Introduction
Skelettet er en meget indviklet, dynamisk og komplekst organ, der har en række funktioner, der spænder fra bevægelse, til ion homeostase. Består af knogle og brusk, skelettet består af funktionelt distinkte cellepopulationer, der opererer til at opretholde det strukturelle, biokemiske og mekaniske integritet 1. En af de primære funktioner i skelettet er dens rolle i udvikling og vækst. Disse processer kræver orkestrering af flere cellulære populationer, der er reguleret gennem stram endokrine og genetiske kontrol.
Med undtagelse af den flade knogler f.eks scapula, kranium og brystben er pattedyr skelet dannet gennem processen kaldes endochondral ossifikation. Denne proces, reguleres både molekylært og rumligt, begynder med kondenseringen af mesenkymale celler afledt primært fra mesoderm 2. Under indflydelse af transkriptionsfaktoren Sox9, celler i the indre af kondensationer differentierer til chondrocytter, der udtrykker og udskille brusk specifikke ekstracellulære matrix (ECM) komponenter såsom type II collagen og aggrecan. Celler på margenen af kondens, udtrykker type I collagen og danner perichondrium, afgrænser den kommende knogle 3. Senere osteoprogenitors af perichondrium differentiere til osteoblaster, instrueret af ekspression af de transkriptionsfaktorer, Runx2 og osterix 4. Dette fører til en overvægt af osteoblaster og dette lag er omdøbt periosteum, som danner en mineraliseret bony krave omkring den midterste del af knoglen. Vaskulær penetration af periosteum og invasion af bruskagtig stillads sker bringer med sig, haematopoetically afledt knogleresorberende celler, osteoklaster, som resorberer chondrocyt rester og meget af den bruskagtig matrix 5. Rummene dannede er fyldt af osteoprogenitors giver anledning til den primære ossifikationcenter, som gradvist indtager kernen i diafysen og fusionerer med periosteum. Andre celler giver anledning til knoglemarven. Omkring fødslen, blodkar og osteoprogenitors trænge brusken rige matrix på hver side (epifyser) af den udviklende diafyse til dannelse af den sekundære ossifikation center. Beliggende mellem epifysen og diafysen i hver ende af de lange knogler er et band af brusk - det epifysale vækst plade - som er ansvarlig for at koordinere lineær vækst af alle lange knogler 6.
Chondrocytter i væksten pladen oprindeligt formere og efterfølgende fremskridt gennem morfologisk forskellige zoner, koordineret af sekventiel udtryk for transskription og vækstfaktorer. Kulminationen på denne sekvens af begivenheder er udgang fra cellecyklus og hypertrofi af chondrocytter i centrum for denne brusk forløber. Hypertrofe chondrocytter udtrykke kraftigt type X-collagen og matrixmetalloproteinase-13 (MMP13) og deres betydelige volumen udvidelsen i retning af langsgående vækst giver det største bidrag til knoglevækst i pattedyr 7,8. Desuden hypertrofiske chondrocytter mineralize deres omgivende ECM gennem frigivelse af matrix vesikler, specialiserede membran afgrænset strukturer til produktion af amorf calciumphosphat gennem deres inddragelse af fosfataser (tissue uspecifik alkalisk fosfatase (TNAP) og PHOSPHO1) og calcium kanalisere proteiner (annexiner ) 9-11. Denne forkalket brusk er invaderet af blodkar fra den underliggende marv resulterer i osteoklast rekruttering og matrix resorption. Dette efterfølges af osteoblast migration og tilpasning til overfladen af de forkalket brusk rester, hvor de fastsætter et lag af osteoid som er hurtigt mineraliseret. Det vævede knogle af den primære spongiosa er senere ombygget til lamellar knogle af den sekundære spongiosa 12. Epifyserne fusion resulterer iophør af endochondral ossifikation 13.
Endochondral ossifikation er under stram regulering af mange endokrine og parakrine hormoner og vækstfaktorer for at forhindre forstyrret udvikling og / eller langsgående knoglevækst 14. En bedre forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer der ligger til grund disse processer er derfor bydende nødvendigt i vores udøvelse af kliniske fremskridt i retning af menneskelig fordel. Tidligere forskning i ligheder og forskelle mellem vækst plader i forskellige aldre, steder og arter har forbedret vores forståelse af de fysiologiske mekanismer omkring vækst plade dynamik 15,16. Men studiet af isolerede chondrocytter er vanskelig, da fjernelse af chondrocytter fra deres miljø kan føre til dedifferentiering, ledsaget af tab af ekspression af vigtige markører, såsom COL2A1 17.
