Summary
Ici, nous présentons des protocoles d'élevage un coléoptère intermédiaire germe, Dermestes maculatus (D. maculatus) dans le laboratoire. Nous partageons également des protocoles pour l'embryon et des parents ARNi et méthodes pour l'analyse des phénotypes embryonnaires pour étudier la fonction des gènes de cette espèce.
Introduction
En 1998, le feu et Mello ont rapporté que l' ARN double brin (ARNdb) peut induire l' inhibition de la fonction des gènes dans Caenorhabditis elegans 1. Cette réponse déclenchée par l' ARN double brin a été appelé ARN interférence (ARNi), et un tel silençage génique à médiation par ARNi a été rapportée être conservée chez les animaux, les plantes et les champignons de 2-7. Chez les plantes et certains animaux, les fonctions ARNi systémique, ce qui signifie que l'effet peut se propager à d' autres cellules / tissus où ARNdb est pas directement introduit (revue dans 8-10). Les scientifiques ont fait usage de cette réponse ARNi cellulaire endogène en concevant ARNdb pour cibler des gènes d'intérêt, ce qui frappe vers le bas la fonction du gène sans manipuler directement le génome (revue dans 11-14).
L'ARNi est un outil puissant pour des études fonctionnelles en raison des avantages suivants. Tout d'abord, même avec des informations sur la séquence du gène minimum, un gène peut être ciblé en utilisant l'ARNi. Ceci est particulièrement important pour les rudies d'organismes non-modèles dépourvus de données génomiques ou transcriptomiques. D'autre part, dans les organismes où la réponse ARNi est robuste systémique, knock-down de gènes à médiation par ARNi peut être réalisée à pratiquement n'importe quel stade de développement. Cette fonctionnalité est très utile pour étudier la fonction des gènes pléiotropiques. Troisièmement, dans certains cas, les effets ARNi se propagent aux gonades et descendants, tels que les phénotypes sont observés chez la progéniture 15,16. Ce phénomène, connu sous le nom ARNi parental (pRNAi), est particulièrement avantageux pour les gènes impact sur le développement embryonnaire, aussi nombreux descendants produits par un seul parent injecté peut être examinée sans manipulation directe des œufs. Pour ces raisons, pRNAi est la méthode de choix. Toutefois, si pRNAi est inefficace, par exemple pour les gènes nécessaires à l'ovogenèse, puis embryonnaires ARNi (eRNAi) doit être utilisé. Quatrièmement, l'ARNi peut être utilisé pour générer l'équivalent d'une série allélique en ce que la quantité d'ARNdb livré peut varier sur une plage pour produire faible pour les défauts forts. Une telle gradation des phénotypes peut être utile pour la compréhension de la fonction des gènes lorsque le gène est impliqué dans un processus complexe et / ou la perte complète de la fonction est létale. Cinquièmement, la livraison d'ARNdb est généralement facile et réalisable, en particulier chez les animaux montrant robustes réponses systémiques ARNi. ARNdb peut être introduit par microinjection 1,5, l' alimentation / l' ingestion 17,18, 19,20 trempage et le virus de la livraison / bactéries médiée 21,22. Sixième, à la différence des méthodes de ciblage / d'édition de gènes, il n'y a pas besoin de dépister les organismes porteurs de la mutation ou de procéder à des croisements génétiques pour générer des homozygotes lors de l'utilisation d'ARNi. Par conséquent, par rapport à de nombreuses autres techniques pour étudier la fonction des gènes, l' ARNi est rapide, peu coûteuse et peut être appliqué pour les écrans de grande envergure 23-25.
La grande utilité de l'ARNi fournit des moyens de réaliser des études fonctionnelles dans un large éventail d'organismes, en élargissant la gamme des espèces disponibles pour l'étude beyond les systèmes modèles traditionnels pour lesquels des outils génétiques ont été développés. Par exemple, des études utilisant des systèmes non-modèle sont tenus de donner un aperçu de l'évolution des gènes et des réseaux de gènes en comparant les fonctions de orthologues d'espèces représentant différents modes de développement ou présentant des caractéristiques morphologiques distinctes 26-29. Ces types d'études fourniront une meilleure compréhension de la diversité biologique, avec des impacts de la recherche à la fois fondamentale et appliquée.
Étant le plus grand groupe d'animaux sur la planète, les insectes fournissent une excellente occasion d'explorer les mécanismes de la diversité sous-jacente. En outre, les insectes sont généralement de petite taille, ont des cycles de vie courts, une fécondité élevée, et sont faciles à élever en laboratoire. Au cours des deux dernières décennies, l' ARNi a été appliquée avec succès dans les insectes couvrant les commandes, y compris les diptères (mouches vraies) 5, lépidoptères (papillons et mites) 30, coléoptères (scarabées) 16,31, hyménoptères (Sawfmensonges, les guêpes, les fourmis et les abeilles) 32, Hemiptera (punaises), isoptères (termites) 34, Blattodea (cafards) 35, orthoptères (grillons, sauterelles, criquets et sauterelles) 36 et Phthiraptera (poux) 37. L' application réussie de l' ARNi a fourni des données fonctionnelles pour les études de structuration dans l' embryogenèse précoce (antéro-postérieur axe 32, dorso-ventral axe 28, segmentation 26,38), la détermination du sexe 39,40, chitine / cuticule biosynthèse 41, ecdysone de signalisation 42, comportement social 43, et plus encore. Méthodes d' ARNi développées pour différentes espèces d'insectes peuvent être d'avantage supplémentaire en ce sens qu'elles sont susceptibles d'être utiles pour la lutte antiparasitaire (passé en revue dans 44-46). les effets d'ARNi seront aussi bien que spécifique de l'espèce spécifique du gène, aussi longtemps que les régions non conservées sont choisies pour le ciblage. Pour les espèces d'insectes bénéfiques comme les abeilles et les vers à soie, en ciblant les gènes vitaux pour la survie devirus ou des parasites pour contrôler l' infection peuvent fournir une nouvelle stratégie visant à protéger ces espèces 47,48.
