Introduction
Skjelettet er et svært intrikat, dynamisk og komplekst organ som har en rekke funksjoner som spenner fra bevegelse, til ion homeostase. Består av bein og brusk, skjelettet består av funksjonelt forskjellige cellepopulasjoner som virker til å opprettholde det strukturelle, biokjemiske og mekanisk integritet 1. En av de primære funksjonene til skjelettet er dens rolle i utvikling og vekst. Disse prosessene krever orkestrering av flere cellepopulasjoner som er regulert gjennom tett endokrine og genetisk kontroll.
Med unntak av den flate bein f.eks scapula, kraniet og sternum, er pattedyr skjelettet er dannet gjennom prosessen som kalles endochondral forbening. Denne fremgangsmåten, reguleres både molekylært og romlig begynner med kondensasjon av mesenchymale celler avledet hovedsakelig fra mesoderm 2. Under påvirkning av transkripsjonsfaktoren SOX9, celler i the interiøret av condensations differensiere i chondrocytes, uttrykke og sekresjon brusk spesifikke ekstracellulære matrix (ECM) komponenter som type II kollagen og aggrecan. Celler i margen av kondens, uttrykke type I kollagen og danner perikondrium, opptegning av potensielle bein tre. Senere osteoprogenitors av perikondrium differensiere i osteoblaster, regissert av uttrykket av transkripsjonsfaktorer, Runx2 og osterix 4. Dette fører til en overvekt av osteoblaster, og dette sjiktet blir omdøpt periosteum som danner en mineralisert benete krage rundt midtpartiet av benet. Vaskulær gjennomtrengning av periosteum og invasjonen av brusk stillas skjer bringer med seg, haematopoetically avledet bein resorberende celler, osteoklaster, som resorbere de kondrocytt rester og mye av bruskmatrise-5. Mellomrommene dannes er fylt av osteoprogenitors gir opphav til den primære ossificationsenter som stadig opptar kjernen av diaphysis og fusjonerer med periosteum. Andre celler som gir opphav til benmargen. Rundt fødsel, blodårer og osteoprogenitors trenge inn i brusken rik matriks på hver side (epiphysis) av det fremkallende diaphysis for å danne den sekundære ossifikasjon sentrum. Beliggende mellom epifysen og diaphysis i hver ende av den lange bein er et band av brusk - epiphyseal vekst plate - som er ansvarlig for å koordinere lineær vekst av alle lange bein 6.
Chondrocytes innenfor veksten plate utgangspunktet sprer og deretter komme seg gjennom morfologisk forskjellige soner, koordinert av sekvensiell uttrykk for transkripsjons og vekstfaktorer. Kulminasjonen av dette hendelsesforløpet er avkjøringen fra cellesyklusen og hypertrofi av chondrocytes i sentrum for denne brusk forløper. Hypertrofiske chondrocytes sterkt uttrykke typen X kollagen og matriksmetalloproteinase-13 (MMP13) og deres betydelig volum utvidelse i retning av lengdevekst gir det største bidraget til bein vekst hos pattedyr 7,8. Videre hypertrofisk kondrocytter mineralize deres omkringliggende ECM gjennom frigjøring av matrise vesikler, membran avgrenset struktur spesialisert for fremstilling av amorft kalsiumfosfat gjennom deres inkludering av fosfataser (vev ikke-spesifikk alkalisk fosfatase (TNAP) og PHOSPHO1) og kalsiumkanalproteiner (annexins ) 9-11. Dette forkalket brusk er invadert av blodårer fra den underliggende marg resulterer i osteoclast rekruttering og matrise resorpsjon. Dette blir etterfulgt av osteoblastmigrering og innretting til overflaten av forkalkede brusk restene hvor de legge ned et lag av osteoid som er hurtig mineralisert. Det vevde ben av primær spongiosa er senere ombygd til lamellær bein av den sekundære spongiosa 12. Epiphyseal fusion resultater iopphør av endochondral ossifikasjon 13.
Endochondral ossifikasjon er under streng regulering av mange endokrine og parakrine hormoner og vekstfaktorer, slik som å forhindre forstyrret utvikling og / eller langsgående benvekst 14. En bedre forståelse av molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn disse prosessene er derfor viktig i vårt arbeid for kliniske fremskritt mot menneske fordel. Tidligere forskning på likheter og forskjeller mellom vekstplater i ulike aldre, steder og arter har mye bedre vår forståelse av de fysiologiske mekanismene rundt veksten plate dynamikk 15,16. Imidlertid er studiet av isolerte kondrocytter vanskelig, da fjerning av kondrocytter fra omgivelsene kan føre til dedifferentiation, ledsaget av tap av ekspresjon av viktige markører som for eksempel Col2a1 17.