Musen metatarsal orgel eksplantation kultur, pioneered af Prof. Elisabeth Burger og kolleger i Holland, er en meget fysiologisk ex vivo model til at studere endochondral ossifikation og knoglevækst som væksten af knoglerne i kultur efterligner den, der ses in vivo 18. Unikt, mellemfod organkultur tillader undersøgelse af chondrocytter i forskellige faser af chondrogenese og opretholder celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, derfor giver betingelser tættere på in vivo-situationen end celler i kultur 19-21. Desuden er denne model giver mulighed for direkte undersøgelse af lineær knoglevækst hvilket ikke er muligt i primære chondrocyt kulturer. Det giver også mulighed for adskillelse af systemiske og lokale faktorer derfor tillader den specifikke analyse af de lokale virkninger på væksten plade.
Kulturen i metatarsals giver mulighed for undersøgelse af talrige parametre. Daglige målinger af totale længde og de mineraliserede regionerrudimenterne kan udføres med standard fasekontrastmikroskopi og billedanalysesoftware. Histologiske, in situ hybridisering og immunohistologisk farvning let kan udføres på metatarsus sektioner, som giver mulighed for den rumlige opløsning af både cellulære og molekylære enheder, en stor fordel i forhold til traditionelle celledyrkningsmetoder. Den immunhistokemiske tilgang omfatter påvisning og kvantificering af 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) optagelse af prolifererende chondrocytter 22. Desuden kan yderligere behandling af metatarsus væv udføres for at muliggøre nedstrøms analyse af mRNA-ekspression (RT-qPCR), protein og intracellulær signalering analyse (Western blotting) eller lipidsammensætning (massespektrometri). De fleste undersøgelser til dato bruger dyrkede embryonale mellemfodsknogler snarere end mellemfoden fra postnatale dyr. Mens begge modeller kan være oplysende, studiet af embryonale knogler har flere fordele: de vokser hurtigere og kan være eksplgrænset til at studere initiering og progression af mineralisering proces 23-25.
Denne protokol beskriver detaljeret den indviklede dissektion af embryonale metatarsaler fra bagbenet af embryonale dag 15 (E15) murine embryoner. Endvidere vækst og mineralisering af anatomisk særskilte Mellemfodsben vises,.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner blev gennemført i overensstemmelse med de britiske Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 og dyrene blev opretholdt i overensstemmelse med Indenrigsministeriet offentliggjorde adfærdskodeks for anbringelse og pasning af dyr, Leveres eller anvendes til videnskabelige formål.
BEMÆRK: Eksperimenter udført under anvendelse af vildtype C57BL / 6J mus er veletablerede og beskrevet nedenfor. Embryonale metatarsal fra forskellige musestammer kan ligeledes være dyrket in vitro, selv om deres vækst og mineraliseringshastigheder kan være forskellig fra dem beskrevet heri.
1. Dissektion Betingelser og Udarbejdelse af instrumenter
- Udfør alle medier forberedelse, væv dissektioner og kultur arbejde i en laminar flow hætte til at sikre steriliteten af medier og embryonale rudimenter.
- Tillad kultur og dissektion medier til ligevægt i mindst 1 time i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator før anvendelse.
- sterilisere dissektionsaks, Dumont # 5 og Dumont # 4 pincetter sammen et par superfin Vännäs mikro saks (8 cm lige, 3 mm knive) ved autoklavering. Efter autoklavering nedsænkes dissektion udstyr i 70% ethanol før brug.
2. Udarbejdelse af Dissektion og Kultur Medier
- Forbered dissektion medium
- Fortynd α-Minimum Essential Media (uden nukleosider, aMEM) i phosphatpufret saltvand (PBS) (01:13) og resuspender bovint serumalbumin (BSA) ved 2 mg / m l før filtersterilisering gennem en sprøjte diameter 0,22 um, 33 mm filter.
BEMÆRK: Dissektion medium kan foretages, filtersteriliseret og opbevaret i portioner ved -20 ° C uendeligt.
- Fortynd α-Minimum Essential Media (uden nukleosider, aMEM) i phosphatpufret saltvand (PBS) (01:13) og resuspender bovint serumalbumin (BSA) ved 2 mg / m l før filtersterilisering gennem en sprøjte diameter 0,22 um, 33 mm filter.