Dermestes maculatus (D. maculatus), nom commun hide scarabée, est distribué dans le monde entier à l' exception de l' Antarctique. Comme un insecte holométabole, le cycle de vie D. maculatus comprend embryonnaire, larvaire, pupe et stades adultes (Figure 1). Parce qu'il se nourrit de chair, D. maculatus est utilisé dans les musées à squelettage animaux morts et entomologistes médico - légale peut l' utiliser pour estimer le temps de la mort 49,50. D. maculatus se nourrit de produits d'origine animale , y compris les carcasses, la viande séchée, du fromage et des pupes / cocons d'autres insectes et provoque ainsi des dommages aux ménages, les aliments stockés, et la soie, le fromage et les industries de la viande 51,52. L'application de l'ARNi dans ce coléoptère pourrait fournir un moyen efficace et respectueux de l'environnement afin de minimiser son impact économique. Notre laboratoire a utilisé D. maculatus comme une nouvelle model insectes pour étudier la segmentation 53. En plus d'être prête à l' élevage de laboratoire, D. maculatus est d'intérêt pour la recherche fondamentale car elle est un développeur intermédiaire germe, ce qui en fait une espèce utile pour étudier la transition entre court et le développement à long germe.
Figure 1: Cycle de vie de D. maculatus. Photographies de D. maculatus à différents stades de la vie, comme indiqué. Le cycle de vie de l'œuf à l'adulte dure trois semaines à 30 ° C mais plus à des températures plus basses. (A, F) des embryons fraîchement pondus sont blancs à jaune clair et ovales, d' environ 1,5 mm de longueur. Embryogenèse prend ~ 55 heures à 30 ° C. (B, C et G) Larves ont des rayures pigmentées sombres et sont recouverts de soies. Les larves passent par plusieurs stades en fonction de l'environnement et leur longueur peut aller jusqu'à plus de 1 cm. (D, H) (E, I) Peu de temps après l' éclosion, la pigmentation foncée apparaît sur le corps de coléoptère adulte. Les adultes peuvent vivre jusqu'à plusieurs mois et une femelle peut pondre des centaines d'embryons au cours de sa vie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Auparavant, nous avons montré que l' ARNi est efficace pour abattre la fonction du gène dans D. maculatus 53. Voici notre expérience d' élevage colonies D. maculatus dans le laboratoire est partagé avec les protocoles étape par étape pour RNAi set-up à la fois embryonnaire et parental, l' injection, les soins post-injection, et l' analyse phénotypique. Les knockdown et méthodes d' analyse de gènes ARNdb médiées introduits ici non seulement fournir des informations détaillées pour aborder les questions de D. maculatus, mais aussi avoir une signification potentielle for l'application de l'ARNi dans d'autres espèces d'insectes / non-modèle coléoptères.
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Protocol
1. cabrer de D. maculatus
NOTE: Une colonie de reproduction de D. maculatus a été mis en place dans le laboratoire des auteurs utilisant les adultes et les larves acheté dans le commerce. L'identité de l' espèce a été vérifiée en utilisant l' ADN barcoding 53.
- Pour mettre en place une nouvelle cage dans le laboratoire, étaler une fine couche de copeaux de bois dans une cage d' insectes de taille moyenne (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Placer un morceau cm 3 ~ 10 x 6 x 3 de styromousse dans la cage pour laisser les larves cacher pour nymphose. Ajouter 20 - 50 coléoptères (adultes ou larves de dernier stade larvaire). Coléoptères se cacher dans les copeaux de bois.
- Ajouter humide nourriture pour chat dans une boîte de Pétri ou un bateau de pesage. Couvrir la cage avec un tissu à mailles et de placer la cage dans un incubateur.
- Pour le maintien d'une colonie de reproduction dans le laboratoire, régler la température entre 25 et 30 ° C. D. maculatus croît plus rapidement à des températures plus élevées, mais cela favorise aussi la croissance des champignons et des acariens. Pour maintenir un guérirta colonie, utilisez 25-28 ° C pour l'entretien régulier des stocks et 30 ° C pour l'expansion rapide de la colonie. Le cycle de vie prend environ trois semaines à quatre mois en fonction de facteurs environnementaux 50 (figure 2).
Figure 2: D. maculatus Lab Colony. Photographie d'un type d' insecte cage D. maculatus est représenté. Copeaux sont répartis de laisser les coléoptères se cachent. La nourriture pour chats est ajouté dans une petite boîte de Pétri ou d'un bateau de pesage. Styrofoam est placé dans la cage comme un refuge pour les larves de dernier stade de pupaison. La cage montrée ici est 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 et abrite quelques centaines de larves, pupes et adultes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Leave oeufs dans la cage à mûrir. Pour étendre la colonie, établir de nouvelles cages avec des oeufs (collectés comme décrit dans la section 2), les larves ou les adultes, comme ci-dessus. D. maculatus pondent des œufs tout au long de la cage, en particulier près de la source de nourriture.
