Summary
Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.
Introduction
Nel 1998, Fuoco e Mello hanno riferito che a doppio filamento di RNA (dsRNA) può indurre inibizione della funzione del gene in Caenorhabditis elegans 1. Questa risposta innescato da dsRNA è stato chiamato interferenza dell'RNA (RNAi), e tale silenziamento genico RNAi-mediata è stato segnalato per essere conservato in animali, piante e funghi 2-7. In piante e alcuni animali, funzioni RNAi sistemica, il che significa che l'effetto può diffondersi ad altre cellule / tessuti dove dsRNA non viene introdotto direttamente (rivisto nel 8-10). Gli scienziati hanno fatto uso di questo endogena risposta RNAi cellulare progettando dsRNAs di indirizzare i geni di interesse, battendo così giù la funzione del gene senza manipolare direttamente il genoma (rivisto nel 11-14).
RNAi è un potente strumento per studi funzionali causa dei seguenti vantaggi. In primo luogo, anche con il minimo informazioni sequenza del gene, un gene può essere mirata utilizzando RNAi. Ciò è particolarmente importante per studies di organismi non-modello privi di dati genomici e trascrittomica. In secondo luogo, negli organismi dove la risposta RNAi è robusta sistemica RNAi mediata knockdown gene può essere effettuata in quasi ogni stadio di sviluppo. Questa funzione è molto utile per studiare la funzione dei geni pleiotropici. In terzo luogo, in alcuni casi, effetti RNAi diffuso ai gonadi e discendenti, in modo tale che i fenotipi si osservano nella prole 15,16. Questo fenomeno, noto come genitori RNAi (pRNAi), è particolarmente vantaggioso per i geni che influenzano lo sviluppo embrionale, come numerosa prole prodotta da un solo genitore iniettato può essere esaminato, senza manipolazione diretta di uova. Per queste ragioni, pRNAi è il metodo di scelta. Tuttavia, se pRNAi è inefficace, ad esempio per i geni necessari per la oogenesi, allora embrionale RNAi (eRNAi) deve essere utilizzato. Quarto, RNAi può essere utilizzato per generare l'equivalente di una serie allelica dal fatto che la quantità di dsRNA consegnato può essere variata su un intervallo di produrre debole per difetti forti. Tale gradazione di fenotipi può essere utile per comprendere la funzione del gene quando il gene è coinvolto in un processo complesso e / o completa perdita di funzione è letale. In quinto luogo, la consegna di dsRNA è generalmente facile e fattibile, soprattutto negli animali che mostrano solide risposte RNAi sistemiche. dsRNA può essere introdotto da microiniezione 1,5, alimentazione / ingestione 17,18, ammollo, 19,20 e il virus / batteri-mediata consegna 21,22. Sesto, a differenza di alcuni metodi di targeting / modifica dei geni, non vi è alcuna necessità di screening per gli organismi che trasportano la mutazione o di effettuare incroci genetici per generare omozigoti quando si usa RNAi. Pertanto, rispetto a molte altre tecniche per studiare la funzione del gene, RNAi è veloce, poco costoso, e può essere applicato per schermi di grandi dimensioni 23-25.
L'ampio programma di utilità di RNAi fornisce i mezzi per effettuare studi funzionali in una vasta gamma di organismi, ampliando la gamma di specie disponibili per lo studio beyond i sistemi modello tradizionali per i quali sono stati sviluppati strumenti genetici. Ad esempio, gli studi che utilizzano sistemi non-modello sono tenuti a dare intuizioni l'evoluzione dei geni e reti geniche confrontando le funzioni di ortologhi da specie che rappresentano diverse modalità di sviluppo o esporre distinte caratteristiche morfologiche 26-29. Questi tipi di studi forniranno una migliore comprensione della diversità biologica, con conseguenze per la ricerca sia applicata e di base.
Essendo il più grande gruppo di animali sul pianeta, gli insetti offrono una grande opportunità per esplorare i meccanismi alla base della diversità. Inoltre, gli insetti sono in genere piccole, hanno cicli di vita brevi, ad alta fecondità, e sono facili da dietro in laboratorio. Negli ultimi due decenni, RNAi è stato applicato con successo negli insetti che abbracciano gli ordini, tra cui Ditteri (vere mosche) 5, lepidotteri (farfalle e falene) 30, Coleotteri (coleotteri) 16,31, Imenotteri (sawfbugie, vespe, formiche e api) 32, Hemiptera (veri insetti), Isotteri (termiti) 34, Blattodea (scarafaggi) 35, ortotteri (grilli, cavallette, locuste e grilli) 36 e Phthiraptera (pidocchi) 37. Applicazione di successo di RNAi ha fornito dati funzionali per gli studi di patterning in embriogenesi precoce (asse anteriore-posteriore 32, dorso-ventrale asse 28, la segmentazione 26,38), determinazione del sesso, 39,40 chitina / cuticola biosintesi 41, ecdysone segnalazione 42, comportamento sociale 43, e altro ancora. Metodi RNAi sviluppati per diverse specie di insetti possono essere di ulteriore vantaggio in quanto sono suscettibili di essere utile per il controllo dei parassiti (rivisto nel 44-46). effetti RNAi saranno nonché specie-specifico gene-specifico, purché regioni non conservate sono scelti per il targeting. Per le specie di insetti utili come le api e bachi da seta, di targeting dei geni vitali per la sopravvivenza divirus o parassiti per controllare l'infezione possono fornire una nuova strategia per proteggere queste specie 47,48.
