이들 유전자 중 하나의 ortholog, 쌍 (PRD)은, D. maculatus에서 유전자 기능을 연구하기위한 RNAi에의 유용성을 문서화하는 데 사용됩니다.
이 종에서 세그먼트 형성 PRD - eRNAi 및 pRNAi 각 DMAC의 역할을 보여주는에 효과적이었다. 2 - PRD (도 8B, 8D 및 8 층 - dsRNA를 3 μg의 / μL는 DMAC를 대상으로 설계 (도 8a,도 8c 및도 8E로 주입 GFP dsRNA를 비교 하였다.
제어 자손 세그먼트 당 하나의 착색 된 줄무늬와 부화. 인접한 스트라이프는 착색 된 비 착색 된 갭 (도 8a)에 의해 분리 하였다. PRD pRNAi 후 영향을받는 자손 나타내는 분절 경계 (그림 8B)에 결함이 있었다 융합 이웃 착색 된 줄무늬 부화. 표현형 심각도, 하나 또는 여러 개의 융합에 따라이 영향을받는 애벌레에서 검출되었다. 그럼에도 불구하고, 융합은 지속적으로 쌍 - 규칙 등의 결함을 나타내는 T2 사이의 경계 지역 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8 나타났다. PRD 최저 후 표피의 표현형은 복부 세그먼트의 손실뿐만 아니라 단축 몸 길이 (그림 8D)을 보여 주었다. Engrailed (욕실) 항체 염색은 초기 분자 결함을 조사 하였다PRD 최저 후 배아. 제어 배아는 모든 세그먼트 (그림 8E)에서 동일한 강도로 표현하기 Ko 스트라이프 보였다 동안 감소 욕실 표현은 여성 (그림 8 층에서 별표) DMAC-PRD의 dsRNA로부터 자손에 대체 줄무늬 주입 검출되었다. 감소 욕실 발현 패턴이 영향을받는 사선 유충에서 관찰 된 결함이 표피 패턴과 일치한다. D. maculatus에서 PRD 최저 후 표현형의 자세한 결과를 시앙 등을 참조하십시오. 2015 53.
그림 3 : 사출 장치. D. maculatus 배아를 주입하는 데 사용되는 해부 현미경과 미세 조작기의 사진이 표시됩니다. 질소 공급 공기 펌프의 압력을 입력 포트에 접속된다. 유리 모세관 홀더가 접속되어 ejec펌프 t 압 포트. 풋 스위치는 펌프에 연결된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : D. maculatus 배아 RNAi를위한 순서도. 주입 배아를 수집 (AD). 여성은 목화 공 배아 (오렌지) (회색 원)을 배치합니다. 면화 공에서 분리 된 배아와 그들을 검은 건설 종이 위에 드롭 할 수 있습니다. 화이트 바는 코튼 볼에 눈물을 나타냅니다. 검은 종이로 줄 지어 수집 페트리 접시 뚜껑에 이식란. 태아로의 dsRNA를 주입 (E, F). 더블 스틱 테이프에 슬라이드에 배아를 정렬하고 해부 현미경 개별적으로 주입. 녹색 식품 염료와 바늘이 표시됩니다. (GJ) 후 주입 복구 및 incubATION. 습도를 제공하기 위해 페트리 접시에 젖은면 공을 놓습니다. 페트리 접시를 덮고 필름 (하늘색)를 밀봉으로 포장. 인큐베이터에서 배양 접시를 놓고 표현형 분석을 위해 부화 유충을 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 나쁜 배아 주입 예 대 좋은. (A) Uninjected 배아. (B) 배아 너무 작은 dsRNA를 주입. (C) 배아 dsRNA를 적당량 주사. (D) dsRNA를 과다 주입으로 인한 넘쳐 깨진 배아. 식용 색소는 시각화를위한 dsRNA를 첨가 하였다. (E) 주사 바늘로서 사용 뽑아 모세관의 예. 테이퍼 및 팁 길이 F 주또는 기능 바늘의 두 가지 예입니다. AD에 대한 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 남성과 여성의 성인과 번데기. (A) 남성 번데기의 복부보기. (A ') A. (A ") 남성 번데기 성기의 그림의 후방 부분의 확대. (B) 여성 번데기의 복부보기. (B') B. 