- Remplacer aliments humides pour chats environ deux fois par semaine.
NOTE: En raison de l'odeur désagréable des aliments humides pour chats, sources de nourriture ont également été testés (voir Discussion).
2. Embryon Collection
- Pour mettre en place une collection, séparer au moins 50 hommes et 50 femmes de la colonie. Les jeunes adultes sont les meilleurs. La place des adultes dans un mini-taille cage (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) sans copeaux de bois. Ajouter la nourriture pour chat dans un bateau de pesage.
- Avant la collecte de commencer, vérifiez la cage avec soin pour les embryons présents et de les supprimer. Mettre une boule de coton étiré dans la cage, et de laisser la cage dans un incubateur à 30 °. Après la fenêtre de temps appropriée, la boule de coton sera prêt pour la collecte d'embryons.
- Plierun morceau de papier de construction noir (format A4) en deux pour créer un pli, puis déplier.
- Retirez la boule de coton étiré de la cage. Retirer les adultes de la boule de coton et de les remettre dans la cage.
- Bien pincer la boule de coton étiré très doucement, lentement déchirer en minces filaments de coton pour laisser les oeufs tombent sur le papier noir.
REMARQUE: les embryons D. maculatus sont fragiles et difficiles à voir dans le coton. Ils peuvent être facilement écrasés si tenant la boule de coton trop fermement.
3. ARNdb Préparation
- Modèle de préparation d' ADN pour la synthèse d' ARN double brin
- Exécuter 4 - 6 réactions de PCR de 50 ul en utilisant des amorces contenant des séquences promoteur T7 aux deux extrémités 5 'pour amplifier la matrice d'ADN selon le protocole du fabricant.
- Purifier produit de PCR utilisant un kit commercial de purification PCR, suivant les instructions du fabricant. La concentration finale idéale de la matrice d'ADN est ≥100 ng / pl.
- Injection Buffer Préparation
- Préparer 100 ml de tampon d'injection (0,1 mM de NaH 2 PO 4, KCl 5 mM). Ajuster le pH à 6,8 avec NaOH 5M.
- aliquotes de conserver à -20 ° C.
- ARNdb Synthèse
- Mettre en place une réaction dans un tube de 0,2 ml PCR sur la glace et procéder à une réaction de transcription in vitro avec la T7 polymerase, suivant les instructions du fabricant, en utilisant ~ 500 modèle ng par réaction.
- Incuber le tube à 37 ° C pendant une nuit.
- Digest de la matrice d'ADN avec de la DNase, suivant les instructions du fabricant.
- Chauffer le tube à 94 ° C et maintenir à 94 ° C pendant 3 min.
- Pour recuire le ARNdb, refroidir lentement le tube de 1 ° C / min jusqu'à ce qu'il atteigne 45 ° C après 1 h.
REMARQUE: Les étapes 3.3.2 à travers 3.3.5 peut être réalisée dans un thermocycleur. - Pour l'éthanol précipité d'ARNdb, ajouter 280 pide RNase eau libre de 20 pi de réaction pour ajuster à un volume final de 300 pi. Ajouter 30 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) et 650 pi d'éthanol. Placez le tube à -20 ° C congélateur pendant la nuit.
- Après centrifugation à 15.682 xg pendant 30 min à 4 ° C, laver le culot ARNdb avec 70% d'éthanol. granulés secs et se dissolvent dans 20 pi de tampon d'injection.
- Mesurer la concentration de l'ARN double brin à l' aide d' un spectrophotomètre à 260 A. La concentration idéale est le 3 - 5 ug / ul. Vérifier la qualité en exécutant 5 ul d'une dilution 1:25 de l'ARN double brin sur un gel d'agarose à 1% à 90 V pendant 30 min. Une seule bande de taille attendue sera facilement visible.
- Stocker l'ARNdb à -20 ° C ou moins.
NOTE: Pour chaque expérience knockdown ARNi, inclure un contrôle ARNdb, qui ne serait pas prévu d'influer sur le processus de l'étude. gfp ARNdb est un excellent contrôle pour la plupart des expériences. Préparer et injecter les ARNdb de commande côte à côte avec le experimental ARNdb.
4. Assemblée des microinjecteur et Micromanipulateur
REMARQUE: Voir la figure 3.
- Connecter l'azote ou un autre apport d'air à l'entrée de pression d'un instrument de pompe pneumatique. Si une pompe pneumatique ne sont pas disponibles, appliquer une pression à l'aide d'une seringue de 50 ml relié à un tube fin.
- Branchez un commutateur au pied à la prise à distance de la pompe pour contrôler le flux de pression d'éjection.
- Fixer un support de capillaire en verre à l'orifice de pression d'éjection de la pompe à tube.
- Fixer le support capillaire sur un micromanipulateur à proximité d'un microscope à dissection.
5. Embryonic ARNi
REMARQUE: La figure 4 montre un organigramme de D. maculatus embryonnaire ARNi.
- eRNAi Préparation
- Préparer un embryon collecte boîte de Pétri couvercle (diamètre 90 mm). Placez un morceau de papier filtre noir pour csur l'intérieur du couvercle. Mettez une lame de microscope standard sur le papier noir.