Dermestes maculatus (D. maculatus), comune nome nascondere coleottero, è distribuito in tutto il mondo tranne che per l'Antartide. Come un insetto olometaboli, il ciclo di vita D. maculatus comprende embrionale, larvale, pupa, e stadi adulti (Figura 1). Perché si nutre di carne, D. maculatus è utilizzato nei musei per skeletonize animali morti e entomologi forensi può essere utilizzato per stimare momento della morte 49,50. D. maculatus si nutre di prodotti di origine animale, tra cui carcasse, carne secca, formaggio e le pupe / bozzoli di altri insetti e provoca così danni alle famiglie, alimenti conservati, e la seta, il formaggio, e industrie della carne 51,52. L'applicazione di RNAi in questo coleottero potrebbe fornire un modo efficiente ed ecologico per ridurre al minimo il suo impatto economico. Il nostro laboratorio ha utilizzato D. maculatus come nuovo model insetto per studiare la segmentazione 53. Oltre ad essere suscettibili di laboratorio allevamento, D. maculatus è di interesse per la ricerca di base in quanto è uno sviluppatore intermedio di germi, che lo rende una specie utili per studiare la transizione tra breve e di sviluppo a lungo germe.
Figura 1: Ciclo di vita di D. maculatus. Fotografie di D. maculatus in diverse fasi della vita, come indicato. Il ciclo di vita da uovo ad adulto dura tre settimane a 30 ° C, ma più a lungo a temperature più basse. (A, F) embrioni appena deposte sono di colore bianco a giallo chiaro e ovali, circa 1,5 mm di lunghezza. Embriogenesi prende ~ 55 ore a 30 ° C. (B, C e G) larve hanno le strisce pigmentate scure e sono ricoperte di setole. Le larve passano attraverso diversi stadi a seconda dell'ambiente e la loro lunghezza può estendersi fino a oltre 1 centimetro. (D, H) (E, I) Poco dopo eclosion, pigmentazione scura appare sopra il corpo adulto coleottero. Gli adulti possono vivere fino a diversi mesi e una femmina può deporre centinaia di embrioni sopra il suo ciclo di vita. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In precedenza, abbiamo dimostrato che RNAi è efficace nel abbattendo la funzione del gene in D. maculatus 53. Qui la nostra esperienza di allevamento colonie D. maculatus in laboratorio è condiviso con i protocolli passo-passo sia embrionale e genitori RNAi set-up, iniezione, cura post-iniezione, e l'analisi fenotipica. Il silenziamento genico e analisi metodi dsRNA-mediate introdotti qui non solo di fornire informazioni dettagliate per affrontare questioni in D. maculatus, ma hanno anche un significato potenziale foR applicazione di RNAi in altre specie non-modello scarabeo / insetto.
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Protocol
1. allevamento di D. maculatus
NOTA: Una colonia di allevamento di D. maculatus è stato istituito nel laboratorio degli autori con gli adulti e le larve acquistato per uso commerciale. L'identità di specie è stata verificata utilizzando DNA barcoding 53.
- Per impostare una nuova gabbia in laboratorio, si sviluppa un sottile strato di trucioli di legno in una gabbia di insetti di medie dimensioni (30,5 x 19 x 20.3 cm 3). Posizionare un ~ 10 x 6 x 3 cm 3 pezzo di polistirolo nella gabbia per far nascondere le larve per impupamento. Aggiungere 20 - 50 coleotteri (sia adulti o larve instar in ritardo). Coleotteri si nasconderanno nei trucioli di legno.
- Aggiungere cibo per gatti umido in una capsula di Petri o una barca di pesatura. Coprire la gabbia con panno di maglia e posizionare la gabbia in un incubatore.
- Per mantenere una colonia di allevamento in laboratorio, impostare la temperatura tra 25 e 30 ° C. D. maculatus cresce più rapidamente a temperature più elevate, ma favorisce anche la crescita di funghi e acari. Per mantenere un guarirela tua colonia, utilizzare 25 - 28 ° C per regolare magazzino manutenzione e 30 ° C per rapida espansione della colonia. Il ciclo di vita è di circa tre settimane per quattro mesi a seconda di fattori ambientali 50 (Figura 2).
Figura 2: D. maculatus Lab Colony. Viene mostrata la fotografia di una tipica gabbia insetto D. maculatus. Trucioli di legno sono sparsi per lasciare che i coleotteri nascondono. Cibo per gatti viene aggiunto in una piccola scatola di Petri o in barca pesatura. Styrofoam è posto nella gabbia come rifugio per le larve instar finale per pupate. La gabbia mostrato qui è 30,5 x 19 x 20.3 cm 3 e ospita alcune centinaia di larve, pupe e adulti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- pratove le uova nella gabbia a maturare. Per espandere la colonia, stabilire nuove gabbie con le uova (raccolti come descritto nella sezione 2), larve o adulti, come sopra. D. maculatus depongono uova in tutta la gabbia, in particolare nei pressi della fonte di cibo.
- Sostituire cibo per gatti umido circa due volte a settimana.
NOTA: A causa del cattivo odore di cibo per gatti umido, fonti alimentari alternative sono stati testati (vedi la discussione).