- Forbered dyrkningsmedium
- Kultur embryonale metatarsal i 300 pi kulturmedium (i hver brønd af en 24-brønds kulturplade). Forbered dyrkningsmediet ved tilsætning af 0,2% vægt / volumen BSA; 5 ug / ml L-ASCOrbic surt phosphat; 1 mM β-glycerophosphat (βGP, valgfri - se resultater afsnit); 0,05 mg / ml gentamicin og 1,25 ug amphotericin B til aMEM og filter sterilisere gennem et 0,22 um, 33 mm sprøjte diameter filter.
3. Murine embryonale Metatarsal Dissektion og Kultur
- Frasortering den gravide mus, husly 15 dage gamle embryoner, ved cervikal dislokation efter hjemmekontoret retningslinjer i Storbritannien
- Sende dyret liggende og desinficere huden ved sprøjtning med 70% ethanol. Brug af dissektion saks gør et stort snit i midterlinjen gennemtrængende både huden og peritoneum for at blotlægge den abdominale kavitet.
- Find de to livmoderhornene af dyret i den dorsale region i legemshulen. Fjern livmoderhornene ved først at frigøre hver livmoderen fra mesometrium ved omhyggelige indsnit med dissektion saks og så endelig skære livmoderhornene gratis på deres base. place livmoderhornene til dissektion medium.
- Adskil hvert foster ved at skære mellem implantationssteder langs uterine horn og flytte embryoner fra deres individuelle sacs med en pincet. Udsættersøer embryoner ved halshugning efter hjemmekontoret retningslinjer i Storbritannien
- Efter desinfektion af huden ved sprøjtning med 70% ethanol, bruge Vannas mikro saks til at fjerne bagbenene fra embryonerne ved indskæring omkring den proksimale femur. Dette sikrer så meget af bagbenet som muligt fjernes. Placer bagbenene i en petriskål nedsænket i før metatarsal dissektion dissektion medium.
- Under et dissektionsmikroskop, begynde at fjerne huden omkring embryonale foden, ved at klemme og trække det ud ved hjælp af # 5 pincet, mens du holder bagbenet stabil ved hjælp af # 4 pincet. Dette er mest effektivt udføres ved at gribe huden på omkring niveauet af skinneben og trækker mod phalanges. Brugen af sakse på nuværende tidspunkt at skæremeget tynd hud er ikke påkrævet.
- holde forsigtigt tarsals af embryonale fod med # 4 pincetter og fjerne de første og femte metatarsal ved at knibe off nær tarsals hjælp # 5 pincet og kassér.
- Med foden holdes i samme position, skal du bruge # 5 pincet til at forstyrre bindevæv mellem de tre resterende phalanges og Mellemfodsben. Sæt spidsen af # 5 pincet ved samlingen mellem phalanges og mellemfodsknogler at fjerne phalanges fra mellemfoden.
- Endelig kan du bruge # 5 pincet til at forstyrre bindevævet mellem tarsals og mellemfodsknogler. Igen placere spidsen af # 5 pincet i det fælles rum mellem tarsals og metatarsal og forsigtigt fri mellemfodsknogler fra tarsals.
- afhente forsigtigt op nu gratis metatarsal med # 4 pincetter og sted i frisk dissektion medium.
BEMÆRK: Omhyggelig dissektion bør give 6 metatarsaler fra hver foster. - Når alle nødvendige Mellemfodsben er dissekeret, carefully place metatarsaler individuelt i det foropvarmede plader med 24 brønde indeholdende 300 pi dyrkningsmedier. Kultur metatarsaler ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i op til 14 dage.
BEMÆRK: Du må ikke ændre medier E15 kulturer indtil mindst dag 5 af kulturen som dette påvirker deres mineralisering kapacitet 26. Årsagerne til dette er uklar, men lineær vækst og matrix mineralisering kan være afhængig af stimulering med vækstfaktorer, der frigives fra metatarsalerne.
4. Analyse og Manipulation af metatarsal kulturer
- På dagen for dissektion (dag 0) gør indledende langsgående målinger ved hjælp af et mikroskop med et digitalt kamera vedhæftet og image analyse software. Måle længden af den centrale mineralisering zone, når det vises efter få dages dyrkning.