- Diluer ARNdb à la concentration appropriée avec un tampon d'injection. Utilisez 2 - 3 pg / pl pour les premières expériences. Toujours garder ARNdb sur la glace avant l'injection.
- Ajouter le colorant alimentaire à 1h40 dilution à l'ARNdb et pipette doucement plusieurs fois pour bien mélanger.
- Embryons Collecte pour injection
NOTE: A 25 ° C, les noyaux d'embryons 6 - 8 h Après la ponte (AEL) migrent vers l'ovule périphérie 53. Un blastoderme cellulaire est établi dans 8-10 heures AEL 53. Pour assurer des embryons avant le stade de blastoderme cellulaire sont utilisés pour l' injection, 0-3 h embryons AEL sont recommandés pour une utilisation 53. collection Embryo, la préparation et l'injection prennent habituellement moins de 2 heures si les capillaires en verre sont en bonne forme. Par conséquent, l'ensemble du processus peut être achevé dans les 5 heures AEL.- Recueillir des embryons comme décrit dans les étapes 2.2-2.5.
- Appuyez sur le papier de construction noir pour transférer les embryons dans la collecte de boîtes de Petri couvercle.
- Collez ruban adhésif double face le long du bord de la diapositive.
- L'utilisation d'un pinceau, d'aligner les embryons sur la bande perpendiculaire au bord coulissant avec la partie antérieure ou postérieure extrémité au bord. On notera que les extrémités antérieure et postérieure des embryons précoces ne sont pas faciles à distinguer, donc en moyenne la moitié sera injecté à l'extrémité postérieure qui est idéal.
- Chargement du ARNdb dans le verre Capillaire
- Prenez 2 - 4 pi de ARNdb dans une pointe microloader de pipette 20 pi.
- Insérer la pointe dans un capillaire pré-tiré verre (appelée aiguille) et doucement la pipette la solution ARNdb dans le capillaire. Préparer des aiguilles à partir de tubes capillaires en verre commerciaux au moyen d'un étirage de micropipettes. Un exemple d'une aiguille tirée idéale est représentée sur la figure 5. La longueur et cône d'aiguilles peuvent avoir besoin d'être optimisé afessais d'injection de ter.
- Fixer le capillaire en verre dans le support de tube capillaire en verre.
- Assembler le support capillaire dans le micromanipulateur.
- Injecter ARNdb dans Embryons
- transférer délicatement la lame avec des embryons sur la scène du microscope de dissection.
- Déplacez le curseur pour amener un embryon au centre du terrain et de se concentrer microscope.
- Placez la pointe du capillaire avec le micromanipulateur tout en regardant dans le microscope de dissection. Apportez la pointe près de la fin du premier embryon de la ligne.
- Allumez l'azote ou une autre alimentation en air.
- Réglez le solénoïde sélecteur d'entrée à vide.
- Régler le régulateur de pression d'éjection à 10-15 psi. Régler la pression en fonction de l'appareil.
- Ouvrez le capillaire si nécessaire. Une fois que la pointe est ouvert, la solution colorée ARNdb remplira la pointe.
- Déplacez la pointe capillaire avant de percer le embryo. Si le réglage de la pression est idéal, pas de liquide embryonnaire coulera dans le capillaire.
- Étape sur le commutateur au pied pour éjecter la solution ARNdb dans l'embryon jusqu'à ce qu'une quantité appropriée de la solution est éjectée. La figure 5 montre des exemples de l' embryon après la morphologie des quantités appropriées et inappropriées de solution ont été injectés.
- Gardez la pointe capillaire à l'intérieur de l'embryon pour ~ 2 sec, puis retirez-le.
- Déplacer le capillaire à l'autre embryon et répétez les étapes 5.4.8 - 5.4.10 jusqu'à ce que tous les embryons sont injectés. Changer capillaire en verre si elle est bouché ou les pauses.
- Récupération post-injection et incubation
- Après l'injection, placer la lame dans une boîte de Pétri.
- Ajouter une boule de coton humide pour la boîte de Pétri. Ne laissez pas la boule de coton toucher la lame.
- Couvrir la boîte de Pétri et l'envelopper avec le film d'étanchéité. Etiqueter le plat avec le nom de l'ARNdb, la concentration, la date, l'heure, et le nombre d'injectionembryons.
- Placez la boîte de Pétri dans un 30 ° C incubateur jusqu'à ce que la trappe d'embryons.
6. ARNi parental
- Isoler pupes pour pRNAi
- Collecter les pupes de la colonie.
- Trier les hommes et les pupes femme au microscope (voir Figure 6). Gardez-les dans deux boîtes de Petri séparées dans un incubateur à 30 ° pour garantir qu'aucun accouplement a lieu avant l'injection.
- Vérifiez tous les jours pour les adultes éclos. La nymphose a généralement 5 - 7 jours à 30 ° C.
- Transfert éclos mâles et les femelles (voir Figure 6) à deux boîtes de Petri séparées et les nourrissent la nourriture pour chat tous les jours jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour l' injection.
- Passez à l'injection une fois il y a suffisamment de femmes et d'hommes à l'âge approprié. Les femelles 4 à 8 jours post-Eclosion sont les meilleurs. Pour une analyse typique, 8 - 12 femelles sont utilisées. Un nombre égal de mâles sont nécessaires pour l' accouplement 54.
