Introduction
Skelettet är en mycket invecklad, dynamiska och komplexa organ som har en rad funktioner som spänner från förflyttning, till jon homeostas. Består av ben och brosk, skelettet består av funktionellt distinkta cellpopulationer som verkar för att bibehålla det strukturella, biokemiska och mekaniska integritet 1. En av de främsta funktionerna hos skelettet är dess roll i utveckling och tillväxt. Dessa processer kräver orkestreringen av flera cellpopulationer som regleras genom tät endokrina och genetisk kontroll.
Med undantag för den platta ben t.ex. skulderblad, kraniet och bröstbenet är däggdjurs skelettet bildas genom processen kallas endokondral benbildning. Denna process regleras både molekylärt och rumsligt, börjar med kondensering av mesenkymala celler härrör främst från mesoderm 2. Under påverkan av transkriptionsfaktorn SOX9 celler i the inre av förtätningar differentierar till kondrocyter, uttrycka och utsöndra broskspecifika extracellulära matrix (ECM) komponenter såsom kollagen typ II och aggrekan. Celler vid kanten av kondens, uttrycker typ I-kollagen och bildar perichondrium, avgränsar den blivande benet 3. Senare osteoprogenitors av perichondrium differentiera till osteoblaster, regisserad av uttrycket av transkriptionsfaktorer, Runx2 och osterix 4. Detta leder till en dominans av osteoblaster och detta skikt döps periosteum som bildar en mineraliserad benig krage runt den mellersta delen av benet. Vaskulär penetration av periostet och invasion av brosk ställningen sker för med sig, haematopoetically härledd benresorberande celler, osteoklaster, vilka resorberar de kondrocytceller rester och mycket av den broskmatrisen 5. Utrymmena bildade fylls av osteoprogenitors ger upphov till den primära benbildningcentrum som successivt upptar kärnan i diafysen och går samman med benhinnan. Andra celler ger upphov till benmärgen. Runt födelse, blodkärl och osteoprogenitors penetrera brosk rika matris på båda sidor (epifys) i utvecklings diafys att bilda den sekundära benbildning centrum. Beläget mellan epifysen och diafys i vardera änden av de långa benen är ett band av brosk - epifys tillväxtplattan - som är ansvarig för att samordna linjär tillväxt av alla långa ben 6.
Kondrocyter inom tillväxtplattan initialt föröka och därefter fortskrida genom morfologiskt distinkta zoner, som samordnas av sekventiell expression av transkriptions och tillväxtfaktorer. Kulmen på denna händelseförloppet är utträdet från cellcykeln och hypertrofi av kondrocyter i mitten av detta brosk föregångare. Hypertrofiska kondrocyter uttrycka starkt typ X kollagen och matrix-metalloproteinas-13 (MMP13) och deras betydande utvidgning volym i riktning mot längdtillväxt ger det största bidraget till bentillväxt hos däggdjur 7,8. Vidare hypertrofiska kondrocyter mineralize deras omgivande ECM genom frisättning av matris vesiklar, membran avgränsas strukturer specialiserade för framställning av amorft kalciumfosfat genom att införliva dem av fosfataser (vävnads ospecifik alkaliskt fosfatas (TNAP) och PHOSPHO1) och kalciums kanalisera proteiner (annexiner ) 9-11. Detta förkalkade brosk invaderas av blodkärl från den underliggande benmärgen resulterar i osteoklastrekrytering och matris resorption. Detta följs av osteoblastmigrering och anpassning till ytan av förkalkade brosk resterna där de fastställer ett lager av osteoid som är snabbt mineraliserad. Den vävda benet av den primära spongiosa senare ombyggda till lamellära ben av den sekundära spongiosa 12. Epifys fusionsresulterar iupphörande av endokondral benbildning 13.
Endokondral benbildning är under sträng reglering av många endokrina och parakrina hormoner och tillväxtfaktorer för att förhindra störd utveckling och / eller längsgående bentillväxt 14. En bättre förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund dessa processer är därför viktigt i vår strävan efter kliniska framsteg mot mänsklig nytta. Tidigare forskning på likheterna och skillnaderna mellan tillväxtplattor i olika åldrar, platser och arter har avsevärt förbättrat vår förståelse av de fysiologiska mekanismer som omger tillväxtplatt dynamik 15,16. Emellertid är studien av isolerade kondrocyter svårt, eftersom avlägsnande av kondrocyter från deras omgivning kan leda till dedifferentiering, tillsammans med förlust av expression av viktiga markörer såsom Col2a1 17.
