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Genetics

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。

Introduction

1998年には、火とメロは、二本鎖RNA（dsRNA）が線虫（Caenorhabditis elegans）1における遺伝子機能の抑制を誘導することができることを報告しました。該dsRNAによって誘発この応答は、RNA干渉（RNAi）と命名し、そしてそのようなRNAiを介した遺伝子サイレンシングは、動物、植物、および真菌2-7に保存されることが報告されました。植物や一部の動物において、RNAi機能は、全身、意味の効果が（8月10日に概説）のdsRNAが直接導入されていない他の細胞/組織に広がることができます。科学者たちは、それによって直接（11月14日に見直さ）ゲノムを操作することなく、遺伝子機能をノックダウン、目的の遺伝子を標的とするためのdsRNAを設計することにより、この内因性細胞RNAi応答を利用してきました。

RNAiは、次のような利点のために機能的研究のための強力なツールです。まず、偶数最小限の遺伝子配列情報を用いて、遺伝子は、RNAiを使用して標的化することができます。これは、STのために特に重要ですゲノムやトランスクリプトームデータを欠く非モデル生物のudies。第二に、RNAi応答がロバスト全身である生物で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、ほぼすべての発達段階で行うことができます。この機能は、多面的な遺伝子の機能を研究するために非常に有用です。第三に、いくつかの場合には、RNAi効果を表現型子孫15,16において観察されるように、生殖腺および子孫に広がります。単一注入親によって生成多数の子孫は、卵を直接操作することなく検査することができるように、親のRNAi（pRNAi）として知られるこの現象は、胚発生に影響を与える遺伝子について特に有利です。これらの理由から、pRNAiを選択する方法です。 pRNAiが無効である場合は、卵形成のために必要な遺伝子のために、たとえば、その後、胚のRNAi（eRNAi）を使用する必要があります。 dsRNAの量は強い欠陥に弱い生成する範囲にわたって変化させることができる送達という点で第四に、RNAiは、対立遺伝子シリーズの等価物を生成するために使用することができます。表現型のようなグラデーションは、遺伝子は致命的である複雑なプロセスおよび/または機能の完全な喪失に関与しているときに遺伝子機能を理解するのに役立つことができます。第五に、dsRNAの配信は、特に堅牢な全身のRNAi応答を示す動物では、一般的に簡単で、実現可能です。 dsRNAは、マイクロインジェクション1,5、摂食/摂取17,18、浸漬、19,20およびウイルス/細菌媒介送達21,22によって導入することができます。第六に、いくつかの遺伝子ターゲティング/編集方法とは異なり、変異を有する生物をスクリーニングするまたはRNAiを用いた場合にホモ接合体を生成するための遺伝的交雑を行う必要はありません。したがって、遺伝子機能を研究するための多くの他の技術と比較して、RNAiは、速く、安価であり、かつ大規模なスクリーニング23-25に適用することができます。

RNAiの広範なユーティリティがbeyon研究のために利用可能な種の範囲を拡大し、生物の広い範囲で機能的研究を遂行するための手段を提供します遺伝的ツールが開発されているために、従来のモデルシステムをdは。例えば、非モデル系を用いた研究は、異なる開発モードを表すか、別個の形態学的特徴26〜29を示す種由来のオルソログの機能を比較することにより、遺伝子および遺伝子ネットワークの進化への洞察を得るために必要とされます。研究のこれらのタイプは、印加されたと基本の両方の研究のための影響で、生物多様性のより良い理解を提供します。

地球上で最大の動物群である、昆虫は多様性のメカニズムを探求する絶好の機会を提供します。また、昆虫は、一般的に小さく、短いライフサイクル、高い繁殖力を持っている、と研究室の後部に簡単です。過去20年間において、RNAiが正常に双翅目（真のハエ）5を含む、注文にまたがる昆虫で適用されてきた、鱗翅目（蝶や蛾）30、鞘翅目（甲虫）16,31、膜翅目（sawf嘘、ハチ、アリやハチ）32、半翅目（真のバグ）、等翅目（シロアリ）34、Blattodea（ゴキブリ）35、直翅目（コオロギ、バッタ、イナゴ、とキリギリス）36と、シラミ目（シラミ）37。 RNAiの成功のアプリケーションは、エクジソンが42シグナル伝達、初期胚発生におけるパターン形成の研究のための機能データ（前後軸32、背腹軸28、セグメンテーション26,38）、性別決意39,40、キチン/キューティクルの生合成41を提供してきました社会的行動43、およびより多くの。彼らは（44-46に概説）害虫防除のために有用である可能性があるという点で異なる昆虫種のために開発されたRNAi法は、付加的な有益であり得ます。 RNAi効果は、非保存領域を標的とするために選択されている限り、遺伝子特異的なだけでなく、種特異的であろう。の生存に不可欠な遺伝子を標的ミツバチやカイコなどの有益な昆虫種については、感染を制御するためのウイルスまたは寄生虫は、これらの種47,48を保護するための新規な戦略を提供することができます。