- Préparer ARNdb sur la glace (5.1.2 et 5.1.3).
- Fixer une aiguille 32 gauge à une seringue de 10 ul.
- Anesthésier femelles sur le CO 2 stade.
- Chargez solution ARNdb dans la seringue sans prendre l'air.
- Tenir une face ventrale femme avec une main et tenir la seringue avec l'autre.
- pénétrer doucement la segmacoria (membrane) entre sternites 2 et 3 avec la pointe de l'aiguille. La figure 7 montre une femme lors de l' injection. Si l'aiguille ne pénètre pas dans le tissu facilement, l'angle de l'aiguille vers le haut et appuyez doucement. Insérer environ 2 mm de l'aiguille dans le corps.
- Vérifiez l'échelle de la seringue tout en poussant lentement le piston, l'injection ~ 2 pi par femelle.
- Après l'injection, maintenez l'aiguille encore pendant au moins 5 secondes avant de le retirer de l'abdomen de la femelle.
- Transférer les femelles injectées à une boîte de Pétri (90 mm de diamètre) et se nourrir avec de la nourriture pour chats.
- Étiquette de la boîte de Pétri avec le nom ARNdb, quantité injectée, la date, et le nombre de femelles.
- Récupération post-injection et Mating
- Incuber la boîte de Petri dans un incubateur à 30 °.
- Après 24 heures, le transfert injecté femelles à un mini-cage.
- Ajouter à la cage un nombre égal de jeunes mâles non-injecté, et étiqueter la cage.
- Ajouter un bateau de pesage avec de la nourriture pour chat dans la cage.
- Laisser la cage dans un incubateur à 30 ° afin de permettre l'accouplement. Après 24 heures, les femmes devraient commencer à pondre des œufs et les embryons peuvent être collectés quotidiennement ou à intervalles de temps requis.
7. Analyse phénotypique après ARNi
NOTE: A 30 ° C, il faut ~ 55 h pour les œufs éclosent 50.
- Analyse eRNAi Viabilité
- Calculer le taux d'éclosion en comparant le nombre de larves écloses à nu totalembre des embryons injectés. Assurez-vous d'inclure une injection de contrôle négatif que les embryons peuvent être lésés ou tués par la procédure d'injection. taux d'éclosion typiques varient de 30% - 60%. Méfiez-vous des larves écloses de manger des œufs non éclos.
- Analyse pRNAi Viabilité
NOTE: Si la viabilité des femmes est affectée par le gène ciblé par l'ARNi, les femelles injectées avec ARNdb spécifique, mais pas un contrôle négatif ARNdb vont commencer à mourir. Si la production d'œufs ou de ponte est touchés, les femelles présentent une stérilité partielle ou complète. Note de survie des femelles par rapport aux témoins négatifs ou comparer le nombre total d'œufs pondus par les femelles expérimentales et de contrôle (7.2.3).- Mettre en place la collecte des embryons après l'étape 2.2.
- Après 24 h, de recueillir des embryons en suivant les étapes 2.4 - 2.5.
- Compter le nombre total des embryons.
- Transférer les embryons dans une boîte de Petri de 90 mm. Etiqueter la boîte de Pétri avec le gène ciblé, la date de collecte, et le nombre d'embryons. Incuber les embryons dans un incubateur à 30 ° jusqu'à ce qu'ils éclosent. Depuis éclos larves se nourrissent sur les embryons non éclos, consultez la boîte de Pétri de larves fréquemment et séparés issus d'embryons non éclos en utilisant une pince (voir Discussion).
- Comptez le nombre d'embryons éclos et de calculer le taux d'éclosion.
- Défauts examen cuticule dans Hatched Larves
- Recueillir les larves hachurée dans un tube de 1,5 ml.
- Dans une hotte, ajouter 1 ml de solution de fixation.
- Laisser le tube de microcentrifugeuse à 4 ° C au moins pendant la nuit pour laisser la solution pénétrer le tissu larvaire.
- Pour visualiser, supprimer autant fixateur du tube que possible.
- Rincer les larves au moins trois fois avec PBST.
- Transfert des larves à une plaque de verre multi-puits avec du PBST en utilisant une pointe de pipette P-1000 avec la fin coupée pour l'élargir.
- Sous un microscope à dissection, étirer les larves en utilisant des pinces pour examiner les défauts. jet est critique pour étirer les larves d'examiner les défauts que leur contrat de corps dans le fixateur.
- Défauts examen cuticule dans unhatched Larves
Remarque: Cette procédure est utile pour l'examen des phénotypes embryonnaires précoces, en particulier pour les embryons qui ne survivent pas à l'éclosion.- Pour pRNAi, ajouter PBST dans la boîte de Pétri (7.2.4) et transférer les embryons non éclos à un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P-1000 avec la fin coupée. Pour eRNAi, ajouter PBST dans la boîte de Pétri (5.5.4), brosse embryons non éclos de la lame de microscope et de les transférer dans un tube à centrifuger.
- Fixer les embryons avec fixation Solution et les rincer à l'PBST pour la visualisation suivant les étapes 7.3.2 - 7.3.6.
- En utilisant des pinces, disséquer les embryons hors de la coquille d'oeuf sous un microscope à dissection dans le PBST.
- Transférer les embryons de retour à 1,5 ml microtube (~ 200 pi d'embryons dans chaque tube).
- Retirer autant solution que possible.