- Med jævne mellemrum efter behov, foretage yderligere målinger (normalt hver 2. dag), indtil den sidste dag i kulturen på hvilket tidspunkt metatarsal knogler behandles afhængig nødvendige resultater (omtalt i indledningen).
- Supplement medium metatarsal orgel kulturer med forskellige eksogene faktorer, f.eks vækstfaktorer, hormoner og farmakologiske agenter fra dag 0 kultur 22,24. I alle undersøgelser af denne art, kontrol ubehandlede Mellemfodsben er nødvendige.
BEMÆRK: Selvom det er tilrådeligt, at kontrolsystemerne knoglerne er tilsvarende rudiment fra den kontralaterale ben, har der ikke været nogen forskel i lineær vækst eller mineralisering potentiale dyrket E15 2., 3. og 4. mellemfoden (se nedenfor, figur 2) .
Representative Results
Formålet med denne metode var at isolere embryonale Mellemfodsben og kultur dem til undersøgelse af langsgående knoglevækst og ECM mineralisering. Ved hjælp af vores protokol beskrevet heri, blev embryonale metatarsus knogler held dissekeret, som visualiseret ved lysmikroskopi. Målinger af metatarsus knogler, der gennemføres som angivet i figur 1, viste deres evne til at vokse i langsgående længde og mineralize deres ECM (figur 2 og 3). Mineralisering af matrixen skal først bemærkes i mid-diafysen af knoglen rudiment og er let observeres ved lysmikroskopi. Ingen farvning kræves selvom optagelsen af calcein kan tilbyde forbedret visualisering af nydannede mineral.
Forsøg med embryonale metatarsal til dato 22,27,28 har puljet det dissekerede 2., 3. og 4. th (CENtral tre) metatarsaler, under forudsætning af in vitro-vækst og mineralisering at være sammenlignelige. In vivo udviklingsmæssige af murine Mellemfodsben dog afslører, at de 3. og 4. th cifre har beviser for mineralisering før alle andre Mellemfodsben og phalanges 29. Vurdering af vækst og mineralisering potentiale individuelt isoleret og dyrket E15 2., 3. og 4. mellemfoden viste ingen signifikante forskelle i forekomsten eller omfanget af mineralisering efter 7 dages kultur (figur 2). Ingen forskel i den procentvise stigning fra baseline blev fundet under kultur periode. Da ingen forskelle i mineralisering potentiale blev bemærket standard protokollen for at samle de 2. 3. og 4. th mellemfoden synes gældende for fremtidige undersøgelser.
Traditionelt har efterforskere tilføjet βGP til medieranvendes til dyrkning embryonale metatarsals at fremme ECM mineralisering. Men i cellekultur studier, er det blevet vist, at hvis der tilsættes TNAP enzym til osteogene medier indeholdende βGP, ektopisk hydroxyapatit mineralaflejring stadig forekommer, selv i fravær af celler 30. For at undersøge effekten af forskellige mineralisering substrater og agonister på metatarsal mineralisering kapacitet, vi dyrket E15 metatarsaler i kultur medier, der indeholder en række kosttilskud, og billeder og længde målinger blev registreret dagligt. Resultaterne viste, at E15 metatarsus knogler stadig vokser og mineralize deres ECM i fravær af βGP. E15 metatarsus knogler dyrket i ascorbinsyre kun medier næsten samme stigning længde og mineralisering som mellemfoden dyrket i nærvær af βGP (figur 3).
Vi har også vist, at lentivirus kan anvendes til at transficere eksogent DNA i dyrkede metatarsals. Her held transficerede vi metatarsus knogler på dag 0 i kultur (dvs. dag dissektion) med 2 x 10 6 grønne fluorescerende protein (GFP) viruspartikler pr metatarsal. For at aktivere virus transduktion blev polybren samtidigt sat til kulturer på 1: 500. Kulturer blev efterladt i 7 dage, uden ændringer medier som krævet for E15 metatarsal mineralisering at forekomme, før den blev inkuberet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning i 5 minutter og derefter direkte visualiseret under anvendelse af et konfokalt mikroskop ( Figur 4). Vores proof of concept forsøg viser tydeligt effektiv transduktion. Det ville imidlertid være klogt at undersøge sektioner hele hele mellemfod knogle at vurdere deres transfektion og effektiv genmanipulation.