2. Embryo Collection
- Per impostare una raccolta, separare almeno 50 maschi e 50 femmine della colonia. I giovani adulti sono i migliori. Luogo adulti in un mini-dimensioni della gabbia (17.8 x 10.2 x 12.7 cm 3) senza trucioli di legno. Aggiungere cibo per gatti in una barca pesatura.
- Prima di iniziare la raccolta, controllare la gabbia con attenzione per eventuali embrioni presenti e rimuoverli. Mettere un batuffolo di cotone allungato nella gabbia, e lasciare la gabbia in un incubatore a 30 °. Dopo la finestra temporale appropriata, il batuffolo di cotone sarà pronto per la raccolta degli embrioni.
- piegaun pezzo di cartoncino nero (formato A4) a metà per creare una piega, e poi dispiegarsi.
- Togliere il batuffolo di cotone si estendeva dalla gabbia. Rimuovere gli adulti dal batuffolo di cotone e rimetterli nella gabbia.
- Mentre pizzicare la palla di cotone allungato molto delicatamente, esso strappare lentamente in filamenti di cotone sottili di lasciare che le uova cadono sulla carta nera.
NOTA: gli embrioni D. maculatus sono fragili e difficili da vedere in cotone. Possono essere facilmente schiacciati se in possesso di palla di cotone troppo saldamente.
3. Preparazione dsRNA
- DNA stampo Preparazione per dsRNA Sintesi
- Run 4 - reazioni PCR 6 50 ml utilizzando primer contenenti sequenze T7 promotore, sia a 5 'finisce per amplificare DNA stampo secondo il protocollo del produttore.
- Purificare prodotto di PCR utilizzando un kit commerciale di purificazione PCR, seguendo le istruzioni del produttore. La concentrazione finale ideale del modello di DNA è ≥100 ng / ml.
- Iniezione Buffer Preparazione
- Preparare 100 ml di tampone di iniezione (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCl). Regolare il pH a 6,8 con 5 M NaOH.
- aliquote conservare a -20 ° C.
- dsRNA Sintesi
- Impostare una reazione in un tubo di 0,2 ml PCR in ghiaccio ed effettuare una reazione di trascrizione in vitro con T7 polimerasi, seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando ~ 500 template ng per reazione.
- Incubare la provetta a 37 ° C durante la notte.
- Digerire il modello di DNA con DNasi, seguendo le istruzioni del produttore.
- Riscaldare il tubo a 94 ° C e mantenere a 94 ° C per 3 min.
- Per ricuocere il dsRNA, raffreddare lentamente il tubo di 1 ° C / min fino a raggiungere 45 ° C dopo 1 ora.
NOTA: I passaggi 3.3.2 tramite 3.3.5 può essere eseguita in un termociclatore. - All'etanolo precipitato di dsRNA, aggiungere 280 mldi RNasi acqua libera a 20 microlitri di reazione per regolare ad un volume finale di 300 microlitri. Aggiungere 30 ml di 3 M NaOAc (pH 5.2) e 650 ml di etanolo. Posizionare il tubo in -20 ° C freezer per una notte.
- Dopo centrifugazione a 15.682 xg per 30 min a 4 ° C, lavare il pellet dsRNA con il 70% di etanolo. pellet secco e si dissolve in 20 microlitri di buffer di iniezione.
- Misurare la concentrazione del dsRNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 A. La concentrazione ideale è 3-5 mg / mL. Controllare la qualità eseguendo 5 ml di una diluizione 1:25 dsRNA su un gel di agarosio 1% a 90 V per 30 min. Una singola banda delle dimensioni previste sarà facilmente visibile.
- Conservare il dsRNA a -20 ° C o inferiore.
NOTA: Per ogni esperimento RNAi atterramento, includono un controllo dsRNA, che non ci si aspetterebbe di influenzare il processo in fase di studio. GFP dsRNA è un controllo eccellente per la maggior parte degli esperimenti. Preparare e iniettare i dsRNA controllo fianco a fianco con il experimentale dsRNA.
4. Montaggio di microinjector e Micromanipolatore
NOTA: Vedere la Figura 3.
- Collegare azoto o altra alimentazione dell'aria all'ingresso pressione di uno strumento pompa pneumatica. Se una pompa pneumatica non è disponibile, applicare pressione utilizzando una siringa da 50 ml collegato al tubo fine.
- Collegate un interruttore a pedale al connettore remoto della pompa per controllare il flusso di pressione di espulsione.
- Attaccare un supporto di vetro capillare per porta di pressione di espulsione della pompa con il tubo.
- Fissare il supporto capillare su un micromanipolatore vicino a un microscopio da dissezione.
5. embrionali RNAi
NOTA: La figura 4 mostra un diagramma di flusso D. maculatus embrionali RNAi.
- eRNAi Preparazione
- Preparare un embrione raccolta Petri coperchio (diametro 90 mm). Posizionare un pezzo di carta da filtro nero csulla parte interna del coperchio. Mettere un vetrino da microscopio di serie sulla carta nera.
- Diluire dsRNA a concentrazione adeguata con tampone di iniezione. Utilizzare 2-3 mg / mL per gli esperimenti iniziali. Tenere sempre dsRNA in ghiaccio prima dell'iniezione.
