Introduction
O esqueleto é um órgão altamente complexa, dinâmico e complexo que tem uma gama de funções que vão desde a locomoção, a homeostasia iónica. Composto de osso e cartilagem, o esqueleto consiste em populações de células funcionalmente distintos que operam para manter a sua integridade estrutural, bioquímica e mecânica 1. Uma das funções primárias do esqueleto é o seu papel no desenvolvimento e crescimento. Esses processos requerem a orquestração de várias populações celulares que são reguladas através do sistema endócrino apertado e controle genético.
Com a excepção da escápula ossos chatos por exemplo, crânio e esterno, o esqueleto dos mamíferos é formado por meio do processo conhecido como ossificação endocondral. Este processo, regulada tanto molecularmente e espacialmente, começa com a condensação de células mesenquimais derivadas principalmente a partir da mesoderme 2. Sob a influência do factor de transcrição SOX9, células em the interior das condensações diferenciar em condrócitos, expressar e segregar componentes de cartilagem específicos da matriz extracelular (ECM), tais como o colagénio de tipo II e agrecana. Células na margem da condensação, expressam colágeno tipo I e formar o pericôndrio, delineando o osso prospectivo 3. Mais tarde, os osteoprogenitores do pericôndrio diferenciar em osteoblastos, dirigido por a expressão dos factores de transcrição, e Runx2 osterix 4. Isto leva a uma predominância de osteoblastos e esta camada é renomeado o periósteo que forma um colar ósseo mineralizado em torno da secção média do osso. Penetração vascular do periósteo e invasão do andaime cartilaginoso ocorre trazendo com ela, haematopoetically células derivadas de osso, reabsorção de osteoclastos, que reabsorvem os restos de condrócitos e a maior parte da matriz cartilaginosa 5. Os espaços formados são preenchidos por osteoprogenitoras que dão origem à ossificação primáriacentro que ocupa o núcleo progressivamente da diáfise e funde-se com o periósteo. Outras células dão origem à medula óssea. Por volta de nascimento, vasos sanguíneos e osteoprogenitoras penetrar na matriz rica cartilagem em ambos os lados (epífise) da diáfise desenvolvimento para formar o centro de ossificação secundário. Situado entre a epífise e diáfise em cada extremidade dos ossos longos é uma banda da cartilagem - a placa de crescimento epifisária - que é responsável pela coordenação de crescimento linear de todos os ossos longos 6.
Condrócitos dentro da placa de crescimento inicialmente proliferar e posteriormente progredir através de zonas morfologicamente distintas, coordenados pela expressão seqüencial de fatores de transcrição e de crescimento. A culminação dessa sequência de eventos é a saída do ciclo celular e hipertrofia dos condrócitos no centro deste precursor cartilagem. condrócitos hipertróficos expressar fortemente colágeno X tipo e metaloproteinases da matriz-13 (MMP13) e sua ampliação considerável volume na direção do crescimento longitudinal fornece a maior contribuição para o crescimento ósseo em mamíferos 7,8. Além disso, condrócitos hipertróficos mineralizar sua ECM envolvente através da liberação de vesículas da matriz, estruturas de membrana delimitada especializada para a produção de fosfato de cálcio amorfo através da sua inclusão das fosfatases (tecido não-específico de fosfatase alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e proteínas de cálcio canalização (Anexinas ) 9-11. Esta cartilagem calcificada é invadido por vasos sanguíneos a partir da medula subjacente resultando no recrutamento de osteoclastos e reabsorção da matriz. Isto é seguido pela migração de osteoblastos e de alinhamento para a superfície dos restos de cartilagem calcificada onde eles estabelecem uma camada de osteóide que é rapidamente mineralizado. O tecido ósseo da esponjosa primária é posteriormente remodelado para osso lamelar da esponjosa secundária 12. fusão resulta na epifisárioscessação de ossificação endocondral 13.
Ossificação endocondral está sob regulação apertada por muitos hormônios endócrinos e parácrinos e fatores de crescimento, de modo a prevenir o desenvolvimento perturbado e / ou crescimento ósseo longitudinal 14. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares e celulares que sustentam esses processos é, portanto, imperativo em nossa busca de avanços clínicos no sentido de benefício humano. Pesquisas anteriores sobre as semelhanças e diferenças entre placas de crescimento de diferentes idades, locais e espécies têm melhorado bastante a nossa compreensão dos mecanismos fisiológicos que cercam a dinâmica da placa de crescimento 15,16. No entanto, o estudo de condrócitos isolados é difícil, tal como a remoção de condrócitos a partir de seu ambiente pode conduzir a desdiferenciação, acompanhado de perda de expressão de marcadores de chave, tais como COL2A1 17.