여성 번데기의 후방 부분의 확대는 두 개의 성기 용의자가 (흰색 화살표). (B ") 여성 번데기 성기의 그림입니다. (C) 남성 성인의 복부보기. (C ') (C)의 후방 부분의 확대보기 남성 성인 삼지창 같은 것을 생식기와 참고4 번째 sternite에 원형 로브 같은 구조 (흰색과 검은 색 화살표, 각각). (D) 여성 성인의 복부보기. (D ') 모든 패널 용 D의 후방 부분의 확대보기, 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 자세한 내용은 시앙 등을 참조하십시오. 2015 53. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 사출 동안 여성. 여성은 마취와 복부 측면을 위로 배치됩니다. 2 층과 dsRNA를 주입하는 제 3 sternites 사이의 segmacoria을 관통 바늘이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : DMAC-PRD pRNAi 후 대표 표현형. (A) 제어 주입입니다. 세 흉부 세그먼트와 열 복부 세그먼트와 부화 야생형 같은 GFP pRNAi 자손의 측면보기. 각 세그먼트는 세타와 색소 줄무늬가있다. (B) 빗금 친 PRD pRNAi 자손의 측면보기. 표시 이웃 착색 된 줄무늬 사이의 간격은 좁혀 또는 완전히 누락되어있다. 깐 제어 야생형 같은 배아의 (C) 표피 표현형. 적은 복부 세그먼트와 함께 깐 PRD pRNAi 자손의 (D) 표피 표현형. (E, F)에서 germband을 해부 : (E) 제어, GFP pRNAi 균등하게 모든 부문에서 욕실을 표현하고있다, (F) PRD pRNAi, 욕실 표현은 다른 세그먼트 (별표)로 감소된다. 모든 창에 대한LS, 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
정교한 모델 시스템 (마우스, 날아 벌레)의 소수는 20 세기 동안 개발 동안, 21 세기 새로운 동물 시스템의 물결이 전 세계에 걸쳐 연구실에서 개발중인 보았다. 이 새로운 시스템은 과학자 만 '표준'모델 시스템을 사용하여 탐색 할 수 없습니다 비교, 진화의 문제를 해결 할 수 있습니다. 새로운 모델이 배포 실험실 배양, 유전자 식별 및 새로운 종의 기능적 접근 방법의 급속한 발전이 필요합니다. 여기에서, 실험실 및 배아의 RNAi, 부모의 RNAi,이 딱정벌레의 표현형 분석을위한 단계별 프로토콜에 D. maculatus를 양육하기위한 절차를 제시 하였다. 목표는 이러한 설명은 자신의 실험에서 D. maculatus을 사용하고 추가로 새로운 모델 종을 개발하기 위해 여기에 제시된 방법을 사용하기 위해 다른 사람을 격려한다는 것입니다.
D. maculatus 리터 동안AB 식민지 유지하기 매우 쉽고,이 종을 사육 중 하나 제한은 음식의 자신의 소스로 딱정벌레에 주어진 젖은 고양이 음식의 불쾌한 냄새입니다. 이 문제를 방지하려면 같은 유장 / 콩 단백질 분말, 치즈, 지상 개 식품 및 분유 등의 대체 식품, 습도를 변경하거나 젖은면없이 시험 하였다. 지상 개밥은 가장 효과적인 대안이고 정기적 인 식민지 공급에 사용할 수 있습니다. 생존에 젖은면을 첨가하지 않고, 80 %의 상대 습도에서 바로 건조 개 식품에 사육 케이지에서 성인에 계란에서 (> 90 %) 우수했다. 계란의 큰 숫자를 수집하는 경우에는, 생산력을 높이기 위해 계란을 수집 할 때 젖은 고양이 음식이 다이어트를 보충하는 것이 필요할 수있다. 개 사료를 사용하면 에어컨 개 식품이 54 누워 계란을 억제하는 것으로 확인되면서 오래된 음식은 정기적으로 제거해야합니다. 71 개 피난로서 음식의 kibbles (KR, 예비 결과), 코르크, 목재, 종이 등의 재료도 사용될 수있다.흥미롭게도, 스티로폼은 갈색 거저리 딱정벌레 애벌레를 사용하는 생분해 (72)를보고되었다. 따라서, 이는 D. maculatus 유충에 대해 시험 하였다. 젊은 D. maculatus 유충은 스티로폼이나 석면 함유 물질과 젖은 솜 성인이 될 때까지 살아 (데이터는 도시하지 않음)하지만 그들은 먹고 그 물질을 소화 여부를 판단 일이다.