Musen metatarsal organ Explantation kultur, pioneered av professor Elisabeth Burger och kollegor i Nederländerna, är en mycket fysiologisk ex vivo modell för att studera endokondral benbildning och bentillväxt som tillväxten av ben i kultur efterliknar den som ses in vivo 18. Unikt tillåter metatarsal organodling undersökning av kondrocyter i olika faser av kondrogenes och upprätthåller cell-cell och cell-matris-interaktioner, därför att skapa förutsättningar närmare in vivo situationen än celler i odling 19-21. Dessutom tillåter direkt undersökning av linjär bentillväxt vilket inte är möjligt i primära kondrocytceller kulturer denna modell. Det möjliggör också för separation av systemiska och lokala faktorer därför gör det möjligt att särskild analys av de lokala effekter på tillväxtplattan.
Kulturen i fotbenen tillåter för undersökning av ett stort antal parametrar. Dagliga mätningar av total längd och av de mineraliserade regionerna avgrunderna kan utföras med standard faskontrastmikroskopi och bildanalysmjukvara. Histologiska, in situ hybridisering och immunhistologisk färgning kan lätt utföras på mellanfots sektioner, vilket möjliggör den rumsliga upplösningen av både cellulära och molekylära enheter, en stor fördel jämfört med traditionella cellodlingsmetoder. Den immunohistokemiska strategi omfattar detektering och kvantifiering av 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) upptag av prolifererande kondrocyter 22. Dessutom kan ytterligare bearbetning av metatarsal vävnader utföras för att möjliggöra efterföljande analys av mRNA-uttryck (RT-qPCR), protein och intracellulär analys signalering (Western blotting) eller lipidkompositionen (masspektrometri). De flesta studier hittills använda odlade embryonala fotbenen snarare än metatarsals från postnatala djur. Medan båda modellerna kan vara informativ, har studier av embryonala ben flera fördelar: de växer snabbare och kan vara explosad för att studera initieringen och utvecklingen av mineraliseringsprocessen 23-25.
Detta protokoll beskriver i detalj intrikata dissektion av embryonala fotbenen från den bakre delen av embryonala dag 15 (E15) murina embryon. Dessutom visas tillväxten och mineralisering av anatomiskt distinkta fotbenen.
Protocol
Förfaranden med djurförsök genomfördes i enlighet med den brittiska Djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 och djuren hållits i enlighet med inrikesdepartementet publicerade Code of Practice för bostäder och vård av djur som föds upp, Levereras eller används för vetenskapliga ändamål.
OBS: Experiment utförda med användning av vildtyp C57BL / 6J-möss är väl etablerade och beskrivs nedan. Embryonala metatarsalerna från olika musstammar kan på liknande odlas in vitro, även om deras tillväxt och mineraliseringshastigheter kan skilja sig till de som beskrivs häri.
1. Dissection Villkor och Beredning av instrument
- Utför alla media förberedelse, vävnader dissektioner och kulturarbete i ett laminärt flöde huva för att säkerställa steriliteten hos media och embryonala grunderna.
- Tillåt kultur och dissekering media till jämvikt under åtminstone 1 h i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator före användning.
- sterilisera dissektionsax, Dumont # 5 och Dumont # 4 pincett tillsammans ett par Superfine Vannas mikro sax (8 cm raka, 3 mm klingor) genom autoklavering. Efter autoklavering, sänk dissektion utrustning i 70% etanol före användning.
2. Beredning av Dissection och kultur Media
- Förbereda dissektion mediet
- Späd α-Minimum Essential Media (utan nukleosider, aMEM) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (1:13) och återsuspendera bovinserumalbumin (BSA) vid 2 mg / m l före filtersterilisering genom spruta en 0,22 um, 33 mm diameter filtrera.
OBS: Dissection mediet kan göras, filtersteriliserades och lagrades i alikvoter vid -20 ° C på obestämd tid.
- Späd α-Minimum Essential Media (utan nukleosider, aMEM) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (1:13) och återsuspendera bovinserumalbumin (BSA) vid 2 mg / m l före filtersterilisering genom spruta en 0,22 um, 33 mm diameter filtrera.