- Aggiungere colorante alimentare a 1:40 diluizione al dsRNA e pipetta delicatamente più volte per mescolare bene.
- Gli embrioni di raccolta per iniezione
NOTA: A 25 ° C, i nuclei in embrioni di 6 - 8 ore dopo la posa Egg (AEL) migrano verso l'uovo periferia 53. Un blastoderma cellulare è stabilita entro 8 - 10 ore AEL 53. Per garantire gli embrioni prima di fase blastoderma cellulari sono utilizzati per l'iniezione, 0 - embrioni AEL 3 ore si consiglia di utilizzare 53. raccolta degli embrioni, la preparazione, e l'iniezione di solito prendono meno di 2 ore, se i capillari di vetro sono in buona forma. Pertanto, l'intero processo può essere completato entro 5 ore AEL.- Raccogliere gli embrioni come descritto ai punti 2.2-2.5.
- Toccare il cartoncino nero per trasferire gli embrioni in raccolta coperchio capsula di Petri.
- Bastone nastro biadesivo lungo il bordo della diapositiva.
- Utilizzando un pennello, allineare gli embrioni sul nastro perpendicolare al bordo diapositiva con anteriore o estremità posteriore al bordo. Si noti che le anteriori e posteriori estremità embrioni precoci non sono facilmente distinguibili, quindi in media metà sarà iniettato alla fine posteriore l'ideale.
- Caricamento del dsRNA nel capillare di vetro
- Raccogliere 2 - 4 pl di dsRNA in 20 microlitri punta della pipetta microloader.
- Inserire la punta in un capillare di vetro pre-tirato (denominato ago) e delicatamente pipetta la soluzione dsRNA nel capillare. Preparare aghi da capillari di vetro commerciali con un estrattore micropipetta. Un esempio di un ago tirato ideale è mostrato in Figura 5. La lunghezza e la conicità di aghi possono avere bisogno di essere ottimizzato afprove di iniezione ter.
- Fissare il capillare di vetro nel supporto capillare di vetro.
- Montare il supporto capillare nel micromanipolatore.
- L'iniezione di dsRNA in embrioni
- Trasferire accuratamente il vetrino con gli embrioni sul palco del microscopio da dissezione.
- Spostare il vetrino per portare un embrione al centro del campo e il fuoco microscopio.
- Posizionare la punta del capillare con il micromanipolatore mentre guardando nel microscopio da dissezione. Portare la punta vicino alla fine del primo embrione nella riga.
- Accendere l'azoto o altro alimentazione dell'aria.
- Impostare l'interruttore del solenoide selettore di ingresso al vuoto.
- Regolare il regolatore di pressione di espulsione per 10 - 15 psi. Regolare la pressione seconda dell'apparecchiatura.
- Aprire il capillare, se necessario. Una volta che la punta è aperta, la soluzione colorata dsRNA riempirà la punta.
- Spostare la punta capillare in avanti per forare la postambryo. Se l'impostazione della pressione è ideale, nessun liquido embrionale fluirà nel capillare.
- Passo sul pedale per espellere soluzione dsRNA nell'embrione fino a quando viene espulsa una quantità adeguata di soluzione. La Figura 5 mostra esempi di embrione morfologia dopo quantità appropriate e inappropriate di soluzione sono stati iniettati.
- Tenere la punta capillare all'interno dell'embrione per ~ 2 secondi, e poi rimuoverlo.
- Spostare il capillare alla prossima embrione e ripetere i punti 5.4.8 - 5.4.10 fino a quando tutti gli embrioni vengono iniettati. Cambiare capillare di vetro se viene intasato o si rompe.
- Il recupero post-iniezione e incubazione
- Dopo l'iniezione, posizionare il vetrino in una capsula di Petri.
- Aggiungere un batuffolo di cotone bagnato per la piastra di Petri. Non lasciate che la palla di cotone toccare la diapositiva.
- Coprire la piastra di Petri e avvolgerlo con la pellicola sigillante. Etichettare il piatto con il nome del dsRNA, la concentrazione, la data, l'ora e il numero di iniettatoembrioni.
- Posizionare la piastra di Petri in un incubatore a 30 ° fino alla botola embrioni.
6. RNAi parentale
- Isolando Pupe per pRNAi
- Raccogliere pupe dalla colonia.
- Ordina maschile e femminile pupe al microscopio (vedi Figura 6). Tenerli in due piastre di Petri separate in un incubatore a 30 ° per garantire che nessun accoppiamento avviene prima dell'iniezione.
- Controllare ogni giorno per gli adulti eclosed. Pupation richiede solitamente 5 - 7 giorni a 30 ° C.
- Trasferimento eclosed maschi e femmine (vedi figura 6) a due piatti separati Petri e dar loro da mangiare cibo per gatti a giorni alterni fino a quando non sono pronti per l'iniezione.
- Procedere alla iniezione di una volta ci sono abbastanza femmine e maschi in età appropriata. Le femmine 4 a 8 giorni post-eclosion sono i migliori. Per un'analisi tipica, 8 - vengono utilizzati 12 femmine. Un numero uguale di maschi sono necessari per l'accoppiamento 54.
- Preparare dsRNA su ghiaccio (5.1.2 e 5.1.3).
- Attaccare un ago 32-gauge a una siringa da 10 ml.
- Anestetizzare femmine su CO 2 palco.