- Ajouter 1 ml de 90% d'acide lactique / 10% d'EtOH. Laisser le tube de centrifugeuse dans un incubateur à 60 ° au moins pendant une nuit.
NOTE: Embryons peut être laissé à 60 ° C pendant plusieurs jours. - Pour monter les embryons, la pipette les sur une lame de microscope en utilisant une pointe de pipette P-1000 avec la fin coupée.
- positionner manuellement les embryons avec des pinces pour une orientation idéale.
- Couvrir les embryons avec une lamelle et visualiser au microscope en utilisant DIC.
- Examen des défauts cellulaires et moléculaires
NOTE: Cette procédure est utile pour enquêter sur les causes sous-jacentes des phénotypes cuticule ou létalité qui ne sont pas accompagnés par des défauts de la cuticule.- Pour pRNAi, les embryons séparés des boules de coton au stade de développement approprié et de les transférer dans un embryon panier collecteur. Le panier collecteur peut être identique ou similaire à celui utilisé pour les collections d'embryon de drosophile.
- Fairele panier d'oeufs à partir d'une matière plastique de 25 ml flacon à scintillation avec le fond du flacon enlevé, et une découpe circulaire sur le couvercle (environ 1 cm de diamètre). Placer un cercle de super fine maille d'environ 2,5 cm de diamètre à l'intérieur du couvercle, puis visser le flacon de scintillation et d'utiliser l'envers.
- Comme le maillage peut être facilement retiré une fois que les embryons sont lavés, immergez le maillage dans un tube à centrifuger avec de l'eau pour récupérer des embryons coller à la maille.
- Pour eRNAi, au stade approprié, ajouter PBST à la boîte de Pétri. Badigeonner les embryons de la lame de microscope et de les transférer à un panier embryon de collecte.
REMARQUE: La fixation, l'hybridation in situ, la coloration des anticorps, et des protocoles de coloration nucléaire peut être trouvée dans Xiang et al. 2015 53.
- Pour pRNAi, les embryons séparés des boules de coton au stade de développement approprié et de les transférer dans un embryon panier collecteur. Le panier collecteur peut être identique ou similaire à celui utilisé pour les collections d'embryon de drosophile.
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Representative Results
Le laboratoire des auteurs a utilisé la technologie ARNi pour étudier l'évolution fonctionnelle des gènes régulant la segmentation chez les insectes 53,55. Alors que tous les insectes sont segmentés, les gènes régulant ce processus semblent avoir divergé au cours des radiations d' insectes 26,38,56-63. Écrans génétiques chez la drosophile ont identifié un ensemble de neuf pair-rule gènes de segmentation qui sont responsables de la promotion de la formation des segments du corps 64-70. Ici, l'orthologue de l' un de ces gènes, apparié (prd), est utilisé pour documenter l'utilité de l' ARNi pour étudier la fonction des gènes dans D. maculatus.
eRNAi et pRNAi ont chacun été efficace dans la démonstration de rôles pour DMAC - prd dans la formation du segment dans cette espèce. 2 - 3 pg / pl d'ARNdb conçu pour cibler dmac - prd (figures 8B, 8D et 8F gfp ARNdb, injecté comme témoin négatif (figures 8A, 8C et 8E).
progéniture contrôle éclos avec une bande pigmentée par segment. Pigmentés bandes voisines sont séparées par un intervalle non pigmentée (figure 8A). Après prd pRNAi, progéniture affectée éclos avec des bandes pigmentées voisins fusionnées, indiquant les limites segmentaires étaient défectueuses (figure 8B). En fonction de la gravité phénotypiques, une ou plusieurs fusions ont été détectés chez les larves affectées. Néanmoins, des fusions toujours apparues dans les régions limitrophes entre T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, indiquant les défauts paire de règles similaires. Phénotypes cuticules après knockdown prd ont montré une perte de segments abdominaux, ainsi que la longueur du corps raccourci (Figure 8D). Engrailed (Fr) coloration d'anticorps a été réalisée pour examiner les défauts moléculaires au débutembryons après knockdown prd. Alors que les embryons de contrôle ont montré à rayures En expression avec une égale intensité dans tous les segments (figure 8E), une expression réduite En a été détectée dans des bandes alternées dans la progéniture de DMAC-prd ARNdb injecté femelles (astérisques dans la figure 8F). Le motif de l'expression réduite En est compatible avec le motif de la cuticule défectueuse observée chez les larves écloses touchés. Pour des résultats plus détaillés de phénotypes après knockdown prd en D. maculatus, voir Xiang et al. 2015 53.