Dermestes maculatus（D. maculatus）、一般名の非表示カブトムシは、南極大陸を除く世界的に分布しています。完全変態の昆虫としては、D. maculatusのライフサイクルは、胚、幼虫、さなぎ、および成体期（ 図1）が含まれています。それは肉を餌にするので、D. maculatusは死んだ動物を骸骨にするために美術館に使用され、法医学昆虫学者は、死亡49,50の時間を推定するためにそれを使用することができます。 D. maculatusは死体、乾燥肉、チーズ、および他の昆虫の蛹/繭などの動物性食品に供給し、このように家計へのダメージ、保存された食品、シルク、チーズ、肉産業51,52の原因となります。この甲虫でRNAiを適用すると、その経済的影響を最小化するための効率的かつ環境に優しい方法を提供することができます。私たちの研究室では、新しいメートルとしてD. maculatusを使用していますセグメンテーション53を研究するodel昆虫。それはそれの有用な種は短期および長期の生殖発達の間の移行を検討すること、中間胚の開発者であるとして、実験室飼育の影響を受けやすいことに加えて、D. maculatusは、基礎研究のために重要です。

図1
図1：D. maculatusのライフサイクル。示されているように異なるライフステージでのD. maculatusの写真、。卵から大人までのライフサイクルは、より低い温度でより長い30℃で3週間かかりますが。 （A、F）産まれたての胚は、長さ約1.5ミリメートル、淡黄色の楕円形に白です。胚は〜30℃で55時間かかります。 （B、C、およびG）幼虫が暗く着色されたストライプを有しており、毛で覆われています。幼虫は、環境に応じて、いくつかの齢を通過し、その長さは1オーバーセンチにまで拡張することができます。 （D、H） （E、I）間もなく羽化後、暗い色素沈着は、大人のカブトムシの体の上に表示されます。大人数ヶ月まで生きることができ、一人の女性が生涯にわたって胚の数百人を置くことができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

以前、我々は、RNAiは、D. maculatus 53における遺伝子機能のノックダウンに有効であることが示されました。ここでは実験室でD. maculatusコロニーを飼育経験は、胚と親の両方のRNAiセットアップ、注射、注射後のケア、および表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルと一緒に共有されています。 D. maculatusで質問に対処するための詳細な情報を提供するだけでなく、foの潜在的な重要性を持っているだけでなく、ここで紹介したdsRNA媒介遺伝子ノックダウンと分析方法rの他の非モデル甲虫/昆虫種でRNAiを適用します。

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Protocol

D. maculatusの1飼育

注：D. maculatusの繁殖コロニーは、大人を使用して、著者らの研究室で設定し、幼虫は、商業的に購入しました。種の識別は、DNAバーコード53を使用して検証しました。

  1. ラボで新しいケージを設定するには、中規模虫かご（30.5 X 19 X 20.3センチメートル3）に木屑の薄い層を広げます。蛹化のための幼虫の皮をできるようにケージに発泡スチロールの〜10×6×3 cm 3のチャンクを配置します。 50カブトムシ（大人または後期齢幼虫のいずれか） - 20を追加します。カブトムシは、木屑に非表示になります。
  2. ペトリ皿または計量ボートに湿ったキャットフードを追加します。メッシュ布でケージを覆い、インキュベーターにケージを置きます。
  3. ラボで繁殖コロニーを維持するため、25と30℃の間の温度を設定します。 D. maculatusは、より高い温度でより速く成長し、これはまた、カビやダニの成長を促進します。癒しを維持するために、急速に植民地を拡大するための定期的な株式のメンテナンスと30°C、28°C - あなたのコロニーは、25を使用します。ライフサイクルは、環境因子50（ 図2）に応じて4ヶ月に約3週間かかります。

図2
図 2：D. maculatus ラボコロニー。典型的なD. maculatusの虫かごの写真が示されています。木屑は、カブトムシが非表示にできるように広がっています。キャットフードは、小さなペトリ皿または計量ボートに追加されます。発泡スチロールは蛹になるための最終齢幼虫のための避難所としてケージに置かれています。ここに示されているケージは30.5 X 19 X 20.3センチメートル3であり、数百幼虫、蛹、および成人を収容します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. リー成熟ケージの中に卵をVEの。コロニーを展開するには、上記のように、卵（第2節で説明したように収集さ）、幼虫、または大人で新しいケージを確立します。 D. maculatusは、特に食料源の近くに、ケージ全体の卵を産みます。
  2. 週二回程度のウェットキャットフードを交換してください。
    注：これにより、ウェットキャットフードの不快な臭いに、代替の食料源をも試験した（説明を参照）。