- Caricare soluzione dsRNA nella siringa senza occupare tutta l'aria.
- Tenere un lato ventrale femminile con una mano e tenere la siringa con l'altro.
- penetrano delicatamente la segmacoria (membrana) tra sterniti 2 e 3 con la punta dell'ago. La figura 7 mostra una femmina durante l'iniezione. Se l'ago non penetra nel tessuto facilmente, l'angolo l'ago verso l'alto e lentamente premere verso il basso. Inserire circa 2 mm dell'ago nel corpo.
- Controllare la scala della siringa mentre lentamente spingendo lo stantuffo, iniettando ~ 2 ml per femmina.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago ancora per almeno 5 secondi prima di rimuoverla dal ventre della femmina.
- Trasferire le femmine iniettati di una capsula di Petri (diametro 90 mm) ed alimentare con cibo per gatti.
- Etichettare la piastra di Petri con il nome dsRNA, quantità iniettata, la data e il numero di femmine.
- Il recupero post-iniezione e di accoppiamento
- Incubare la piastra di Petri in un incubatore a 30 °.
- Dopo 24 ore, il trasferimento iniettato femmine per un mini gabbia.
- Aggiungere alla gabbia un numero uguale di giovani maschi uninjected, ed etichettare la gabbia.
- Aggiungere una barca pesatura con cibo per gatti nella gabbia.
- Lasciare la gabbia in un incubatore a 30 ° per consentire l'accoppiamento. Dopo 24 ore, le femmine dovrebbero iniziare a deporre le uova e gli embrioni possono essere raccolti ogni giorno o ad intervalli di tempo richiesti.
7. Analisi fenotipica dopo RNAi
NOTA: Al 30 ° C, ci vuole ~ 55 ore per le uova si schiudono 50.
- Analisi eRNAi Viabilità
- Calcolare il tasso di tratteggio confrontando il numero di larve schiuse al nu totalember di embrioni iniettati. Assicurati di includere una iniezione di controllo negativo come embrioni possono essere danneggiati o uccisi dalla procedura di iniezione. tassi di tratteggio tipiche variano dal 30% - 60%. Attenzione alle larve si sono schiuse le uova non schiuse mangiare.
- Analisi pRNAi Viabilità
NOTA: Se la vitalità femminile è influenzato dal gene di mira da RNAi, femmine iniettati con specifico dsRNA ma non il controllo negativo dsRNA cominceranno a morire. Se la produzione di uova o di deposizione delle uova è influenzato, le femmine esporranno sterilità parziale o completa. Punteggio di sopravvivenza femminile rispetto ai controlli negativi o confrontare il numero totale di uova deposte dalle femmine e di controllo (7.2.3).- Impostare raccolta degli embrioni passo successivo 2.2.
- Dopo 24 ore, raccogliere gli embrioni seguenti operazioni 2.4 - 2.5.
- Contare il numero totale degli embrioni.
- Trasferire gli embrioni a un 90 millimetri piastra di Petri. Etichettare la piastra di Petri con il gene bersaglio, la data di raccolta, e il numero di embrioni. Incubare gli embrioni in un incubatore a 30 ° fino alla loro schiusa. Dal larve si nutrono schiuse su embrioni non schiuse, controllare la piastra di Petri frequentemente e separata covato larve da embrioni non schiuse con pinze (vedi la discussione).
- Contare il numero di embrioni nati e calcolare il tasso di tratteggio.
- Esaminando Difetti cuticole in covato Larve
- Raccogliere le larve tratteggiata in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- In una cappa aspirante, aggiungere 1 ml di soluzione di fissaggio.
- Lasciare la provetta a 4 ° C per almeno una notte per lasciare la soluzione penetrare il tessuto larvale.
- Per visualizzare, rimuovere la maggior quantità fissativo dal tubo possibile.
- larve Risciacquo almeno tre volte con PBST.
- Trasferimento larve di una lastra di vetro multi-bene con PBST utilizzando un puntale P-1000 con l'estremità tagliata di ampliarla.
- Sotto un microscopio da dissezione, allungare le larve con pinze per esaminare i difetti. iot è fondamentale per allungare le larve di esaminare difetti come il loro contratto corpi in fissativo.
- Esaminando Difetti cuticole in Unhatched Larve
Nota: Questa procedura è utile per l'esame dei primi fenotipi embrionali, in particolare per gli embrioni che non sopravvivono alla schiusa.- Per pRNAi, aggiungere PBST nella capsula di Petri (7.2.4) e trasferire gli embrioni unhatched in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga utilizzando un puntale P-1000 con l'estremità tagliata. Per eRNAi, aggiungere PBST nella capsula di Petri (5.5.4), spazzola embrioni non schiuse fuori dal vetrino da microscopio e trasferirli in una provetta.
- Fissare gli embrioni con Fixation Solution e sciacquare con PBST per la visualizzazione seguenti passaggi 7.3.2 - 7.3.6.
- Utilizzando pinze, sezionare embrioni fuori dal guscio d'uovo sotto un microscopio da dissezione in PBST.
- Trasferire gli embrioni di nuovo al 1,5 ml provetta (~ 200 ml di embrioni in ogni tubo).
- Rimuovere quanto più solution possibile.
- Aggiungere 1 ml di 90% di acido lattico / 10% EtOH. Lasciare la provetta in un incubatore a 60 ° almeno per una notte.