- Förbereda odlingsmedium
- Kultur embryonala metatarsalerna i 300 pl odlingsmedium (i varje brunn i en 24-brunnars odlingsplatta). Förbereda odlingsmediet genom tillsats av 0,2% vikt / volym BSA; 5 | j, g / ml L-ascorbic surt fosfat; 1 mM β-glycerofosfat (βGP tillval - se resultat avsnitt); 0,05 mg / ml gentamicin och 1,25 | ig amfotericin B till aMEM och filtersterilisera genom ett 0,22 | j, m, 33 mm sprut diameter filter.
3. Murina embryonala Mellanfot Dissection och kultur
- Slakta den gravida mus, hyser 15 dagar gamla embryon genom halsdislokation i enlighet med riktlinjerna för hemmakontor i Storbritannien
- Placera djuret liggande och desinficera huden genom att spraya med 70% etanol. Med användning av dissektion sax göra ett stort snitt i mittlinjen, genomträngande både huden och peritoneum för att exponera bukhålan.
- Lokalisera de två livmoderhornen av djuret i ryggregionen av kroppshåligheten. Ta bort livmoderhornen genom att först frigöra varje livmoder från mesometrium av noggranna snitt med dissektion sax och slutligen skära livmoderhornen gratis på sin bas. place livmoderhornen i dissektion medium.
- Separera varje embryo genom att skära mellan implantationsställen längs livmoderhornet och ta bort embryon från deras individuella säckar med hjälp av pincett. Slakt embryon genom halshuggning i enlighet med riktlinjer hemmakontor i Storbritannien
- Efter desinfektion av huden genom sprutning med 70% etanol, använd Vannas mikro sax för att avlägsna de bakbenen från embryona genom öppning runt den proximala femur. Detta säkerställer så mycket av bakbenet som möjligt avlägsnas. Placera bakbenen i en petriskål nedsänkt i dissektion medium före metatarsal dissekering.
- Under ett dissektionsmikroskop, börja att ta bort huden kring embryonala foten, genom att klämma och dra bort det med hjälp av # 5 pincett samtidigt hålla bakbenet stadigt med hjälp av # 4 pincett. Detta är mest effektivt utföras genom att ta tag i huden på runt nivån av skenbenet och dra i riktning mot de falanger. Användningen av sax i detta skede för att skära denmycket tunn hud är inte nödvändig.
- Håll noga tarsals av embryonala foten med # 4 pincett och ta bort de första och femte metatarsals genom att klämma ut nära tarsals med # 5 pincett och kasta.
- Med foten hålls i samma position, använd # 5 pincett att störa bindväv mellan de tre återstående falanger och metatarsals. Sätt spetsen på # 5 pincett vid skarven mellan falangerna och fotbenen att ta bort falanger från metatarsals.
- Slutligen använder # 5 pincett att störa bindväv mellan tarsals och fotbenen. Återigen placera spetsen av # 5 pincett i det gemensamma utrymmet mellan tarsals och metatarsalbenen och försiktigt fria metatarsalerna från tarsals.
- plocka försiktigt upp nu fria fotbenen med # 4 pincett och placera i färskt dissektion medium.
OBS: Noggrann dissektion bör ge 6 metatarsals från varje embryo. - När alla nödvändiga metatarsals har dissekeras, carefully place metatarsalbenen individuellt in i de förvärmda 24-brunnars plattor innehållande 300 | il av odlingsmedier. Odlings metatarsalbenen vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under upp till 14 dagar.
OBS: Ändra inte media E15 kulturer fram till åtminstone dag 5 av kulturen som detta påverkar deras mineralisering förmåga 26. Anledningarna till detta är oklara, men linjär tillväxt och matrismineralisering kan vara beroende på stimulering genom tillväxtfaktorer som frigörs från metatarsalerna.
4. Analys och manipulering av Mellanfot kulturer
- På dagen för dissektion (dag 0) gör initiala längsgående mätningar med användning av ett mikroskop med en digital kamera ansluten och bildanalysmjukvara. Mät längden på den centrala mineraliseringen zonen när den visas efter några dagars odling.