2.胚コレクション

  1. コレクションを設定するには、コロニーから少なくとも50人の男性と50人の女性を分離します。若年成人は最高です。木屑ずにミニサイズのケージ（17.8 X 10.2 X 12.7センチメートル3）で大人を置きます。計量ボートにキャットフードを追加します。
  2. コレクションを開始する前に、存在する任意の胚について慎重にケージを確認し、それらを削除します。ケージに延伸されたコットンボールを入れて、30℃のインキュベーター中でケージを残します。適切な時間ウィンドウの後、コットンボールは、胚の収集のための準備が整います。
  3. 折り畳みます折り目を作成し、展開するために半分に黒い画用紙（A4サイズ）の作品。
  4. ケージから延伸コットンボールを削除してください。コットンボールから大人を外し、ケージに戻ってそれらを置きます。
  5. 非常に軽く伸ばしコットンボールをつまんながら、卵は黒い紙の上に落下させるために、薄い綿のフィラメントにゆっくりとそれを引き裂きます。
    注：D. maculatus胚は綿で見ることが脆いとハードです。あまりにもしっかりとコットンボールを保持している場合彼らは簡単に破砕することができます。

3. dsRNAを準備

  1. dsRNAの合成のためのDNAテンプレートの調製
    1. 4実行 - 'の両方5にT7プロモーター配列を含むプライマーを使用して650μlのPCR反応は、製造業者のプロトコルに従ってDNA鋳型を増幅するために終了します。
    2. 製造業者の説明書に従って市販のPCR精製キットを用いてPCR産物を精製します。 DNA鋳型の理想的な最終濃度は≥あります100 ngの/μlの。
  2. インジェクションバッファーの準備
    1. 注射用緩衝液100mlを調製する（0.1ミリモルのNaH 2 PO 4、5mMのKClを）。 5 M NaOHでpHを6.8に調整します。
    2. 分注して-20℃で保管。
  3. dsRNAを合成
    1. 氷上で0.2ミリリットルのPCRチューブ内の反応を設定し、T7ポリメラーゼによるin vitro転写反応を行う、製造者の指示に従って、反応当たり〜500 ngのテンプレートを使用して。
    2. 37℃で一晩チューブをインキュベートします。
    3. 製造業者の指示に従って、DNaseでDNA鋳型を消化します。
    4. 94°Cにチューブを加熱し、3分間94℃で保持します。
    5. それは1時間後に45℃に達するまでのdsRNAをアニールするように、ゆっくりと1℃/分によりチューブを冷却します。
      注：3.3.5を介して3.3.2はサーモサイクラーで行うことができるステップ。
    6. dsRNAのエタノール沈殿物に、280μlを添加します300μlの最終体積に調整する反応を20μlのRNaseを含まない水。 3 MのNaOAc（pH5.2）をエタノール650μlの30μlのを追加します。一晩-20℃の冷凍庫内チューブを置きます。
    7. 4℃で30分間15682×gで遠心分離した後、70％エタノールでのdsRNAペレットを洗浄します。乾燥ペレットを20μl注入緩衝液に溶解します。
    8. 260で分光光度計を用いて、dsRNAの濃度を測定します。 5μgの/μlの - 理想的な濃度は3です。 30分間、90 Vで1％アガロースゲル上でのdsRNAの1：25希釈液5μlを実行することにより、品質を確認してください。予想されるサイズの単一バンドが容易に見ることができます。
    9. -20°Cまたは寒いでのdsRNAを保管してください。
      注：すべてのRNAiのノックダウン実験では、研究されているプロセスに影響を与えると予想されないコントロールのdsRNAを含みます。 GFP dsRNAは、ほとんどの実験のための優れた制御です。 experimeで制御するdsRNAサイドバイサイドを準備し、注入NTALのdsRNA。

マイクロインジェクターとマニピュレーターの4アセンブリ

注： 図3を参照してください。

  1. 空気ポンプ装置の圧力入力に窒素または他の空気供給を接続します。空気ポンプが使用できない場合は、微細な管に接続された50mlの注射器を用いて圧力を加えます。
  2. イジェクト圧力の流れを制御するために、ポンプのリモートコネクタにフットスイッチを接続します。
  3. チューブとポンプの吐出圧ポートにガラスキャピラリーホルダーを取り付けます。
  4. 解剖顕微鏡に近いマイクロマニピュレータにキャピラリーホルダーを固定してください。