NOTA: embrioni può essere lasciato a 60 ° C per diversi giorni. - Per montare gli embrioni, li pipetta su un vetrino da microscopio utilizzando un puntale P-1000 con l'estremità tagliata.
- posizionare manualmente gli embrioni con pinze ad un orientamento ideale.
- Coprire gli embrioni con una copertura antiscivolo e visualizzare al microscopio utilizzando DIC.
- Esaminando Difetti Cellulare e Molecolare
NOTA: Questa procedura è utile per indagare le cause di fenotipi cuticola o letalità che non sia accompagnato da difetti cuticola.- Per pRNAi, embrioni separati da batuffoli di cotone in fase di sviluppo appropriato e trasferirli in un cesto di embrione di raccolta. Il cesto di raccolta può essere uguale o simile a quello usato per le raccolte di embrioni di Drosophila.
- Rendereil cesto uovo da 25 ml di plastica scintillazione flaconcino con il fondo della fiala rimosso, e un cerchio tagliato fuori dal coperchio (circa 1 cm di diametro). Posizionare un cerchio di super fine maglia circa 2,5 cm di diametro all'interno del coperchio, e poi avvitare la fiala di scintillazione e utilizzare uno a testa in giù.
- Come la maglia può essere facilmente rimosso una volta che gli embrioni vengono lavati, immergere le maglie di una provetta con acqua per recuperare eventuali embrioni attaccano alla maglia.
- Per eRNAi, al momento opportuno, aggiungere PBST alla piastra di Petri. Spazzolare gli embrioni fuori dal vetrino da microscopio e trasferirli ad un paniere embrione di raccolta.
NOTA: la fissazione, in ibridazione in situ, colorazione degli anticorpi, e protocolli di colorazione nucleare può essere trovato in Xiang et al. 2015 53.
- Per pRNAi, embrioni separati da batuffoli di cotone in fase di sviluppo appropriato e trasferirli in un cesto di embrione di raccolta. Il cesto di raccolta può essere uguale o simile a quello usato per le raccolte di embrioni di Drosophila.
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Representative Results
Laboratorio degli autori ha utilizzato la tecnologia RNAi per studiare l'evoluzione funzionale dei geni che regolano la segmentazione negli insetti 53,55. Mentre tutti gli insetti sono segmentati, i geni che regolano questo processo sembrano aver discostato durante radiazioni insetti 26,38,56-63. Schermi genetiche in Drosophila hanno identificato una serie di nove geni di segmentazione coppia-di regole che sono responsabili per promuovere la formazione di segmenti corporei 64-70. Qui, l'ortologo di uno di questi geni, abbinato (PRD), viene utilizzato per documentare l'utilità di RNAi per studiare la funzione del gene in D. maculatus.
eRNAi e pRNAi erano ogni efficaci nel dimostrare ruoli per DMAC - PRD nella formazione segmento in questa specie. 2 - 3 mg / mL di dsRNA progettato per indirizzare DMAC - PRD (figure 8B, 8D e 8F GFP dsRNA, iniettato come controllo negativo (figure 8A, 8C e 8E).
prole di controllo covato con una striscia pigmentato per segmento. Strisce pigmentate confinanti sono stati separati da uno spazio non pigmentato (Figura 8A). Dopo PRD pRNAi, figli affetti covato con fuse strisce pigmentate vicini, che indicano i confini segmentale erano difettose (Figura 8B). A seconda della gravità fenotipica, uno o più fusioni sono stati rilevati nelle larve interessata. Tuttavia, fusioni costantemente apparso nelle regioni di confine tra T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, indicando i difetti coppia-regola-like. Fenotipi cuticole dopo atterramento PRD hanno mostrato la perdita di segmenti addominali, così come la lunghezza del corpo ridotto (Figura 8D). Engrailed (En) colorazione anticorpo è stato eseguito per esaminare i difetti molecolari nei primi mesi delembrioni dopo atterramento PRD. Mentre gli embrioni di controllo ha mostrato strisce En espressione con la stessa intensità in tutti i segmenti (Figura 8E), ridotta espressione En è stato rilevato in strisce alternate nella prole di DMAC-PRD dsRNA iniettato femmine (asterischi nella Figura 8F). Il pattern di espressione ridotta En è coerente con il modello della cuticola difettoso osservato nelle larve schiuse interessato. Per i risultati più dettagliati di fenotipi dopo atterramento PRD in D. maculatus, vedere Xiang et al. 2015 53.