Figur 1: Standard metode bruges til at måle than Længde og Mineralisering Zone i Embryonale metatarsals. (A) Samlet længde målinger af E15 metatarsals på dag 0 af kultur (dag dissektion) taget gennem centrum af mellemfod. (B) Målinger af total langsgående længde af en metatarsal efter syv dage i kultur. Bemærk den let krumning i metatarsal. (C) Måling af mineralisering zone længde efter syv dage i kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vækst og Mineralisering Kapacitet Anatomisk Distinct E15 Mellemfodsben Imaging og måling af 2., 3. og 4. metatarsaler fra bagbenet af E15 mus w.som udføres. (A) Serielle billeder af 2., 3. og 4. metatarsal hele dyrkningsperioden. (B) Procentvis stigning i længde fra dag 0 på hver dag i kultur. (C) Mineral længde 2., 3. og 4. metatarsal i dyrkningsperioden udtrykt i procent af den totale metatarsalknogles længde. Data i er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J metatarsus længder på hver dag af kultur. Data i er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (n = 6). Sort bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vækst og Mineralisering Kapacitet VildtypeE15 Mellemfodsben dyrket i forskellige osteogent Media. (A) Serielle billeder af metatarsals dyrket i ascorbinsyre kun, 1 mM βGP, 3 mM phosphocholin, 1,5 mM calciumchlorid eller 3 mM calciumchlorid holdige medier. (B) Procentvis stigning i længde fra dag 0 af mellemfoden dyrket med de forskellige kosttilskud. (C) Mineral længde metatarsalknogle dyrket i forskellige medier udtrykt i procent af den totale metatarsalknogles længde. Data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM), (n = 6). Sort bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Transfektion af E15 metatarsalknoglernes med GFP Virus Partikler. (A) E15 metatarsus knogler blev transficeret med GFP viruspartikler til proof of concept. (B) Knogler blev farvet med DAPI for DNA visualisering. (C) Dual billeder angivne vellykket transfektion af GFP virus hele hele mellemfodshovederne knogler. Hvide søjler = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den kultur af murine embryonale Mellemfodsben danner et særdeles fysiologisk model af endochondral vækst og mineralisering. Tidlige undersøgelser har valideret, at E15 muse Mellemfodsben gennemgå en normal mønster af skelet vækst og differentiering. Brusken (chondrocytter) og knogle (osteoblaster og osteoklaster) celler og deres respektive collagene matricer er ikke skelnes fra dem, der observeres in vivo. Der er dog nogle anerkendte begrænsninger af denne model. Hastigheden af osteoklastdifferentiering er forringet som er knoglevækst (men ikke brusk differentiering). Knoglevækst er ca. 50% langsommere end observeret in vivo og kan skyldes mangler i systemiske faktorer, der påvirker produktionen af lokale faktorer (f.eks IGF-1, BMP'er, etc.) 31. Det er også velkendt, at knoglen er følsom over for dens mekaniske miljø, og dette er også tilfældet for dyrkede Mellemfodsben, som svarer til cNDRINGER i mekanisk belastning 32,33. Derfor, i ubelastede situationer, som beskrevet i denne protokol, mineralisering og mineralsk resorption kan være kompromitteret. Alligevel mellemfod model giver evnen til direkte at måle lineær knoglevækst hvilket ikke er muligt via 2D og 3D in vitro dyrkningssystemer.
Vi har givet en omfattende beskrivelse af den pågældende i dissektion og kultur E15 murine Mellemfodsben og faktisk for første gang protokol, bekræfte gyldigheden af at samle de to nd, 3. og 4. th mellemfoden for eksperimenter.
Metatarsaler fra E17 / E18 er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne i knoglevækst på grund af deres ekstraordinære potentiale til at vokse ex vivo i lange perioder (dvs. ud over 14 dage i kultur). De er en veletableret model for at undersøge rollerne for vækstfaktorer på embryonisk langsgående knoglevækst.Derudover er dissektion og dyrkning af postnatale Mellemfodsben almindeligvis anvendes til at afgrænse de mekanismer omgivende postnatal knoglevækst som det forstås, at postnatal vækst knogle og føtal knoglevækst reguleres forskelligt 21. Den knoglevækst observeret i dyrkede postnatale Mellemfodsben er dog betydeligt mindre end hos embryonale ansatser 25,34, hvilket begrænser deres potentiale i langtidsstudier og fremhæve de mere systemiske indflydelse på knoglevækst på dette postnatal fase. Faktisk 3 dage gamle postnatale metatarsal fra mus er typisk de seneste trin, der kan anvendes til at opnå målbar vækst 34.