Figure 3: Appareil d'injection. Photo du microscope de dissection et micromanipulateur utilisée pour injecter des embryons D. maculatus est montré. Azote d'alimentation est connecté au port d'une pompe pneumatique d'entrée de pression. support de capillaire en verre est reliée à la eject orifice de pression de la pompe. Interrupteur au pied est raccordé à la pompe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: un organigramme pour D. maculatus Embryonic ARNi. (AD) La collecte d' embryons pour l' injection. Les femelles pondent des embryons (orange) dans des boules de coton (cercle gris). embryons séparés de boules de coton et laissez-les tomber sur un morceau de papier de construction noir. Les barres blanches indiquent des larmes dans la boule de coton. embryons de transfert à une boîte de Petri collecte couvercle, recouverte de papier noir. (E, F) Injecter ARNdb dans des embryons. Aligner les embryons sur des lames sur ruban adhésif double et injecter individuellement sous un microscope à dissection. Aiguille avec un colorant alimentaire vert est affiché. (GJ) post injection récupération et Incubation. Placez une boule de coton humide dans la boîte de Pétri pour fournir l'humidité. Couvrir la boîte de Pétri et l'envelopper avec le film (bleu clair) d'étanchéité. Placez la boîte de Petri dans un incubateur et éliminer les larves écloses pour l'analyse phénotypique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Bon contre Bad Embryonic Exemples d'injection. Embryon (A) non injectée. (B) Embryo injecté avec trop peu ARNdb. (C) Embryo injecté avec une quantité appropriée de ARNdb. (D) de l' embryon brisé à débordement ARNdb causée par over-injection. colorant alimentaire a été ajouté à ARNdb pour la visualisation. (E) Des exemples de tubes capillaires élongations utilisés comme aiguilles pour injection. Notez le cône et la longueur de la pointe fou deux exemples d'aiguilles fonctionnelles. Les barres d'échelle pour AD représentent 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Homme et adultes Femme et pupes. (A) Vue ventrale d'une pupe masculine. (A ') Grossissement de la partie postérieure de A. (A ") Illustration de mâle pupe organes génitaux. (B) Vue ventrale d'une pupe femelle. (B') Grossissement de la partie postérieure de B. Femme pupes ont deux papilles génitales (blanc flèches). (B ") Illustration de la femme pupe organes génitaux. (C) Vue ventrale d'un adulte de sexe masculin. (C ') vue grossie d' une partie postérieure de C. Notez que les adultes de sexe masculin ont trident comme les organes génitaux et unstructure circulaire de lobe-like sur les 4 e sternite (flèches blanches et noires, respectivement). (D) Vue ventrale d'une femelle adulte. (D ') vue grossie d' une partie postérieure de D. Pour tous les panneaux, barres d'échelle indiquent 1 mm. Pour plus de détails, voir Xiang et al. 2015 53. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Une Femme lors de l' injection. Les femelles sont anesthésiés et placés ventrale vers le haut. Une aiguille pénétrant dans les segmacoria entre les 2e et 3e sternites pour injecter ARNdb est affiché. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: phénotypes représentatifs après pRNAi dmac-prd. Injection (A) Contrôle. Vue latérale d'un type sauvage comme gfp pRNAi descendants éclos avec trois segments thoraciques et dix segments abdominaux. Chaque segment a des soies et des bandes pigmentées. (B) Vue latérale d'un prd progéniture pRNAi hachurée. L'écart entre les bandes pigmentées voisins marquées est rétrécie ou complètement absent. (C) cuticules phénotype d'un contrôle unhatched type sauvage comme embryon. (D) cuticules phénotype d'un prd progéniture pRNAi unhatched avec moins de segments abdominaux. (E, F) Dissected germband de: (E) Contrôle, gfp pRNAi a uniformément exprimé En dans chaque segment, (F) prd expression pRNAi, En est réduite dans les segments alternés (astérisques). Pour toutes les sous-fenêtrels, barres d'échelle indiquent 500 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien qu'un petit nombre de systèmes modèles sophistiqués (souris, les mouches, les vers) ont été développés au cours du 20 e siècle, le 21ème siècle a vu une vague de nouveaux systèmes d'animaux en cours de développement dans les laboratoires à travers le monde. Ces nouveaux systèmes permettent aux scientifiques d'aborder comparatifs, des questions d'évolution qui ne peut être sondé en utilisant uniquement les systèmes modèles «standard». Ce déploiement de nouveaux modèles nécessite le développement rapide des méthodes de culture de laboratoire, l'identification des gènes et des approches fonctionnelles de nouvelles espèces. Ici, les procédures relatives à l' élevage D. maculatus dans le laboratoire et les protocoles étape par étape pour l' embryon ARNi, ARNi parental, et l' analyse phénotypique de ce coléoptère ont été présentés. L'objectif est que ces descriptions encouragent les autres à utiliser D. maculatus dans leurs propres expériences et d'utiliser des approches présentées ici pour développer de nouvelles espèces modèles supplémentaires.
Alors que D. maculatus lcolonies ab sont incroyablement faciles à entretenir, une limitation de l'élevage de cette espèce est l'odeur désagréable de la nourriture pour chat humide donné aux coléoptères comme leur source de nourriture. Pour éviter cela, des aliments de remplacement tels que la poudre de lactosérum / protéines de soja, le fromage, les aliments pour chiens au sol, et le lait en poudre, ont été testés avec ou sans coton humide pour modifier l'humidité. nourriture pour chien au sol était l'alternative la plus efficace et peut être utilisé pour l'alimentation régulière de la colonie. La survie était excellent (> 90%) de l'œuf à l'adulte dans des cages d'élevage sur les aliments pour chiens juste sec dans 80% d'humidité relative, avec ou sans coton humide ajouté. Cependant, complétant ce régime avec aliments humides pour chats lors de la collecte des œufs pour augmenter la fécondité peut être nécessaire lors de la collecte un grand nombre d'œufs. Si la nourriture pour chien est utilisé, la vieille nourriture doit être retiré régulièrement, comme la nourriture pour chien conditionné a été trouvé pour inhiber la ponte 54. Dog croquettes alimentaires (KR, les résultats préliminaires), le liège, le bois, le papier et autres matériaux peuvent également être utilisés comme refuges 71.Fait intéressant, la biodégradation de styromousse en utilisant des larves ténébrion du dendroctone a été rapporté 72. Par conséquent, cela a été testé pour les larves D. maculatus. Jeune D. maculatus larves ont survécu jusqu'à l' âge adulte avec seulement styromousse ou de matériaux contenant de l' amiante et de coton humide (données non présentées) , mais s'ils mangent et digèrent ces matériaux reste à déterminer.