5.胚のRNAi

メモ： 図4は D. maculatus胚のRNAiのフローチャートを示しています。

  1. eRNAi準備
    1. シャーレのふた（直径90mm）を収集胚を準備します。 Cに黒のろ紙を置き蓋の内側を超えます。黒い紙の上の標準的な顕微鏡スライドを置きます。
    2. 注射用緩衝液で適当な濃度にするdsRNAを希釈します。最初の実験のための3μgの/μlの - 2を使用してください。常に注射前に氷の上のdsRNAを保ちます。
    3. よく混合するために穏やかに数回のdsRNAとピペットに1：40希釈で食品着色料を追加します。
  2. 注射用胚の収集
    注：25℃では、胚6中の核- 8時間は卵がLayingセッティング後（AEL）53外周卵に向かって移動します。 10時間AEL 53 -細胞性胞胚は8内に設置されています。細胞性胞胚段階の前に胚を注入するために使用されていることを確認するには、0から3時間のAEL胚を使用する53のために推奨されています。ガラスキャピラリーが良い形にしている場合は胚の収集、準備、および注射は通常2未満の時間がかかります。したがって、全体のプロセスは、5時間AEL内に完了することができます。
    1. 手順で説明するように胚を収集2.2-2.5。
    2. シャーレのふたを集めるに胚を転送するために黒の画用紙をタップします。
    3. スライドの縁に沿って両面テープを貼り付けます。
    4. ペイントブラシを使用して、エッジで前方または後方端部とスライドのエッジに垂直テープ上の胚を合わせます。平均の半分が理想的である後端に注入されます、したがってに、初期胚の前方および後方端部が容易に区別できないことに注意してください。
  3. ガラスキャピラリーへのdsRNAのロード
    1. 20μlのmicroloaderピペットチップへのdsRNAの4μlの - 2を取ります。
    2. （針と呼ばれる）前に引っ張らガラスキャピラリーに先端を挿入し、ゆっくりとキャピラリーにdsRNAのソリューションをピペット。マイクロピペットプラーを使用して、市販のガラスキャピラリーから針を準備します。理想引っ張ら針の例が図5に示されています。針の長さとテーパーは、AF最適化する必要があるかもしれませんター注入試験。
    3. ガラスキャピラリーホルダーにガラスキャピラリーを修正しました。
    4. マイクロマニピュレーターにキャピラリーホルダーを組み立てます。
  4. 胚へのdsRNAを注入します
    1. 慎重に解剖顕微鏡のステージ上に胚を含むスライドを転送します。
    2. フィールドと焦点顕微鏡の中央に1胚をもたらすために、スライドを移動します。
    3. 解剖顕微鏡に見ながらマイクロマニピュレータとキャピラリーの先端を置きます。行の最初の胚の終わりに近い先端を持参してください。
    4. 窒素または他の空気供給のスイッチをオンにします。
    5. 真空にソレノイド入力切換スイッチを設定します。
    6. 15 psiの - 10に排出圧力調整器を調整します。装置に応じて圧力を調整します。
    7. 必要に応じて、キャピラリを開きます。先端が開いたら、着色されたdsRNA溶液を、先端を記入します。
    8. 電子メールを穿刺するために前方にキャピラリの先端を移動しますmbryo。圧力設定が理想的である場合、胚性流体は、キャピラリー内に流れません。
    9. ソリューションの適切な量が排出されるまでの胚へのdsRNA液を排出するフットスイッチを踏みます。解決策の適切かつ不適切な量が注入された後、図5は、胚の形態の例を示しています。
    10. 〜2秒間胚の内部にキャピラリー先端を保持し、それを削除します。
    11. 次の胚に毛細管を移動し、繰り返しは5.4.8手順 - すべての胚が注入されるまで、5.4.10を。それは詰まったり壊れてしまった場合ガラスキャピラリーを変更します。
  5. 注射後の回復とインキュベーション
    1. 注入後、ペトリ皿にスライドを配置します。
    2. ペトリ皿に湿ったコットンボールを追加します。コットンボールがスライドを触れないようにしてください。
    3. ペトリ皿を覆い、封止膜とそれを包みます。 dsRNAは、濃度、日付、時刻、および注入された数の名前で皿にラベルを付けます胚。
    4. 胚が孵化するまで30℃のインキュベーター中でペトリ皿を置きます。