Her beskriver vi vores protokol til isolering af embryonale metatarsus knogler på E15. Fraværet af hydroxyapaptite mineral i E15 metatarsus knogler betyder, at de giver en uovertruffen model til at undersøge ikke blot de mekanismer omgivende langsgående knoglevækst, men ligeledes iværksættelseaf skeletal mineralisering. Den mineraliserede matrix af terminalen hypertrofisk chondrocyt zone giver et stillads for at invadere osteoblaster at fastlægge en knogle matrix (osteoid), som efterfølgende mineraliseret, og som sådan denne indledende mineralisering er afgørende for en vellykket og funktionel knogledannelse 35. Faktisk en række nylige rapporter udnytter E15 Mellemfodsben har bekræftet deres unikke evne til undersøgelse af mineralisering proces 28,36,37. Desuden har forskere beskrevet anvendelsen af E15 metatarsaler som en model af angiogenese 38, hvori den potentielle af embryonale metatarsal som model uden indstillingen knoglevækst / mineralisering.
Protokollen beskriver vi kræver kun standard laboratorieudstyr, herunder en laminær strømning, et dissektionsmikroskop til udførelse af dissektion, og et CO2-inkubator til dyrkning af udskårne ansatser. Desuden er en meget grundlæggende culTURE medium indeholdende aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika og L-ascorbinsyre (en co-faktor ved syntese af hydroxyprolin og hydroxylysin, to essentielle aminosyrer til fremstilling af kollagen 39) undgår anvendelsen af udefinerede tilsætningsstoffer, såsom animalsk sera . Traditionelt har forskere tilføjet βGP til medier, der anvendes til dyrkning af embryonale metatarsaler men som åbenbaret i vores resultater, er ikke påkrævet at anvende en supplerende phosphatkilde for vellykket mineralisering i dette kultursystem. Dette er et vigtigt resultat i vores jagt på at forstå de mekanismer, der ligger til grund ECM mineralisering.
Mellemfodsben har tidligere været inficeret med adenovirus, der indeholder dominante-negative former for Smad2 at udforske rollen som transformerende vækstfaktor β i reguleringen af lang knogle udvikling 40. Her har vi også afsløre en vellykket transfektion af vildtype-E15 metatarsus knogler med GFP viruspartikler, hvilket indikerer that lentiviral teknikker kunne nemt blive vedtaget at manipulere genekspression i metatarsal kulturer. Tilsvarende mellemfod organkultur system er en fremragende model til at sammenligne væksten af knogler fra genetisk ændrede mus for bedre at forstå den rolle, som et bestemt gen i knoglevækst processen. Vores tidligere undersøgelser har udnyttet mellemfod organkultur system til at bestemme den rolle, som undertrykker af cytokin signalering-2 (SOCS2) i endochondral knoglevækst. Brug af metatarsus knogler fra mus med mangelfuld SOCS2, har vi vist, at væksthormon er i stand til at simulere deres langsgående vækst uafhængig af insulin-lignende vækstfaktor (IGF-1), til forskel fra vildtype-metatarsus knogler, der ikke reagerer på behandling med væksthormon 34, 41. Dette understreger, i hvilket omfang metatarsus kulturer kan manipuleres til at undersøge effekten af forskellige gener og / eller eksogene faktorer på endochondral knoglevækst.
Sammenfattende har vi Detaiførte en fremgangsmåde til vellykket udvinding og kultur af embryonale metatarsus knogler, der kan manipuleres og undersøgt ved anvendelse af en række forskellige analyser. Denne ex vivo-model fastholder celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, samt indeholder chondrocytter i forskellige faser af chondrogenese, derfor giver en mere fysiologisk model end celler i monolag eller 3D kultur. Metatarsal orgel kulturer er derfor en enestående model for undersøge de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for endochondral ossifikation, og er afgørende for at fremme vores forståelse af både knogle fysiologi og patofysiologi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
| SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
| α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C |
| Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
| Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |
References
- Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
- Berendsen, A. D., Olsen, B. R.
- Kronenberg, H. M.
- Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
- de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
- Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
- Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
- Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
- Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
- Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
- Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
- Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
- Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
- Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
- Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
- Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
- Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
- Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
- Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
- Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
- MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
- Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
- Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
- Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
- Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
- Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
- Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
- Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
- Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
- Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
- Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
- Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
- Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
- Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
- Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).