- Periodvis behov, göra ytterligare mätningar (vanligtvis varje 2: a dag) tills den sista dagen av odling vid vilken punkt metatarsal ben bearbetas beroende önskade resultaten (som diskuteras i inledningen).
- Tillägg medium kulturer metatarsal organ med olika yttre faktorer, t.ex. tillväxtfaktorer, hormoner och farmakologiska medel från dag 0 av kultur 22,24. I alla studier av detta slag, kontrollera obehandlade fotbenen krävs.
OBS: Även om det är lämpligt att styr ben är motsvarande rudiment från den kontralaterala, har det inte förekommit några skillnader i linjär tillväxt eller mineralisering potential odlade E15 2: a, 3: e och 4: e metatarsals (se nedan, figur 2) .
Representative Results
Syftet med denna metod var att isolera embryonala metatarsals och kultur dem för undersökning av longitudinella bentillväxt och ECM mineralisering. Med vår protokoll som beskrivs häri, var embryonala metatarsal ben framgångsrikt dissekeras, som visualiseras genom ljusmikroskop. Mätningar av mellanfotsbenen, som genomfördes enligt vad som anges i figur 1, visat sin förmåga att växa i längsgående längd och mineralize sin ECM (figurerna 2 och 3). Mineralisering av matrisen först noterades i mitten av diafys av benet rudiment och lätt observeras av ljusmikroskop. Ingen färgning krävs även upptaget av kalcein kan erbjuda förbättrad visualisering av nybildade mineral.
Studier där man använt embryonala fotbenen hittills 22,27,28 har poolade dissekerade 2: a, 3: e och 4: e (CENtrala tre) metatarsals, tillträdde in vitro tillväxt och mineralisering vara jämförbara. In vivo utvecklings av murina fotbenen avslöjar emellertid att den 3: e och 4: e siffror har bevis för mineralisering före alla andra metatarsals och falanger 29. Bedömning av tillväxten och mineralisering potential individuellt isolerade och odlade E15 2: a, 3: e och 4: e metatarsals visade inga signifikanta skillnader i utseende eller omfattningen av mineralisering efter 7 dagars odling (Figur 2). Ingen skillnad i den procentuella ökningen från baslinjen konstaterades under odlingsperioden. Eftersom inga skillnader i mineraliseringspotentialen noterades standardprotokollet för att slå samman de två ND 3: e och 4: e metatarsals tycks gälla för framtida studier.
Traditionellt har forskare lagt βGP mediaanvänds för att odla embryonala fotbenen att främja ECM mineralisering. Men i cellkulturstudier, har det visats att om TNAP enzym tillsätts till osteogena media innehållande βGP sker ektopisk hydroxiapatit mineralavsättning fortfarande även i frånvaro av celler 30. För att undersöka effekterna av olika mineraliserings substrat och agonister på metatarsal mineralisering kapacitet, odlade vi E15 metatarsals i odlingsmedium som innehåller en rad av kosttillskott, och bilder och längdmätningar registrerades dagligen. Resultaten visade att E15 metatarsal ben fortfarande växer och mineralize sin ECM i frånvaro av βGP. E15 mellanfot ben odlade i askorbinsyra endast media jämförbara ökningar i längd och mineralisering som metatarsals odlas i närvaro av βGP (Figur 3).
Vi har också visat att lentivirus kan användas för att transfektera exogent DNA i odlade metatarsals. Här har vi framgångsrikt transfekterade metatarsal ben på dag 0 av kultur (dvs. dag dissektion) med 2 x 10 6 grönt fluorescerande protein (GFP) viruspartiklar per metatarsal. För att aktivera virusöverföring var polybren samtidigt till kulturerna på 1: 500. Kulturerna lämnades under 7 dagar, med ingen mediaändringar som krävs för E15 metatarsal mineralisering att inträffa, innan de inkuberades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fläck under 5 min och sedan direkt visualiseras med användning av ett konfokalmikroskop ( Figur 4). Vår proof of concept experiment visar tydligt effektiv transduktion. Men det skulle vara klokt att undersöka sektioner under hela den metatarsal ben att bedöma deras transfektion och effektiv genmanipulation.
