Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em> Dermestes maculatus</em

Summary

Her presenterer vi protokoller for oppdrett en mellom-bakterie bille, Dermestes maculatus (D. maculatus) i laboratoriet. Vi deler også protokoller for foster og foreldre RNAi og metoder for å analysere embryonale fenotyper å studere gen-funksjon hos denne arten.

Abstract

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Introduction

I 1998, Brann og Mello rapportert at dobbel-strandet RNA (dsRNA) kan indusere hemming av gen-funksjon i Caenorhabditis elegans ^1. Dette svaret utløst av dsRNA ble kalt RNA interferens (RNAi), og slik RNAi-mediert genet Slå ble rapportert å være konservert i dyr, planter og sopp ^2-7. I planter og noen dyr, RNAi funksjoner systemisk, noe som betyr at effekten kan spre seg til andre celler / vev hvor dsRNA ikke er direkte innført (oversikt i ^8-10). Forskere har gjort bruk av denne endogen cellulær RNAi respons ved å designe dsRNAs å målrette gener av interesse, og dermed slå ned gen-funksjon uten direkte å manipulere genomet (anmeldt i ^11-14).

RNAi er et kraftig verktøy for funksjonelle studier på grunn av følgende fordeler. Første, selv med minimal gensekvens informasjon, et gen som kan målrettes ved å bruke RNAi. Dette er spesielt viktig for studies av ikke-modellorganismer som mangler genomisk eller transcriptomic data. For det andre, i organismer der RNAi svaret er robust systemisk, RNAi-mediert genet knockdown kan utføres på nesten alle utviklingsstadiet. Denne funksjonen er svært nyttig for å studere funksjonen av pleiotrope gener. For det tredje, i noen tilfeller, RNAi effekter spre seg til gonadene og avkom, slik at fenotyper er observert i avkom ^15,16. Dette fenomenet, kjent som foreldre RNAi (pRNAi), er spesielt fordelaktig for gener påvirker embryoutvikling, som mange avkom som produseres av en enkelt injisert forelder kan undersøkes uten direkte manipulasjon av egg. Av disse grunner, er pRNAi metoden for valg. Men hvis pRNAi er ineffektiv, for eksempel for gener som kreves for oogenesen, deretter embryo RNAi (eRNAi) må benyttes. For det fjerde kan RNAi brukes til å generere tilsvarende en allelisk serie ved at mengden av dsRNA levert kan varieres over et område for å frembringe svake til sterke defekter. En slik gradering av fenotypene kan være nyttig for forståelsen av genfunksjon når genet er involvert i en kompleks prosess og / eller fullstendig tap av funksjon er dødelig. Femte, er levering av dsRNA generelt enkelt og gjennomførbart, spesielt i dyr som viser robuste systemiske RNAi svar. dsRNA kan innføres ved mikroinjeksjon ^1,5, fôring / inntak ^17,18, soaking, ^19,20 og virus / bakterier-mediert levering ^21,22. Sjette, i motsetning til enkelte gene targeting / redigering metoder, er det ikke nødvendig å screene for organismer som bærer mutasjonen eller til å utføre genetiske kors å generere homozygote når du bruker RNAi. Derfor, sammenlignet med mange andre teknikker for å studere gen-funksjon, er RNAi rask, billig, og kan brukes for store skjermer ^23-25.

Den brede nytten av RNAi tilveiebringer midler for å utføre funksjonelle studier i et bredt spekter av organismer, utvide utvalget av arten tilgjengelig for studier beyond de tradisjonelle modellsystemer som genetiske verktøy har blitt utviklet. For eksempel er undersøkelser ved bruk av ikke-modellsystemer er nødvendig for å gi innsikt i utviklingen av gener og gen-nettverk ved å sammenligne funksjonene til ortologer fra arter som representerer forskjellige utviklings modi eller oppviser forskjellige morfologiske egenskaper ^26-29. Disse typer studier vil gi en bedre forståelse av biologisk mangfold, med konsekvenser for både anvendt og grunnleggende forskning.

Å være den største dyregruppen på planeten, insekter gir en flott mulighet til å utforske de mekanismene bak mangfold. I tillegg insekter er generelt små, har korte livssykluser, høy fruktbarhet, og er lett å bak i laboratoriet. I de siste to tiårene, har RNAi blitt brukt i insekter spenner bestillinger, inkludert Diptera (sanne fluer) ^5, Lepidoptera (sommerfugler) ^30, Coleoptera (biller) ^16,31, Hymenoptera (sawfløgner, veps, maur og bier) ^32, nebbmunner (teger), Isoptera (termitter) ^34, Blattodea (kakerlakker) ^35, Orthoptera (sirisser, gresshopper, gresshopper og katydids) ³⁶ og Phthiraptera (lus) ^37. Vellykket anvendelse av RNAi har gitt funksjonelle data for studier av mønster i tidlig embryogenese (anterior-posterior aksen ^32, dorsal-ventral aksen ^28, segmentering ^26,38), kjønnsbestemmelse ^39,40, kitin / cuticle biosyntese ^41, -ekdyson signale ^42, sosial atferd ^43, og mer. RNAi metoder som er utviklet for forskjellige insektarter kan være av en ekstra fordel ved at de sannsynligvis vil være nyttig for skadedyrbekjempelse (oversikt i ^44-46). RNAi effekter vil være genspesifikke, så vel som art-spesifikke, så lenge det ikke-konserverte regioner er valgt for målretting. For gunstige insektarter som honningbier og silkeormer, målretting gener viktige for overlevelsen avvirus eller parasitter for å kontrollere infeksjon kan gi en ny strategi for å beskytte disse artene ^47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), felles navn skjul bille, er distribuert over hele verden bortsett fra Antarktis. Som et holometabolous insekt, inkluderer D. maculatus livssyklus embryonale, larve, pupal, og adulte stadier (figur 1). Fordi det strømmer på kjøtt, er D. maculatus brukes i museer å skeletonize døde dyr og rettsmedisinske entomologists kan bruke den til å anslå dødstidspunkt ^49,50. D. maculatus strømmer på animalske produkter, inkludert skrotter, tørket kjøtt, ost og puppe / kokonger av andre insekter og dermed forårsaker skade husholdninger, lagret mat, og silke, ost og kjøtt bransjer ^51,52. Bruk av RNAi i denne billen kunne gi en effektiv og miljøvennlig måte å minimere sin økonomiske konsekvenser. Vårt laboratorium har brukt D. maculatus som en ny mOdel insekt å studere segmentering ^53. I tillegg til å være mottagelig for lab oppdragelse, er D. maculatus av interesse for grunnforskning som det er en middels-bakterie utvikler, noe som gjør det en nyttig art å studere overgangen mellom kort og lang bakterie utvikling.