6.親のRNAi

  1. pRNAiのための蛹の切り分け
    1. コロニーから蛹を収集します。
    2. 顕微鏡下でソート雄と雌の蛹（ 図6を参照）。何の交配は、注入前に発生していないことを確認するために、30℃のインキュベーター内で二つの別々のペトリ皿に保管してください。
    3. eclosed大人のための毎日確認してください。 30℃で7日間 - 蛹化は通常5かかります。
    4. 転送eclosed雄と雌は、2つの別々のペトリ皿に（ 図6を参照）、これらは注射のための準備が整うまで一日おきに彼らに猫の餌を食べます。
    5. 十分な。女性と男性が適切な年齢であるいったん注入に進んでください。女性4〜8日後の羽化は最高です。典型的な分析のために8 - 女性12名が使用されます。男性の等しい数は54を嵌合するために必要とされています。
    女性の腹部にdsRNAをを注入
    1. 氷上でのdsRNA（5.1.2および5.1.3）を準備します。
    2. 10μlのシリンジに32ゲージの針を取り付けます。
    3. CO 2ステージにメスをAnaesthetize。
    4. 任意の空気を取ることなくシリンジへのdsRNAのソリューションをロードします。
    5. 片手でメスの腹側を保持し、他との注射器を保持します。
    6. 静かに針の先端とsternites 2と3の間segmacoria（膜）を貫通しています。 図7は、注入中の女性を示しています。針が簡単に組織を貫通していない場合、角度針が上向きに、ゆっくりと押し下げます。体内に針の約2ミリメートルを挿入します。
    7. ゆっくりプランジャーを押しながらメスにつき〜2μLを注入し、注射器のスケールを確認してください。
    8. 注入した後、女性の腹部からそれを削除する前に、少なくとも5秒間まだ針を保持します。
    9. （ペトリ皿に注入されたメスの転送90ミリメートル直径）とキャットフードで食べます。
    10. dsRNA名、注入量、日付、および女性の数がペトリ皿にラベルを付けます。
  2. 注射後の回復と交尾
    1. 30℃のインキュベーター中でペトリ皿をインキュベートします。
    2. 24時間後、転送はミニケージにメスを注入しました。
    3. ケージに注射していない若い男性の等しい数を追加し、ケージにラベルを付けます。
    4. ケージに猫の餌と計量ボートを追加します。
    5. 交配を可能にするために、30℃のインキュベーターにケージを残します。 24時間後、雌は卵を産むために開始すべきであるとの胚は、毎日または必要な時間間隔で収集することができます。

7.表現型分析後のRNAi

注：30°Cで、それは50を孵化する卵のために〜55時間かかります。

  1. eRNAi生存率分析
    1. 合計NUに孵化した幼虫の数を比較することにより、孵化率を算出注入された胚のmber。胚が害さまたは注射手順によって殺さすることができるように、負の制御注入を必ず含めてください。 60％ - 典型的な孵化率は30％から変わります。未孵化卵を食べて孵化した幼虫に注意してください。
  2. pRNAi生存率分析
    注：女性の生存率がRNAiにより標的遺伝子の影響を受けている場合は、雌が特定のdsRNAを注射ではなく、陰性対照dsRNAが死ぬことを始めます。産卵または産卵が影響を受けている場合、女性は、部分的または完全な無菌性を示すであろう。陰性対照と比較して、女性の生存をスコアまたは実験およびコントロールの雌（7.2.3）によって産卵数の合計を比較します。
    1. ステップ2.2以下の胚コレクションを設定します。
    2. 2.5から24時間後、手順2.4以下の胚を収集します。
    3. 胚の合計数をカウントします。
    4. 90ミリメートルペトリ皿に胚を移します。標的遺伝子、収集日、及び胚の数でペトリ皿にラベルを付けます。 彼らは孵化するまで30℃のインキュベーターで胚をインキュベートします。未孵化胚に孵化した幼虫フィードので、鉗子を（説明を参照）を使用して、未孵化胚からペトリ皿頻繁に別々の孵化した幼虫を確認してください。
    5. 孵化した胚の数をカウントし、孵化率を計算します。
  3. 孵化幼虫でキューティクルの欠陥を調べます
    1. 1.5ミリリットルマイクロチューブに斜線を付した幼虫を収集します。
    2. ヒュームフードでは、固定ソリューションの1ミリリットルを追加します。
    3. 解決策は、幼虫の組織を貫通させるために、少なくとも一晩4℃でマイクロチューブを残します。
    4. 可視化するために、できる限りチューブからできるだけ多くの固定剤を除去します。
    5. PBSTですすぎ幼虫は、少なくとも3回。
    6. 最後にP-1000ピペットチップを使用してPBSTでマルチウェルガラスプレートに幼虫を移し、それを広げるために切り落としました。
    7. 解剖顕微鏡下で、欠陥を検査するために鉗子を使用して、幼虫を伸ばします。私tは固定液で自分の体契約などの欠陥を検査するために、幼虫を伸ばすことが重要です。
  4. 未孵化幼虫でキューティクルの欠陥を調べます
    注：この手順は、初期胚の表現型の検査のために、特に孵化に生存しない胚のために有用です。
    1. pRNAiについては、ペトリ皿（7.2.4）にPBSTを追加して、最後にP-1000ピペットチップを使用して1.5mlの微小管に未孵化胚を転送遮断します。 eRNAiのために、顕微鏡スライドオフシャーレ（5.5.4）、ブラシ未孵化胚にPBSTを追加し、マイクロ遠心チューブに移します。
    2. 固定ソリューションで胚を修正し、手順7.3.2以下の可視化のためのPBSTでそれらを洗い流し - 7.3.6。
    3. ピンセットを使用して、PBSTで解剖顕微鏡下で卵殻から胚を解剖。
    4. バック1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ（〜各管中の胚を200μl）に胚を移します。
    5. できるだけ多くのゾルを削除しますできるだけution。
    6. 90％の乳酸の1ミリリットル/ 10％エタノールを追加します。少なくとも一晩60℃のインキュベーター中で遠心管を残します。
      注：胚が数日間60℃で放置することができます。
    7. 端がカットオフで胚をマウントするには、P-1000ピペットチップを使用して、顕微鏡スライド上にそれらをピペット。
    8. 手動で理想的な向きに鉗子で胚を置きます。
    9. カバースリップを持つ胚をカバーし、DICを用いて、顕微鏡下で可視化します。
  5. 細胞および分子欠陥を調べます
    注：この手順では、キューティクルの欠陥を伴わないキューティクルの表現型または致死の根本的な原因を調査するために有用です。
    1. pRNAiについては、適切な開発段階でのコットンボールとは別の胚および胚収集バスケットにそれらを転送します。回収バスケットは、同一またはショウジョウバエ胚コレクションに使用されるものと同様とすることができます。
      1. 作ります削除バイアルの底と、蓋（約直径1cm）のうち、円カットと25ミリリットルのプラスチックシンチレーションバイアルからの卵のバスケット。上のシンチレーションバイアルをネジと上下逆さまに使用した後、蓋の内側に直径約2.5センチメッシュ、および超微細の円を置きます。
      2. 胚を洗浄した後、メッシュを容易に除去することができるように、メッシュに付着任意の胚を回収するために水をマイクロ遠心チューブにメッシュを浸します。
    2. eRNAiについては、適切な段階で、ペトリ皿にPBSTを追加します。顕微鏡スライドから胚を磨くとバスケットを収集胚に転送します。
      注：固定は、in situハイブリダイゼーション、抗体染色、及び核染色プロトコールに翔らに記載されています。 2015年53。