Musen metatarsal organ eksplantering kultur, pioneered av professor Elisabeth Burger og kolleger i Nederland, er en svært fysiologisk ex vivo modell for å studere endochondral forbening og bein vekst som veksten av bein i kultur ligner det man ser i vivo 18. Unikt, tillater metatarsal-organkultur-undersøkelsen av kondrocytter i ulike faser av chondrogenesis og vedlikeholder celle-celle og celle-matriks interaksjoner, derfor gir betingelser nærmere til in vivo situasjonen enn celler i kultur 19-21. Videre tillater denne modellen for direkte undersøkelse av lineær benvekst som ikke er mulig i primærkulturer kondrocytt. Det tillater også for separasjon av systemiske og lokale faktorer derfor tillater den spesifikke analyse av de lokale effekter på vekstplaten.
Kulturen i metatarsal tillater undersøkelse av tallrike parametre. Daglige målinger av total lengde og av de mineraliserte regionenerudimenter kan utføres med standard fasekontrastmikroskopi og bildeanalyse programvare. Histologiske, in situ hybridisering og immunhistokjemi flekker kan lett utføres på metatarsal seksjoner, som gjør det mulig for den romlige oppløsningen av både cellulære og molekylære enheter, en stor fordel fremfor tradisjonelle cellekulturmetoder. Immunhistokjemisk tilnærming inkluderer påvisning og kvantifisering av 5-brom-2'-deoxyuridine (BrdU) opptak av voksende chondrocytes 22. I tillegg kan ytterligere behandling av metatarsal vev bli utført for å tillate for genetisk analyse av mRNA-ekspresjon (RT-qPCR), protein og intracellulær signalisering analyse (Western blotting) eller lipid sammensetning (massespektrometri). De fleste studier til dato bruk kultur embryonale metatarsals fremfor metatarsals fra post-natal dyr. Mens begge modellene kan være informative, studiet av embryonale bein har flere fordeler: de vokser raskere og kan være exploset til å studere initiering og progresjon av mineraliseringsprosessen 23-25.
Denne protokollen beskriver i detalj den intrikate disseksjon av embryonale metatarsals fra bakbenet av embryonale dag 15 (E15) museembryoer. Videre er vekst og mineralisering av anatomisk distinkte metatarsals vist.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag ble utført i samsvar med de britiske Dyr (Scientific Procedures) Act 1986 og dyr ble vedlikeholdt i samsvar med hjemmekontor publisert anbefaling for eierstyring og Housing og stell av dyr oppdrettet, Leveres eller brukt til vitenskapelige formål.
MERK: Eksperimenter utført ved bruk av villtype C57Bl / 6J mus er godt etablert og beskrevet nedenfor. Embryonale metatarsals fra forskjellige musestammer Tilsvarende kan dyrkes in vitro, selv om deres vekst og mineralise prisene kan variere til de beskrevet her.
1. Disseksjonskurs betingelser og klargjøring av instrumenter
- Utføre alle medier forberedelse, vev disseksjoner og kulturarbeid i en laminær hette for å sikre steriliteten av medier og embryonale barnelærdom.
- Tillat kultur og disseksjon media til stabilisering i minst 1 time i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator før bruk.
- Steril disseksjonsaks, Dumont # 5 og Dumont # 4 pinsett sammen et par superfine Vännäs mikro saks (8 cm rette, 3 mm kniver) ved autoklave. Etter autoklave, senk disseksjon utstyr i 70% etanol før bruk.
2. Utarbeidelse av Dissection og kultur Media
- Forbered disseksjon medium
- Fortynn α-Minimum essensielt medium (uten nukleosider, aMEM) i fosfatbufret saltvann (PBS) (01:13) og resuspender bovint serumalbumin (BSA) ved 2 mg / m l før filtersterilisering gjennom en sprøyte diameter på 0,22 pm, 33 mm filter.
MERK: Disseksjon medium kan gjøres, filtersterilisert og lagret i alikvoter ved -20 ° C på ubestemt tid.