Figur 1: Life Cycle of D. maculatus. Fotografier av D. maculatus på ulike livsstadier, som angitt. Livssyklusen fra egg til voksen tar tre uker ved 30 ° C, men lenger ved lavere temperaturer. (A, F) fersk lagt embryoer er hvite til lys gul og oval, ca 1,5 mm i lengde. Embryogenese tar ~ 55 timer ved 30 ° C. (B, C og G) Larvene har mørke pigmenterte striper og er dekket med børster. Larvene går gjennom flere instars avhengig av miljø og sin lengde kan strekke seg opp til over 1 cm. (D, H) </strong> Young puppe er lys gul. Pupation tar ~ 5 – 7 dager ved 30 ° C. (E, I) Kort tid etter eklosjonshormon, synes mørk pigmentering over voksen bille kroppen. Voksne kan leve opp til flere måneder, og en hunn kan legge hundrevis av embryoer i løpet av sin levetid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere viste vi at RNAi er effektiv i å slå ned gen-funksjon hos D. maculatus ^53. Her vår erfaring oppdragelse D. maculatus kolonier i laboratoriet er delt sammen med trinn-for-trinn-protokoller for både foster og foreldre RNAi oppsett, injeksjon, etter injeksjon omsorg, og fenotypeanalyser. De dsRNA-mediert genet knockdown og analysemetoder introdusert her ikke bare gi detaljert informasjon for å ta opp spørsmål i D. maculatus, men også ha potensial betydning for søker RNAi i andre ikke-modellen bille / insektarter.

Protocol

1. stell av D. maculatus MERK: En kolonien av D. maculatus ble satt opp i forfatternes lab ved hjelp av voksne og larver kjøpt kommersielt. Arten identitet ble bekreftet ved hjelp av DNA-strekkoding 53. Å sette opp et nytt bur i laboratoriet, spre et tynt lag med sagflis i et mellomstort insekt bur (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Plasser en ~ 10 x 6 x 3 cm 3 del av isopor i buret å la larvene skjul for pupation. Tilsett 20 – 50 biller…

Representative Results

Forfatterne 'lab har brukt RNAi teknologi for å studere den funksjonelle utviklingen av gener som regulerer segmentering i insekter 53,55. Mens alle insekter er segmentert, genene regulerer denne prosessen synes å ha skilt lag under insekt stråler 26,38,56-63. Genetiske skjermer i Drosophila identifisert et sett med ni par-regelen segmentering gener som er ansvarlig for å fremme dannelsen av kroppens segmenter 64-70. Her er den ortolog av…

Discussion

Mens et fåtall avanserte modellsystemer (mus, fluer, ormer) ble utviklet i løpet av det ^20. århundre, har det ^21. århundre sett en bølge av nye dyre systemer blir utviklet i laboratorier over hele verden. Disse nye systemene tillate forskere å løse komparative, evolusjonære spørsmål som ikke kan probet med kun de 'standard' modellsystemer. Dette utplassering av nye modeller krever den raske utviklingen av metoder for lab dyrking, genet identifikasjon og funksjonelle tilnærminger …

Materials

Dermestes maculatus live beetles	Our lab or Carolina Biological Supply	#144168	Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food	Fancy Feast		Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food	Purina Puppy Chow		Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)	Exo Terra	PT2260	For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8×10.2×12.7 cm)	Exo Terra	PT2250	For embryo collection
Petri dish	VWR	89038-968
Cotton ball	Fisher	22-456-883
Megascript T7 transcription kit	Fisher	AM1334	For 40 reactions
Pneumatic pump	WPI	PV830
Capillary holder	WPI
Micromanipulator	NARISHIGE	MN-151
Black filter paper (90 mm)	VWR	28342-010
Food coloring (green)	McCormick
Borosilicate glass capillary	Hilgenberg	1406119
Needle puller (micropipette puller)	Sutter Instrument Co.	P-97
Microscope glass slide	WorldWide Life Sciences Division	41351157
Sealing film (Parafilm M)	Fisher	13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl )	Hamilton	7642-01
Needle (32-gauge)	Hamilton	7762-05
Fixation Solution (Pampel's)	BioQuip Products, Inc.	1184C	Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5)	Fine Science Tools	11252-30
Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)	Globe Scientific	1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip	Fisher	E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection	Leica	M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization	Zeiss	SteREO Discover. V12
DIC microscopy	Zeiss	AXIO Imager. M1