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Representative Results

著者らの研究室は、昆虫53,55内のセグメンテーションを制御する遺伝子の機能進化を研究するためにRNAi技術を使用しています。すべての昆虫がセグメント化されているが、このプロセスを制御する遺伝子は、昆虫の放射線26,38,56-63中に発散したと思われます。 ショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングは、身体セグメント64-70の形成を促進するための責任を負う9対ルールセグメント遺伝子のセットを同定しました。ここでは、これらの遺伝子のいずれかのオルソログ、 対になった （PRD）は 、D. maculatusにおける遺伝子機能を研究するためのRNAiの有用性を文書化するために使用されます。

この種では、セグメントの形成にPRD - eRNAiとpRNAiは、各DMACのための役割を実証するのに有効でした。 PRD（ 図8B、8Dと8F - 2 - DMACを標的とするように設計されたdsRNAの3μgの/μlの図8A、8Cおよび8E）陰性対照として注入し、GFPのdsRNAと比較しました。

制御子孫は、セグメントごとに1着色されたストライプハッチ。隣接する色素性ストライプは、非着色ギャップ（ 図8A）によって分離しました。 PRD pRNAi後、影響を受けた子孫は、分節境界が（ 図8B）が不良であった示し、溶融近隣の着色されたストライプハッチ。表現型の重症度に応じて、1つまたはいくつかの融合体は、影響を受ける幼虫で検出されました。それにもかかわらず、融合体は、一貫して対ルールのような欠陥を示す、T2 / T3間の境界領域、A1 / A2、A3 / A4、A5 / A6、A7 / A8に現れました。 PRDノックダウン後のキューティクルの表現型は腹部のセグメントの損失だけでなく、短くボディ長（ 図8D）を示しました。エングレイルド（JA）抗体染色は早期の分子欠陥を調べるために行きましたPRDノックダウン後の胚。制御胚を示したが、すべてのセグメント（ 図8E）で同等の強度で表現備わりストライプ表現備わり減少は、DMAC-PRDのdsRNAから子孫に交互にストライプ状に検出された雌（ 図8Fにアスタリスク）を注入しました。減少エン発現のパターンは、影響を受ける孵化した幼虫で観察された欠陥のクチクラパターンと一致しています。 D. maculatusにおけるPRDノックダウン後の表現型のより詳細な結果を得るために、翔らを参照してください。 2015年53。