- Fortynn α-Minimum essensielt medium (uten nukleosider, aMEM) i fosfatbufret saltvann (PBS) (01:13) og resuspender bovint serumalbumin (BSA) ved 2 mg / m l før filtersterilisering gjennom en sprøyte diameter på 0,22 pm, 33 mm filter.
- Forbered dyrkingsmedium
- Kultur embryonale metatarsals i 300 ul kulturmedium (i hver brønn av en 24-brønners kulturplate). Forbered kulturmediet ved å tilsette 0,2% w / v BSA; 5 ug / ml L-ascorbic syre fosfat; 1 mM β-glycerophosphate (βGP, valgfritt - se resultater avsnitt); 0,05 mg / ml gentamicin og 1,25 ug Amphotericin B for å aMEM og filtersteriliser gjennom et 0,22 pm, 33 mm diameter sprøytefilter.
3. Murine Embryonic Metatarsal Dissection og kultur
- Innhente den gravide mus, husing 15 dager gamle embryoer, ved halshugging i samsvar med hjemmekontor retningslinjer i Storbritannia
- Plasser dyret liggende og desinfisere hud ved å spraye med 70% etanol. Bruke disseksjon saks lage et stort snitt i midtlinjen, gjennomtrengende både huden og bukhinnen å avsløre bukhulen.
- Finn de to uterine horn av dyret i den dorsale regionen av kroppens hulrom. Fjern livmor horn ved først å frigjøre hver livmor fra mesometrium ved forsiktig snitt med disseksjon saks og så til slutt å kutte livmor horn gratis på deres base. Place livmor horn inn disseksjon medium.
- Skill embryo ved å kutte mellom implantasjoner langs livmor horn og fjerne embryoer fra deres individuelle sekker ved hjelp av tang. Cull embryoer ved halshogging i samsvar med hjemmekontor retningslinjer i Storbritannia
- Etter desinfeksjon av huden ved sprøyting med 70% etanol ved å bruke Vannas mikro saks for å fjerne baklemmene fra embryoene ved incising rundt den proksimale femur. Dette sikrer så mye av bakbenet som mulig er fjernet. Plasser baklemmene i en petriskål neddykket i disseksjon medium før metatarsal disseksjon.
- Under en dissekere mikroskop, begynner å fjerne huden rundt embryonale foten, ved å knipe og dra det av med # 5 pinsett mens du holder bakben jevn med # 4 pinsett. Dette blir mest effektivt utført ved å ta tak i huden på rundt nivået av tibia og trekke mot phalanges. Bruken av saksen på dette stadiet for å kuttemeget tynn hud er ikke nødvendig.
- Nøye holde fotrotsbein av embryonale foten med # 4 pinsett og ta første og femte metatarsal ved å knipe av nær fotrotsbein bruker # 5 pinsett og kast.
- Med foten holdes i samme posisjon, bruk # 5 pinsett for å forstyrre bindevev mellom de tre gjenværende phalanges og metatarsals. Inn tuppen av # 5 pinsett i skjøten mellom de falangeale og metatarsals å fjerne falangeale fra mellomfoten.
- Til slutt bruker # 5 pinsett for å forstyrre bindevev mellom fotrotsbein og metatarsals. Igjen plasserer tuppen av # 5 pinsett i felles plass mellom fotrotsbein og metatarsals og forsiktig gratis metatarsals fra fotrotsbein.
- Forsiktig plukke opp nå gratis metatarsals med # 4 pinsett og legg i frisk disseksjon medium.
MERK: Forsiktig disseksjon bør gi 6 metatarsals fra hvert embryo. - Når alle nødvendige metatarsals har blitt dissekert, carefully sted metatarsals individuelt inn i forvarmet 24-brønners plater som inneholder 300 mL av kultur media. Kultur metatarsals ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator i inntil 14 dager.
MERK: Ikke endre media av E15 kulturer før minst dag 5 av kultur som dette påvirker deres minera evne 26. Årsakene til dette er uklart, men lineær vekst og matrise mineralisering kan være avhengig av stimulering av vekstfaktorer løslatt fra metatarsals.
4. Analyse og manipulasjon av metatarsal kulturer
- På dagen for disseksjon (dag 0) gjør innledende målinger langsgående ved hjelp av et mikroskop med et digitalt kamera festet og bildeanalyse programvare. Mål lengden av den sentrale mineralsonen når det ser ut etter et par dager med kultur.