Figur 1: Standardmetoden för att mäta than längd och mineralisering zon av embryonala fotbenen. (A) Total längd mätningar av E15 metatarsals på dag 0 av kultur (dag dissektion) tas genom mitten av mellanfoten. (B) Mätningar av total longitudinell längd av en metatarsal efter sju dagar i kultur. Notera lätt krökning i mellanfoten. (C) Mätning av mineraliseringen zonens längd efter sju dagar i kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillväxt och mineralisering kapacitet anatomiskt distinkt E15 metatarsalbenen Imaging och mätning av 2: a, 3: e och 4: e metatarsals från den bakre delen av E15 möss w.som utförs. (A) Serie bilder av den 2: a, 3: e och 4: e metatarsals hela odlingsperioden. (B) Procentuell ökning i längd från dag 0 vid varje dag av kultur. (C) Mineral längden av 2., 3: e och 4: e metatarsalbenen över odlingsperioden uttryckt i procent av den totala metatarsalen längd. Data i representeras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM), (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsal längder vid varje dag av kultur. Data i representeras som medelvärde ± standardavvikelse (n = 6). Svart bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillväxt och Mineralisering Kapacitet på VildtypE15 metatarsals odlade i olika osteogent Media. (A) Serie bilder av metatarsals odlade i endast askorbinsyra, 1 mM βGP, 3 mM fosfokolin, 1,5 mM kalciumklorid eller 3 mM kalciumklorid innehållande media. (B) Procentuell ökning i längd från dag 0 av fotbenen odlade med olika tillägg. (C) Mineral längd metatarsalerna odlade i olika medier, uttryckt i procent av den totala metatarsalen längd. Data representeras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM), (n = 6). Svart bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transfektion av E15 fotbenen med GFP Virus Partiklar. (A) E15 metatarsal ben transfekterades med GFP viruspartiklar för proof of concept. (B) Bones färgades med DAPI för DNA-visualisering. (C) Dubbla bilder indikerade framgångsrik transfektion av GFP virus hela helheten av metatarsal ben. Vita staplar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kulturen i murina embryonala fotbenen ger en mycket fysiologisk modell av endokondral tillväxt och mineralisering. Tidiga studier har bekräftat att E15 mus metatarsals genomgå ett normalt mönster av skelett tillväxt och differentiering. Brosket (kondrocyter) och ben (osteoblaster och osteoklaster) celler och deras respektive kollagen matriser är omöjlig att skilja från de som observerats in vivo. Det finns dock vissa erkända begränsningar av denna modell. Hastigheten på osteoklastdifferentiering försämras som är bentillväxt (men inte brosk differentiering). Bentillväxt är cirka 50% lägre än den som observerades in vivo och kan bero på brister i system faktorer som påverkar produktionen av lokala faktorer (t.ex. IGF-1, BMP, etc.) 31. Dessutom är det väl känt att ben är känslig för dess mekaniska miljö och detta är också fallet för odlade metatarsalerna, vilka svarar på cHanges i mekanisk belastning 32,33. Därför i obelastade situationer som beskrivs i detta protokoll, mineralisering och mineral resorption kan äventyras. Ändå erbjuder nämnda metatarsala modell förmågan att direkt mäta linjär bentillväxt vilket inte är möjligt via 2D och 3D i odlings vitro-system.
Vi har gett en omfattande beskrivning av protokollet involverade i dissekering och kultur E15 murina metatarsalerna och faktiskt för första gången bekräftar giltigheten av sammanslagning 2: a, 3: e och 4: e metatarsals för experiment.
Fotbenen från E17 / E18 används ofta för att undersöka mekanismerna för bentillväxt på grund av sin extraordinära potential att växa ex vivo under långa tidsperioder (dvs mer än 14 dagar i kultur). De är en väl etablerad modell för att undersöka rollerna av tillväxtfaktorer på embryonala längd bentillväxt.Dessutom är dissekering och kultur av postnatala metatarsalerna vanligtvis används för att avgränsa de mekanismer som omger postnatal bentillväxt, eftersom det är underförstått att postnatal bentillväxt och fetal bentillväxt regleras på olika sätt 21. Bentillväxt observeras i odlade postnatal fotbenen är dock betydligt mindre än den som observerades i embryonala grunderna 25,34, vilket begränsar deras potential i långtidsstudier och lyfta fram mer systematisk påverkan på bentillväxt i denna postnatal skede. I själva verket tre dagar gamla postnatal fotbenen från möss är vanligtvis det senaste steget som kan användas för att erhålla mätbar tillväxt 34.