Ce rapport est le premier protocole détaillé pour la réalisation d'études génétiques fonctionnels D. maculatus. L'utilisation d'ARNi représente ici une extension de cette technique à un nouveau système de modèle. Plusieurs observations spécifiques méritent d'être soulignés par rapport à ARNi expériences de knockdown à D. maculatus et d' autres espèces non-modèle. Tout d' abord, pour garantir que l' ARNi sera efficace dans D. maculatus, la même souche de D. maculatus utilisé ici doit être employé. Il existe des preuves de Tribolium castaneum que différentes souches montrent une variation dans l' ARNi phenotypes 24,73, et phénotypes mutants montrent souvent la dépendance sur fond génétique des espèces modèles 74-76. En outre, il existe des preuves anecdotiques pour la souche dépendance dans d' autres protocoles, y compris l' hybridation in situ. En second lieu , le moment approprié de l' injection est critique pour l' ARNi avec succès dans D. maculatus. Un peu contre-intuitivement, l'segmacoria est plus facilement pénétré après la cuticule a complètement sclérifiée, au moins deux jours après l'éclosion. Par conséquent, les femelles vierges 4 - 8 jours après l'éclosion devraient être utilisés. Les femelles plus âgées éprouvent la fécondité plus faible que les femmes nouvellement éclos et donc ne sont pas appropriés pour l'injection. En troisième lieu, injecté ARNdb peut obtenir poussé par la pression interne de l'abdomen de la femelle. Pour réduire au minimum la possibilité de perdre une grande quantité d'ARNdb après l'injection, maintenir l'aiguille dans l'abdomen pendant environ 5 secondes après l'injection, puis retirez-le lentement (6.2.8). Pendant ce temps, éviter d'appuyer sur les abdomen de la femelle pendant ou peuaprès l'injection. Pour contourner des résultats biaisés causés par cette question, injecter au moins 8 femelles pour chaque ARNdb d'obtenir suffisamment de descendants (~ 200 embryons par jour) pour l'analyse phénotypique. Quatrièmement, le rendement élevé des œufs est important pour fournir des données impartiales pour l'analyse phénotypique après l'injection. En moyenne, chaque femelle D. maculatus produit environ 35-55 embryons par jour. Le rendement d'oeufs dépend de la taille de la population, l' âge des femmes, l' humidité, la disponibilité des aliments, la température (données non présentées), et d' autres facteurs environnementaux 54. Habituellement, les femelles pondent plus à 30 ° C à 25 ° C. Cinquièmement, les embryons non éclos peuvent être cannibalisé par les larves écloses. Comme larves écloses sont généralement de type sauvage comme ou seulement légèrement affectée, alors que les embryons non éclos sont généralement plus sévèrement touchés, cette habitude de larves D. maculatus peut entraîner des résultats biaisés dans une analyse quantitative phénotypique. Par conséquent, l'élimination des larves écloses le plus tôt possible est fortement recommandé.
Notre laboratoire a mis l' accent sur D. maculatus segmentation, bien que de nombreux aspects de cette espèce, y compris la physiologie, l' écologie et la lutte antiparasitaire-sont d' un grand intérêt. Pour l' étude de l' embryogenèse et de la segmentation, une série de bandes sombres pigmentées sur la face dorsale de larves D. maculatus peut servir de marqueur naturel pour un développement anormal. En outre, les soies caractéristique ancrée sur les bandes pigmentées de larves peuvent être utilisés comme une indication des segments. Ces caractéristiques morphologiques, ainsi que la constatation que les embryons légèrement ou modérément touchés peuvent survivre à l' éclosion, des avantages du modèle D. maculatus pour étudier les mécanismes impliqués dans la structuration du plan du corps de base.
Enfin, l'importance de la réalisation d'expériences, y compris hautement contrôlées un contrôle négatif telles que gfp ARNdb et de tester deux régions cibles non chevauchantes pour chaque gène est essentielle pour éviter une mauvaise interprétation due à effects d'injection en soi et les effets hors-cible. D. pour maculatus, 4 - 6 pg (2 pl de 2 ou 3 ug / ul) ont été injectés dans ARNdb chaque femelle et l'ARNdb est de 200 à 250 pb de long. peut-être besoin d'être optimisé si le ciblage des gènes fonctionnels plus tard dans le développement ou dans différents processus physiologiques / métaboliques montants et autres détails du protocole. Découvertes antérieures ont montré que les effets ARNi peuvent être transmis aux générations suivantes au - delà de la génération F1 dans C. elegans 15. Une minorité de écloses larves D. maculatus avec des défauts de segmentation en raison de l' ARNi peut survivre jusqu'à l' âge adulte et peut se reproduire. Des expériences préliminaires ont échoué à révéler des défauts évidents dans la génération F2. Les études futures peuvent révéler des effets transgénérationnels de l'ARNi dans cette espèce.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
References
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