- Med jevne mellomrom, etter behov, gjøre flere målinger (vanligvis hver 2. dag) til den siste dagen av kultur og da metatarsal bein behandles avhengig av nødvendige resultatene (omtalt i innledningen).
- Supplement medium av metatarsal organkulturer med ulike eksogene faktorer som for eksempel vekstfaktorer, hormoner og farmakologiske midler fra dag 0 av kultur 22,24. I alle studier av denne type tak ubehandlede metatarsals er nødvendig.
MERK: Selv om det er tilrådelig at kontroll bein er tilsvarende rudiment fra motsatt ben, det har ikke vært noen forskjeller i lineær vekst eller mineralise potensialet kultivert E15 2., 3. og 4. metatarsal (se nedenfor, figur 2) .
Representative Results
Målet med denne fremgangsmåten var å isolere embryonale metatarsals og kultur dem for undersøkelse av langsgående benvekst og ECM mineralisering. Ved å bruke vår protokollen beskrevet heri, ble embryonale metatarsal ben med hell dissekert, som visualisert ved lysmikroskopi. Målinger av metatarsal ben, utført som vist i figur 1, viste deres evne til å vokse i langsgående lengde og mineralize deres ECM (figurene 2 og 3). Mineralisering av matrisen blir først angitt i midt diaphysis av benet rudiment og er lett observert ved lysmikroskopi. Ingen flekker kreves selv om opptaket av calcein kan tilby forbedret visualisering av nydannede mineral.
Studier benytte embryonale metatarsals oppdatert 22,27,28 har samlet dissekert 2., 3. og 4. (CENtrale tre) mellomfot, forutsatt in vitro vekst og mineralisering for å være sammenlignbare. In vivo utviklings av murine metatarsal, imidlertid, viser at det 3. og 4. siffer har bevis for mineralisering før alle andre mellomfoten og phalanges 29. Vurdering av vekst og mineralisering potensialet for individuelt isolert og kultivert E15 2., 3. og 4. metatarsal viste ingen signifikante forskjeller i utseende eller omfanget av mineralisering etter 7 dager med kultur (figur 2). Ingen forskjell i den prosentvise økning fra grunnlinjen ble funnet i løpet av dyrkningsperioden. Som ingen forskjeller i minera potensiale ble bemerket standard protokoll for å samle de to nd 3. og 4. metatarsal vises gyldig for fremtidige studier.
Tradisjonelt har forskere lagt βGP til mediaanvendt for å dyrke embryonale metatarsals for å fremme ECM mineralisering. Men i cellekulturstudier, har det vist seg at hvis TNAP enzym tilsettes til osteogene medier inneholdende βGP, ektopisk hydroksyapatitt mineralavsetning fremdeles forekommer selv i fravær av celler 30. For å undersøke effekten av ulike mineralise underlag og agonister på metatarsal minera evne, dyrket vi E15 metatarsals i dyrkingsmedier som inneholder et utvalg av kosttilskudd, og bilder og lengdemålinger ble registrert daglig. Resultatene indikerte at E15 metatarsal ben fortsatt vokse og mineralize deres ECM i fravær av βGP. E15 metatarsal ben dyrket i ascorbinsyre bare media viste sammenlignbare økninger i lengde og mineralisering som metatarsals dyrket i nærvær av βGP (figur 3).
Vi har også vist at lentivirus kan bli anvendt for å transfektere eksogent DNA inn i dyrkede metatarsals. Her vi lykkes transfektert metatarsal bein på dag 0 av kultur (dvs. dagen av disseksjon) med 2 x 10 6 grønne fluorescerende protein (GFP) viruspartikler per metatarsal. For å aktivere virus transduksjon, polybrene ble samtidig lagt til kulturer på 1: 500. Kulturer ble forlatt i 7 dager, uten noen endring av medier som kreves for E15 metatarsal mineralisering skal finne sted, før de ble inkubert med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) flekk i 5 minutter og deretter direkte visualisert ved hjelp av et konfokalt mikroskop ( figur 4). Vår proof of concept eksperimenter viser tydelig effektiv transduksjon. Men det ville være klokt å undersøke deler gjennom helheten av metatarsal bein å vurdere sin transfeksjon og effektiv genmanipulering.