図3
図3：噴射装置。 D. maculatus胚を注入するために使用される解剖顕微鏡およびマイクロマニピュレータの写真が示されています。窒素供給は、空気ポンプの圧力入力ポートに接続されています。ガラス毛細管ホルダーはejecに接続されています。ポンプのトンの圧力ポート。フットスイッチは、ポンプに接続されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4：D. maculatus胚のRNAiのためのフローチャート。 （AD）注射用の胚を収集します。女性はコットンボールで胚（オレンジ）（灰色の円）を置きます。別々のコットンボールから胚およびそれらが黒い画用紙の一片の上にドロップしてみましょう。白いバーは、コットンボールで涙を示します。黒い紙を敷いた収集ペトリ皿の蓋に胚を移します。胚へのdsRNAを注入する（E、F）。ダブルスティックテープでスライド上の胚を合わせ、解剖顕微鏡下で個別に注入します。緑色食品色素を有する針を示します。 （GJ）注入後の回復とincubエーション。湿度を提供するために、ペトリ皿に湿ったコットンボールを置きます。ペトリ皿を覆い、フィルム（水色）をシールでそれをラップします。インキュベーター中でペトリ皿を置き、表現型分析のために孵化した幼虫を削除します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5：悪い胚インジェクションの例の対良いです。 （A）非注入胚。 （B）が少なすぎるのdsRNAを注入した胚。 （C）dsRNAの適切な量を注入胚。 （D）のdsRNA過剰注入による溢れるブロークン胚。食品着色料は、可視化のためのdsRNAに追加されました。注射用の針として使用されるプル毛細管の（E）例。テーパー先端の長さfは注意してくださいまたは機能針の2つの例を示します。 ADのスケールバーは200μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6：成人男女と蛹。 （A）オス蛹の腹ビュー。 （A '）A.（A "）のオス蛹の生殖器のイラストの後部の倍率。（B）メス蛹の腹ビュー。（B'）B.雌蛹の後部の倍率が2性器乳頭を持っている（白女性の蛹の生殖器の矢印）。（B "）イラスト。 （C）成人男性の腹ビュー。 （C '）Cの後方部分の拡大図は、成人男性はトライデントのようなされていることを性器と注意します4 回目の腹板上に円形のローブ状の構造（白と黒矢印、それぞれ）。 （D）雌成虫の腹ビュー。 （D '）すべてのパネルについてはD.の後方部分の拡大図は、スケールバーは1ミリメートルを示しています。詳細については、翔らを参照してください。 2015年53。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7：射出時の女性。女性は麻酔し、腹側を上に配置されます。 dsRNAを注入する第二と第三sternites間segmacoriaを貫通する針が示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図8：DMAC-PRD pRNAi後の代表的表現型。 （A）コントロール注入。 3胸部セグメントと10腹節で孵化し、野生型のようなGFP pRNAiの子孫の側面図。各セグメントは、剛毛と色素性ストライプを持っています。 （B）の斜線PRD pRNAiの子孫の側面図。ラベルされた隣り合う着色されたストライプ間の隙間が狭くなったり、完全に欠落しています。 （C）未孵化コントロール野生型のような胚のキューティクル表現型。 （D）より少ない腹部のセグメントを持つ未孵化PRD pRNAiの子孫のキューティクル表現型。 （E、F）から胚帯を切開した：（E）コントロール、GFP pRNAiが均等にすべてのセグメントにエンを表明している、（F）PRD pRNAi、エン式は、代替セグメント（アスタリスク）に還元されます。すべてのウィンドウのためのLS、スケールバーは500μmで示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

洗練されたモデル系（マウス、ハエ、ワーム）の数が少ないが、20 世紀中に開発されたが、21世紀には、世界中の研究室で開発中の新しい動物系の波を見ています。これらの新しいシステムは、科学者が唯一の「標準」モデル系を用いて探索することができません比較、進化の質問に対応することができます。新モデルのこの展開は、迅速な実験室培養方法の開発、遺伝子同定、および新種で機能的なアプローチが必要です。ここでは、実験室および胚のRNAi、親のRNAi、およびこの甲虫における表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルでD. maculatusを飼育するための手順が提示されました。目標は、これらの記述は、独自の実験でD. maculatusを使用すると、追加の新モデル種を開発するためにここに提示アプローチの使用を作るために他の人を励ますことです。

D. maculatusのリットルながら、ABのコロニーが維持するために非常に簡単です、この種の飼育の一つの制限は、食品の彼らのソースとしてカブトムシに与えられたウエットキャットフードの不快臭です。これを避けるために、このようなホエー/大豆プロテインパウダー、チーズ、地上ドッグフード、および粉ミルクなどの代替食品は、湿度を変化させるために湿った綿の有無にかかわらず試験しました。接地ドッグフードは、最も効果的な代替であり、定期的なコロニー供給するために使用することができます。サバイバルは湿った綿の有無にかかわらず、相対湿度80％でちょうどドライドッグフードで飼育ケージ内で卵から大人まで（> 90％）優れた添加しました。卵を大量に収集するときしかし、生殖能力を高めるために卵を収集する際に、ウェットキャットフードと、このダイエットを補充する必要があるかもしれません。ドッグフードを使用する場合は調整さドッグフードは54産卵を阻害することが見出されたように、古い食品は、定期的に除去されるべきです。 71避難所としてドッグフードキブル（KR、予備的な結果）、コルク、木材、紙、および他の材料を使用することもできます。興味深いことに、ゴミムシダマシの甲虫の幼虫を使用して、発泡スチロールの生分解は、72を報告されています。したがって、これは、D. maculatus幼虫について試験しました。ヤングD. maculatus幼虫のみ発泡スチロールやアスベスト含有物質と濡れた綿と成人期まで生存した（データは示されていない）が、彼らは食べて、これらの材料を消化するかどうか決定されていません。