Figura 3: Apparato di iniezione. È mostrato fotografia del microscopio dissezione e micromanipolatore utilizzato per iniettare gli embrioni D. maculatus. fornitura di azoto è collegata alla porta di ingresso pressione di una pompa pneumatica. titolare capillare di vetro è collegato al eject bocca premente della pompa. interruttore a pedale è collegato alla pompa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: un diagramma di flusso per D. maculatus embrionali RNAi. (AD) di raccolta di embrioni per l'iniezione. Le femmine depongono embrioni (arancione) a batuffoli di cotone (cerchio grigio). embrioni separati da batuffoli di cotone e lasciarli cadere su un pezzo di cartoncino nero. Le barre bianche indicano le lacrime agli batuffolo di cotone. Trasferimento degli embrioni per un coperchio capsula di Petri raccolta, rivestite con carta nera. (E, F) Iniettare dsRNA in embrioni. Allineare gli embrioni su diapositive su nastro doppio bastone e li inietta individualmente sotto un microscopio da dissezione. è mostrato Ago con colorante alimentare verde. (GJ) post-iniezione recupero e incubzione. Mettere un batuffolo di cotone bagnato nella scatola di Petri per fornire umidità. Coprire la piastra di Petri e avvolgerlo con pellicola (azzurro) di tenuta. Posizionare la piastra di Petri in un incubatore e rimuovere le larve schiuse per l'analisi fenotipica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Good vs Bad embrionali Esempi di iniezione. Embrione (A) uninjected. (B) Embrione iniettato con troppo poco dsRNA. (C) Embrione iniettato con adeguata quantità di dsRNA. (D) embrione rotto con traboccante dsRNA causata da un eccesso di iniezione. colorante alimentare è stato aggiunto al dsRNA per la visualizzazione. (E) Esempi di tubi capillari trainati usati come aghi per iniezione. Si noti la conicità e lunghezza della punta fo due esempi di aghi funzionali. Barre di scala per AD rappresentano 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: maschio e femmina adulti e pupe. (A) Vista ventrale di una pupa di sesso maschile. (A ') Ingrandimento della parte posteriore A. (A ") Illustrazione del maschio genitali pupa. (B) Vista ventrale di una pupa femminile. (B') ingrandimento della parte posteriore del pupe B. femminili hanno due papille genitali (bianco frecce). (B ") Illustrazione dei genitali femminili pupa. (C) Vista ventrale di un maschio adulto. (C ') Visualizzazione ingrandita della parte posteriore del C. Si noti che gli adulti di sesso maschile sono tridente, come i genitali e unastruttura circolare lobi simile al 4 ° sternite (frecce bianche e nere, rispettivamente). (D) Vista ventrale di una femmina adulta. (D ') Visualizzazione ingrandita della parte posteriore del D. Per tutti i pannelli, le barre di scala indicano 1 mm. Per i dettagli, vedere Xiang et al. 2015 53. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: A femmina durante l'iniezione. Le femmine sono anestetizzati e poste ventrale verso l'alto. Viene mostrato un ago che penetra le segmacoria tra il 2 ° e 3 ° sterniti per iniettare dsRNA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: fenotipi rappresentante, previa pRNAi DMAC-PRD. Iniezione (A) Controllo. Vista laterale di un tipo simile GFP pRNAi prole selvaggio ordito con tre segmenti toracici e dieci segmenti addominali. Ogni segmento ha setole e strisce pigmentate. (B) Vista laterale di un tratteggiata PRD prole pRNAi. Il divario fra bande pigmentate vicini etichettati è ridotto o del tutto mancante. (C) cuticola fenotipo di un controllo unhatched embrione di tipo simil-selvaggio. (D) per cuticole fenotipo di un unhatched PRD prole pRNAi con un minor numero di segmenti addominali. (E, F) Dissected germband da: (E) di controllo, GFP pRNAi è uniformemente espresso En in ogni segmento, (F) PRD espressione pRNAi, En viene ridotto in segmenti alternati (asterischi). Per tutti riquadroLS, barre di scala indicano 500 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre un piccolo numero di sistemi modello sofisticati (topi, mosche, vermi) sono stati sviluppati nel corso del 20 ° secolo, il 21 ° secolo ha visto un'ondata di nuovi sistemi di animali in fase di sviluppo nei laboratori di tutto il mondo. Questi nuovi sistemi consentono agli scienziati di affrontare comparativi, domande evolutive che non può essere sondato utilizzando solo gli 'standard' sistemi modello. Questa distribuzione di nuovi modelli richiede il rapido sviluppo di metodi per la coltura di laboratorio, l'identificazione del gene, e gli approcci funzionali in nuove specie. Qui, sono state presentate le procedure per l'allevamento di D. maculatus in laboratorio e protocolli passo-passo per embrionali RNAi, genitori RNAi, e l'analisi fenotipica in questo coleottero. L'obiettivo è che queste descrizioni incoraggiare altri ad utilizzare D. maculatus nei loro esperimenti e di utilizzare gli approcci presentati qui di sviluppare ulteriori nuovi specie modello.
Mentre D. maculatus lcolonie ab sono incredibilmente facili da mantenere, una limitazione di allevamento di questa specie è l'odore sgradevole del gatto cibo umido dato ai coleotteri come loro fonte di cibo. Per evitare questo, cibi alternativi come polvere di siero / proteine della soia, formaggio, cibo per cani terra, e latte in polvere, sono stati testati con o senza cotone bagnato alterare umidità. cibo per cani Terra era l'alternativa più efficace e può essere utilizzato per regolare l'alimentazione colonia. La sopravvivenza era eccellente (> 90%) da uovo ad adulto in gabbie allevati sul cibo per cani solo secco in 80% di umidità relativa, con o senza aggiunta di cotone bagnato. Tuttavia, integrando questa dieta con cibo per gatti bagnato quando la raccolta delle uova per aumentare la fecondità può essere necessaria quando la raccolta di un gran numero di uova. Se si utilizza il cibo per cani, cibo vecchio deve essere rimosso regolarmente, come cibo per cani condizionata è stato trovato per inibire la deposizione delle uova 54. Crocchette cibo per cani (KR, risultati preliminari), sughero, legno, carta e altri materiali possono essere utilizzati anche come rifugi 71.È interessante notare che, biodegradazione di polistirolo utilizzando mealworm larve di scarabeo stato segnalato 72. Pertanto, questo è stato testato per D. maculatus larve. Giovane D. maculatus larve sono sopravvissuti fino all'età adulta con un solo polistirolo o di materiali contenenti amianto e cotone umido (dati non riportati), ma se mangiare e digerire quei materiali resta da determinare.