Figur 1: Standard metodikk som brukes til å måle than Lengde og mineralisering sone embryonale metatarsal. (A) Totallengde målinger av E15 metatarsals på dag 0 av kultur (dag av disseksjon) tatt gjennom midten av metatarsal. (B) Målinger av total langsgående lengde av et metatarsal etter syv dager i kultur. Legg merke til liten avrunding i metatarsal. (C) Måling av mineralsonen lengde etter syv dager i kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vekst og Minera kapasitet Anatomisk Tydelig E15 metatarsals Imaging og måling av andre, 3. og 4. metatarsal fra bakbenet av E15 mus w.som utføres. (A) Serie bilder av andre, 3. og 4. metatarsal hele dyrkningsperioden. (B) Prosentvis økning i lengde fra dag 0 ved hver dag med kultur. (C) Mineral lengden av den andre, tredje og 4. metatarsals over kulturperiode, uttrykt som en prosentandel av den totale lengde metatarsal. Dataene i er representert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsal lengder på hver dag med kultur. Dataene i er representert som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 6). Svart bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vekst og Minera kapasitet Wild-typeE15 metatarsals Cultured i ulike osteogene Media. (A) Serie bilder av metatarsals dyrket i askorbinsyre bare, 1 mM βGP, 3 mM phosphocholine, 1,5 mM kalsiumklorid eller 3 mM kalsiumklorid som inneholder media. (B) Prosentvis økning i lengde fra dag 0 av metatarsal dyrket med ulike kosttilskudd. (C) Mineral lengde av metatarsal dyrket i ulike medier uttrykt som en prosentandel av den totale lengde metatarsal. Data er representert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) (n = 6). Svart bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Transfeksjon av E15 metatarsals med GFP Virus Partikler. (A) E15 metatarsal bein ble transfektert med GFP viruspartikler for bevis på konseptet. (B) Bones ble farget med DAPI for DNA visualisering. (C) To bilder indikerte vellykket transfeksjon av GFP-viruset gjennom helheten av metatarsal bein. Hvite striper = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kulturen i murine embryonale metatarsals gir en svært fysiologiske modell av endochondral vekst og mineralisering. Tidlige studier har bekreftet at E15 mus metatarsals gjennomgå et normalt mønster av skjelettvekst og differensiering. Brusk (chondrocytes) og bein (osteoblaster og osteoklaster) celler og deres respektive kollagen matriser er umulig å skille fra de som ble observert in vivo. Det er imidlertid anerkjent noen begrensninger av denne modell. Hastigheten på osteoclast differensiering er svekket som er bein vekst (men ikke brusk differensiering). Benvekst er ca 50% langsommere enn det som er observert in vivo, og kan være på grunn av mangler i systemiske faktorer som påvirker produksjonen av lokale faktorer (for eksempel IGF-1, BMP, etc.) 31. Dessuten er det velkjent at benet er følsom for den mekaniske miljø, og dette er også tilfelle for dyrkede metatarsals, som svarer til cHanges i mekanisk belastning 32,33. Derfor, i ubelastede situasjoner, slik det er beskrevet i denne protokollen, mineralisering og mineral resorbsjon kan være kompromittert. Ikke desto mindre byr metatarsal modellen evnen til å direkte måle lineær benvekst som ikke er mulig via 2D og 3D in vitro kultursystemer.
Vi har gitt en omfattende beskrivelse av protokollen involvert i disseksjon og kultur av E15 murine metatarsals og faktisk, for første gang, bekrefter gyldigheten av sammenslåing de to nd, 3. og 4. metatarsal for eksperimenter.
Metatarsals fra E17 / E18 blir ofte brukt for å undersøke mekanismene for bein vekst på grunn av sin ekstraordinære potensial til å vokse ex vivo for lange perioder av gangen (dvs. utover 14 dager i kultur). De er en veletablert modell for å undersøke rollene til vekstfaktorer på embryonale langsgående bein vekst.I tillegg er disseksjon og kulturen i postnatal metatarsal som vanligvis anvendes for å avgrense de mekanismene som omgir postnatal benvekst som det er underforstått at postnatal benvekst og fosterets benvekst er regulert på en annen måte 21. Den beinvekst observert i dyrkede postnatal metatarsals er imidlertid betydelig mindre enn det som ble observert i embryonale barnelærdom 25,34, noe som begrenser deres potensial i langtidsstudier og fremhever mer systemisk påvirkning på beinvekst på dette postnatal stadiet. Faktisk 3 dager gamle postnatale metatarsals fra mus er vanligvis den siste tilgjengelige som kan anvendes for å oppnå målbar vekst 34.