このレポートでは、D. maculatusにおける機能的遺伝学的研究を実施するための第1の詳細なプロトコルです。 RNAiの使用は、ここに新しいモデルシステムにこの技術の拡張を表します。いくつかの具体的な観察はD. maculatusおよびその他の非モデル種におけるRNAiノックダウン実験に関して注目に値します。まず、RNAiはD. maculatusのに有効であることを保証するために、ここで使用されるD. maculatusの同じ菌株を使用すべきです。証拠は、異なる株がのRNAi Pの変化を示すことがコクヌストモドキからありますhenotypes 24,73、および変異体の表現型は、多くの場合、モデル種74-76の遺伝的背景に依存性を示します。また、in situハイブリダイゼーションを含む他のプロトコル、のひずみ依存性のための事例証拠があります。第二に、注射の適切なタイミングはD. maculatusで成功したRNAiのために重要です。キューティクルが完全に硬化したした後にやや反し、segmacoriaは、最も簡単に、少なくとも2日羽化後、貫通しています。したがって、4処女雌 - 8日羽化後には使用すべきです。古い女性が新たにeclosed女性より低い繁殖力を体験するため、注入には適していません。第三に、dsRNAは女性の腹部の内部の圧力によって押し出されるかもしれ注入。注射後のdsRNAの大量を失う可能性を最小限に抑えるには、（6.2.8）を注射後〜5秒間腹部に針を保持し、その後、ゆっくりとそれを削除。一方、中またはまもなく女性の腹部を押す避けます注射後。この問題によって発生偏った結果を回避するために、表現型分析のために（毎日〜200胚）十分な子孫を得るために、各dsRNAのために少なくとも8人の女性を注入。第四に、高い卵の収量は、注射後に表現型分析のために、公正なデータを提供するために重要です。平均して、各D. maculatusの女性は、毎日約35-55胚を生成します。卵の収量は、集団の大きさ、女性の年齢、湿度、食品の可用性、温度（データは示していない）、および他の環境要因54に依存します。通常、女性が25℃よりも30℃以上を置きます。第五に、未孵化胚を孵化した幼虫によりcannibalizedすることができます。未孵化胚は通常、より深刻な影響を受けている間孵化した幼虫としては、通常、野生型のようなまたは唯一の軽度の影響を受けている、D. maculatusの幼虫のこの習慣は、定量的な表現型解析で偏った結果を引き起こす可能性があります。そのため、可能な限り早期に孵化した幼虫の除去を強くお勧めします。

私たちの研究室では、この種を含む生理、生態、そして大きな関心の害虫駆除・アールの多くの側面が、D. maculatusセグメンテーションに焦点を当てています。胚発生およびセグメンテーションを研究するため、D. maculatusの幼虫の背側に暗く着色された一連のストライプは、異常な開発のための自然なマーカーとして役立つことができます。また、幼虫の着色されたストライプに根ざし特性剛毛セグメントの指標として用いることができます。これらの形態学的特徴は、一緒に軽度または中等度に影響を受けた胚は孵化に生き残ることができる知見と、基本的なボディープランをパターニングに関与するメカニズムを研究するためのD. maculatusモデルの利点です。

最後に、高度に制御された実験-含む負の制御などのGFPのdsRNAなどを実施し、それぞれのための2つの非重複標的領域をテストすることの重要性に起因effecに誤解を避けるために重要な遺伝子は、ありますそれ自体は注射のTSおよびオフターゲット効果。 D. maculatusの場合は、4から6μgの（/μlの2または3μgの2μlの）dsRNAは、各女性に注入し、dsRNAは、200〜250 bpの長さでした。金額やプロトコルの他の詳細は、開発中または異なる生理学的/代謝プロセスの後半で機能する遺伝子を標的場合、最適化する必要があるかもしれません。以前の発見は、CのF1世代は15 エレガンス超えRNAi効果を次の世代に渡すことができることを示しました。 RNAiによるセグメンテーション欠陥の斜線のD. maculatusの幼虫の少数派は、成人期まで生き残ることができると再生することができます。予備実験は、F2世代の明らかな欠陥を明らかにすることができませんでした。今後の研究は、この種におけるRNAiの世代間の影響を明らかにすることができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

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References

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隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em
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Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

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