Här beskriver vi våra protokoll för isolering av embryonala metatarsal ben på E15. Frånvaron av hydroxiapatit mineral i E15 metatarsal ben innebär att de ger en oöverträffad modell för att undersöka inte bara de mekanismer som omger längd bentillväxt, men också att inledaskelettmineralisering. Den mineraliserade matrisen av terminalen hypertrofisk kondrocyt zon ger en byggnadsställning för invaderande osteoblaster att fastställa ett ben specifik matris (osteoid) som därefter mineraliseras och som sådan denna inledande mineralisering är avgörande för ett framgångsrikt och funktionell benbildning 35. Faktum är att ett antal nya rapporter som använder E15 metatarsals har bekräftat sin unika förmåga för undersökning av mineraliseringsprocessen 28,36,37. Dessutom har forskare beskrivit användningen av E15 fotbenen som en modell av angiogenes 38, belysa potentialen hos embryonala fotbenen som modell utanför inställningen bentillväxt / mineralisering.
Det protokoll beskriver vi kräver endast standardlaboratorieutrustning som innefattar en huv med laminärt flöde, ett dissektionsmikroskop för utförande av dissektion, och en CO2-inkubator för odlingen av exciderade rudiment. Dessutom en mycket grundläggande culture medium innehållande aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika och L-askorbinsyra (en co-faktor i syntesen av hydroxiprolin och hydroxilysin, två essentiella aminosyror för framställning av kollagen 39) undviker användning av odefinierade tillsatser, såsom djursera . Traditionellt har forskare lagt βGP till medier som används för att odla embryonala metatarsalerna men som avslöjas i våra resultat, inte är nödvändigt att använda en extra fosfatkälla för framgångsrik mineralisering i detta odlingssystem. Detta är ett viktigt fynd i vår strävan efter att förstå de mekanismer som ligger till grund ECM mineralisering.
Fotbenen har tidigare varit smittad med adenovirus som innehåller dominerande-negativa former av Smad2 att utforska rollen av transformerande tillväxtfaktor β i regleringen av långa ben utveckling 40. Här avslöjar vi också framgångsrika transfektion av vildtyp E15 metatarsal ben med GFP viruspartiklar, vilket tyder på thatt lentivirala tekniker skulle lätt kunna antas att manipulera genuttryck i metatarsal kulturer. På liknande sätt är nämnda metatarsala organodlingssystemet en utmärkt modell, i vilken för att jämföra tillväxten av ben från genetiskt förändrade möss för att bättre förstå vilken roll en viss gen i benet tillväxtprocessen. Våra tidigare studier har utnyttjat metatarsal organkultursystem för att bestämma vilken roll suppressor av cytokin signalering-2 (SOCS2) i endokondral bentillväxt. Med användning av metatarsal ben från mus med brist på SOCS2, har vi visat att tillväxthormonet kan simulera deras längdtillväxt oberoende av insulinliknande tillväxtfaktor (IGF-1), till skillnad från vildtyp metatarsal ben som inte svarar på behandling med tillväxthormon 34, 41. Detta visar i vilken utsträckning metatarsal kulturer kan manipuleras för att undersöka effekterna av olika gener och / eller exogena faktorer på endokondral bentillväxt.
Sammanfattningsvis har vi detailedde en metod för framgångsrik utvinning och odling av embryonala metatarsal ben som kan manipuleras och undersökas med hjälp av en mängd olika analyser. Detta ex vivo-modell bibehåller cell-cell- och cell-matris-interaktioner, liksom innehåller kondrocyter i olika faser av kondrogenes, därför ger en mer fysiologisk modell än celler i monoskikt eller 3D-kultur. Mellanfot organkulturer är därför en unik modell för att undersöka de molekylära mekanismer som ansvarar för endokondral benbildning, och är avgörande för att öka vår förståelse av både ben fysiologi och patofysiologi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
| SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
| α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C |
| Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
| Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |
References
- Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
- Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
- Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
- de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
- Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
- Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
- Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
- Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
- Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
- Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
- Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
- Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
- Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
- Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
- Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
- Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
- Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
- Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
- Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
- MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
- Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
- Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
- Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
- Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
- Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
- Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
- Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
- Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
- Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
- Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
- Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
- Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
- Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
- Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).