Questo rapporto è il primo protocollo dettagliato per lo svolgimento di studi genetici funzionali in D. maculatus. L'uso di RNAi qui rappresenta un'espansione di questa tecnica per un nuovo sistema modello. Diverse osservazioni specifiche sono degni di nota per quanto riguarda gli esperimenti atterramento RNAi in D. maculatus e altre specie non-modello. In primo luogo, garantire che RNAi sarà efficace in D. maculatus, lo stesso ceppo di D. maculatus usato qui dovrebbe essere impiegato. Esistono prove fornite da Tribolium castaneum che diversi ceppi mostrano variazioni di RNAi phenotypes 24,73, e fenotipi mutanti mostrano spesso la dipendenza dal background genetico in specie modello 74-76. Inoltre, vi è evidenza aneddotica per strain-dipendenza in altri protocolli, tra cui l'ibridazione in situ. In secondo luogo, appropriata tempi di iniezione è fondamentale per RNAi di successo nel D. maculatus. Un po 'counterintuitively, il segmacoria è più facilmente penetrato dopo la cuticola è completamente sclerotizzato, almeno due giorni dopo eclosion. Pertanto, femmine vergini 4 - 8 giorni dopo eclosion devono essere utilizzati. le femmine anziane sperimentano la fecondità più basso rispetto alle femmine di recente eclosed e quindi non sono adatti per l'iniezione. Terzo, iniettato dsRNA può ottenere spinto fuori dalla pressione interna dell'addome femminile. Per minimizzare la possibilità di perdere una grande quantità di dsRNA dopo l'iniezione, tenere l'ago nell'addome per ~ 5 sec dopo l'iniezione e quindi rimuovere lentamente (6.2.8). Nel frattempo, evitare di premere l'addome della femmina durante o subitodopo l'iniezione. Per aggirare risultati distorti causati da questo problema, iniettare almeno 8 femmine per ogni dsRNA per ottenere abbastanza prole (~ 200 embrioni al giorno) per l'analisi fenotipica. Quarto, alta resa uovo è importante per fornire dati imparziali per l'analisi fenotipica dopo l'iniezione. In media, ogni femmina D. maculatus produce circa 35-55 embrioni al giorno. Rendimento Egg dipende dalla dimensione della popolazione, femminile età, l'umidità, la disponibilità di cibo, la temperatura (dati non mostrati), ed altri fattori ambientali 54. Di solito, le femmine depongono più a 30 ° C a 25 ° C. In quinto luogo, gli embrioni non schiuse possono essere cannibalizzati da larve schiuse. Come larve schiuse sono di solito wild-type-simile o solo leggermente influenzato, mentre gli embrioni non schiuse sono di solito più gravemente colpiti, questa abitudine di D. maculatus larve possono causare risultati distorti in un'analisi quantitativa fenotipica. Pertanto, la rimozione di larve schiuse il più presto possibile è fortemente raccomandato.
Il nostro laboratorio si è concentrato su D. maculatus segmentazione, anche se molti aspetti di questa specie, tra cui la fisiologia, l'ecologia, e dei parassiti controllo sono di grande interesse. Per studiare l'embriogenesi e la segmentazione, una serie di strisce scuro pigmentate sul lato dorsale del D. maculatus larve può servire come marker naturale per lo sviluppo anormale. Inoltre, caratteristica setole radicata sulle strisce pigmentate di larve può essere usato come indicazione di segmenti. Queste caratteristiche morfologiche, insieme con la constatazione che gli embrioni affetti lievemente o moderatamente possono sopravvivere alla schiusa, sono vantaggi del modello D. maculatus per studiare i meccanismi coinvolti nel patterning il piano di base del corpo.
Infine, l'importanza di effettuare esperimenti, tra cui un controllo negativo altamente controllati come la GFP dsRNA e testare due regioni obiettivo non sovrapposte per ogni gene-è fondamentale per evitare errori di interpretazione a causa di effects di iniezione per sé e gli effetti la porta. Per D. maculatus, 4 - 6 mg (2 ml di 2 o 3 mg / mL) dsRNA sono stati iniettati in ogni femmina e il dsRNA era 200-250 bp lungo. Gli importi e altri dettagli del protocollo possono avere bisogno di essere ottimizzato se il targeting dei geni che funzionano in seguito in fase di sviluppo o in diversi processi fisiologici / metabolici. Scoperte precedenti hanno mostrato che gli effetti RNAi possono essere trasmesse alle generazioni successive al di là della generazione F1 in C. elegans 15. Una minoranza di ordito larve D. maculatus con difetti dovuti alla segmentazione RNAi può sopravvivere fino all'età adulta e in grado di riprodurre. Esperimenti preliminari non è riuscito a rivelare i difetti evidenti nella generazione F2. Studi futuri possono rivelare effetti transgenerazionali di RNAi in questa specie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
References
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