Her beskriver vi vår protokoll for isolering av embryoniske metatarsal bein på E15. Fraværet av hydroxyapaptite mineral i E15 metatarsal ben betyr at de gir en uovertruffen modell for å undersøke ikke bare de mekanismene som omgir langsgående bein vekst, men også initieringenav skjelettmineralisering. Den mineraliserte matrise av terminalen hypertrofisk chondrocyttransplantasjon sonen gir et stillas for å invadere osteoblaster å legge ned et bein bestemt matrise (osteoid) som deretter blir mineralisert, og som sådan denne innledende mineralisering er avgjørende for vellykket og funksjonell beindannelse 35. Faktisk en rekke nylige rapporter som benytter E15 metatarsals har bekreftet sin unike evne til etterforskningen av mineraliseringsprosessen 28,36,37. I tillegg har forskere beskrev bruken av E15 metatarsal som en modell av angiogenese 38, fremhever potensialet i embryonale metatarsal som modell utenfor benvekst / mineralisering innstilling.
Protokollen vi beskriver bare krever standard laboratorieutstyr inkludert en laminær hette, en dissekere mikroskop for å utføre disseksjon, og en CO 2 inkubator for kulturen i utskårende barnelærdom. Videre er en meget grunnleggende culture medium inneholdende aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika og L-askorbinsyre (et ko-faktor i syntesen av hydroksyprolin og hydroksylysin, to essensielle aminosyrer for produksjonen av kollagen 39) unngår bruk av udefinerte additiver, for eksempel dyr sera . Tradisjonelt har forskere lagt βGP til mediet som brukes til kultur embryoniske metatarsals men som åpenbart i våre resultater, ikke er nødvendig å bruke en ytterligere fosfatkilde for vellykket mineralisering i dette kultursystem. Dette er et viktig funn i vår streben etter å forstå mekanismene som ligger til grunn ECM mineralisering.
Metatarsals har tidligere blitt infisert med adenovirus som inneholder dominante negative former av Smad2 for å undersøke hvilken rolle transformerende vekstfaktor β i reguleringen av lange ben utvikling 40. Her finner vi også avsløre vellykket transfeksjon av vill type E15 metatarsal bein med GFP viruspartikler, noe som indikerer that lentiviral teknikker kan lett bli vedtatt å manipulere genekspresjon i metatarsal kulturer. Tilsvarende metatarsal-organkultur-system er en utmerket modell der for å sammenligne veksten av bein fra genetisk forandret mus for bedre å forstå rollen til et bestemt gen i benet vekstprosessen. Våre tidligere undersøkelser har anvendt metatarsal-organkultur-system for å bestemme rollen til suppressor cytokin signale-2 (SOCS2) i endochondral benvekst. Ved hjelp av metatarsal bein fra mus som mangler SOCS2, har vi vist at veksthormon er i stand til å simulere deres lengdevekst uavhengig av insulinlignende vekstfaktor (IGF-1), i motsetning til vill-type metatarsal ben som ikke responderer på veksthormon behandling 34, 41. Dette understreker i hvilken grad metatarsal kulturer kan bli manipulert til å undersøke effekten av ulike gener og / eller eksogene faktorer på endochondral bein vekst.
Oppsummert har vi detailedes en fremgangsmåte for vellykket utvinning og kultur av embryoniske metatarsal bein som kan manipuleres og undersøkt ved anvendelse av en rekke analyser. Denne eks vivo modellen opprett celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger, så vel som inneholder kondrocytter i ulike faser av chondrogenesis, derfor gir en mer fysiologisk modell enn celler i monolag eller 3D-kultur. Metatarsal orgel kulturer er derfor en unik modell for å undersøke de molekylære mekanismene som er ansvarlig for endochondral ossifikasjon, og er viktig for å videreutvikle vår forståelse av både bein fysiologi og patofysiologi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
| SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
| α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C |
| Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
| Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |
References
- Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
- Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
- Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
- de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
- Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
- Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
- Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
- Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
- Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
- Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
- Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
- Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
- Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
- Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
- Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
- Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
- Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
- Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
- Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
- MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
- Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
- Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
- Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
- Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
- Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
- Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
- Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
- Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
- Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
- Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
- Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
- Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
- Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
- Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).