이 보고서는 D. maculatus에 기능 유전자 연구를 수행하기위한 최초의 상세한 프로토콜입니다. 의 RNAi의 사용은 여기에 새로운 모델 시스템에이 기술의 확장을 나타냅니다. 몇몇 특정 관찰 D. maculatus 및 기타 비 모델 종의 RNAi 최저의 실험에 대해 주목할 가치가있다. 첫째, RNAi의는 D. maculatus, 고용해야한다 여기에 사용 D. maculatus의 동일한 균주에 효과가있을 것입니다 보장합니다. 증거는 다른 균주의 RNAi 페이지에 변화를 보여줄 것을 Tribolium의 castaneum에서있다henotypes 24,73 및 돌연변이 표현형은 종종 모델 종 74-76에서 유전 적 배경에 대한 의존도를 보여줍니다. 또한, 현장 하이브리드 포함하여 다른 프로토콜의 변형 의존성에 대한 일화적인 증거가있다. 둘째, 분사의 적절한 타이밍은 D. maculatus에서 성공의 RNAi 중요합니다. 표피가 완전히 2 일 이상 우화 후, sclerotized 후 다소 직관의 segmacoria 가장 쉽게 침투한다. 따라서, 4 처녀 여성 - 팔일 우화 후 사용해야합니다. 이전 여성 새로 eclosed 여성보다 낮은 생산력을 경험하고, 따라서 사출에 적합하지 않다. 셋째, dsRNA를이 여성 복부의 내부 압력에 의해 밀려 얻을 수 있습니다 주사 한. 주사 후 dsRNA를 대량 손실의 가능성을 최소화하기 위해, (6.2.8)를 주입 후 ~ 5 초 동안 복부에 바늘을 잡고 천천히 제거합니다. 한편,시 또는 곧 여성의 복부를 눌러 피주사 후. 각 dsRNA를이 (매일 ~ 200 배아를) 충분한 자손을 얻을 수 있도록 표현형 분석을 위해 최소 8 명의 여성을 주입,이 문제로 인해 발생 편향된 결과를 회피합니다. 넷째, 높은 계란 수율은 주사 후 표현형 분석을 위해 공정한 데이터를 제공하는 것이 중요하다. 평균적으로, 각 D. maculatus 여성은 매일 약 35-55 배아를 생성합니다. 에그 수율 인구수 여성 연령, 습도, 먹이 가능 온도 (데이터 미도시), 및 기타 환경 요소 (54)에 의존한다. 일반적으로 여성은 25 ° C 30 ° C에서 더 누워. 다섯째, 깐 배아는 부화 유충에 의해 잠식 될 수있다. 깐 배아가 일반적으로 더 심각하게 영향을받는 동안 부화 유충으로, 일반적으로 야생 형 형 또는 단지 약간의 영향을받는, D. maculatus 유충이 습관은 양적 표현형 분석에서 편향된 결과가 발생할 수 있습니다. 따라서, 가능한 한 빨리 부화 유충의 제거는 것이 좋습니다.
의 여러 측면이 종을 포함하여 생리, 생태 및 해충 큰 관심 제어를-있지만 우리 실험실은, D. maculatus 분할에 초점을 맞추고있다. 배아 및 분할을 연구, D. maculatus 애벌레의 등 쪽 어둡게 착색 된 줄무늬의 일련의 비정상적인 개발을위한 자연 마커 역할을 할 수 있습니다. 또한, 유충의 착색 줄무늬 루팅 특성 강모는 세그먼트의 표시로서 사용될 수있다. 이러한 형태 학적 특징은, 함께 약간 또는 적당히 영향을 배아가 부화에 살아남을 수있는 연구 결과로, 기본적인 몸 계획을 패터닝에 관여하는 메커니즘을 연구하는 D. maculatus 모델의 장점입니다.
마지막으로, 고도로 제어 실험을 포함한 음성 대조군 등의 GFP dsRNA를 등을 수행하고 각각의 겹치지 않는 두 타겟 영역을 검사하는 것의 중요성 때문에 effec에 오해를 방지하는 중요한 유전자는 IS-자체 주입 TS 오프 대상 효과. D. maculatus, 4 - μg의 6 dsRNA를 (2 ~ 3 μg의 / μL 2 μL)가 각 여성에 주입 및 dsRNA에 혈압 긴 200-250이었다 하였다. 금액 및 프로토콜의 기타 세부 사항은 개발 또는 다른 생리 / 대사 과정의 뒷부분에서 작동하는 유전자를 대상으로하는 경우 최적화 할 필요가있다. 이전 발견은 C.에서 F1 세대 15 엘레 간스 이상으로 RNAi의 효과를 다음 세대에 전달 될 수있는 것으로 나타났다. 의 RNAi에 의한 분할 결함이 부화 D. maculatus 유충의 소수 민족은 성인이 될 때까지 살아남을 수 재현 할 수 있습니다. 예비 실험은 F2 세대에 명백한 결함을 공개하지 못했습니다. 앞으로의 연구는이 종의 RNAi의 초세 대적 효과를 공개 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
References
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