O mouse metatarso cultura explante órgão, pioneered pelo Prof. Elisabeth Burger e colegas na Holanda, é um modelo altamente fisiológico ex vivo para estudar a ossificação endocondral e crescimento ósseo como a taxa de crescimento dos ossos na cultura que imitam visto in vivo 18. De forma única, a cultura de órgãos metatarso permite o exame de condrócitos em diferentes fases de condrogénese e mantém-célula e as interacções célula-matriz, o que proporciona condições para mais perto a situação in vivo do que as células em cultura de 19-21. Além disso, este modelo permite o exame directo do crescimento ósseo linear que não é possível em culturas de condrócitos primários. Além disso, permite a separação de factores sistémicos e locais, por conseguinte, que permitem a análise específica dos efeitos locais sobre a placa de crescimento.
A cultura dos metatarsos permite a investigação de vários parâmetros. medições diárias de comprimento total e das regiões mineralizadas derudimentos pode ser realizada com microscopia de contraste de fase normal e software de análise de imagem. Histológica, hibridação in situ e a coloração imuno-histológica pode ser prontamente realizada em secções do metatarso, o que permite a resolução espacial de ambas as entidades moleculares e celulares, uma vantagem importante sobre os métodos tradicionais de cultura de células. A imuno-histoquímica abordagem inclui a detecção e quantificação de 5-bromo-2'-desoxiuridina absorção (BrdU) a proliferar por condrócitos 22. Adicionalmente, o tratamento posterior dos tecidos metatarsos podem ser realizados para permitir a análise a jusante da expressão de ARNm (RT-qPCR), proteína e análise intracelular de sinalização (Western blotting), ou composição lipídica (espectrometria de massa). A maioria dos estudos até agora usar metatarsos embrionárias cultivadas em vez de metatarsos dos animais pós-natais. Embora ambos os modelos podem ser informativo, o estudo dos ossos embrionárias tem várias vantagens: eles crescem mais rapidamente e pode ser exploITED para estudar a iniciação e progressão do processo de mineralização 23-25.
Este protocolo descreve em detalhes a dissecção intrincada de metatarsos embrionárias a partir do membro posterior do dia embrionário 15 (E15) embriões de ratinho. Além disso, o crescimento e mineralização dos metatarsos anatomicamente distintas é mostrada.
Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram realizados em conformidade com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e os animais foram mantidos de acordo com o Ministério do Interior publicou Código de Boas Práticas para o alojamento e tratamento dos animais criados, transmitidos ou utilizados para fins científicos.
NOTA: As experiências levadas a cabo utilizando o tipo selvagem C57BL / 6J são bem estabelecida e descrita a seguir. Metatarsos embrionárias a partir de diferentes estirpes de ratinho podem similarmente ser cultivadas in vitro, apesar de as suas taxas de crescimento e a mineralização pode ser diferente para os aqui detalhados.
1. As condições dissecação e preparação de instrumentos
- Executar toda a preparação de mídia, tecidos dissecções e trabalhar a cultura em uma capela de fluxo laminar para garantir a esterilidade da mídia e rudimentos embrionárias.
- Permitir cultura e meios de dissecção a equilibrar durante, pelo menos, 1 hora num banho a 37 ° C, 5% de CO2 antes da utilização.
- esterilizar dissecçãotesouras, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinças ao lado de um par de superfino Vannas micro tesoura (8 cm em linha reta, lâminas de 3 mm) por autoclavagem. Após autoclavagem, mergulhar o material de dissecação em etanol 70% antes da utilização.
2. Preparação de Dissecção e Meios de Cultura
- Prepare meio de dissecção
- Dilui-se meio essencial mínimo α-(sem nucleósidos, aMEM) em tampão fosfato salino (PBS) (01:13) e ressuspender a albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg / m L, antes da esterilização por filtração através de uma seringa de diâmetro de 0,22 um, 33 milímetros filtro.
NOTA: O meio de dissecção podem ser feitas, esterilizada por filtração e armazenada em alíquotas a -20 ° C indefinidamente.
- Dilui-se meio essencial mínimo α-(sem nucleósidos, aMEM) em tampão fosfato salino (PBS) (01:13) e ressuspender a albumina de soro bovino (BSA) a 2 mg / m L, antes da esterilização por filtração através de uma seringa de diâmetro de 0,22 um, 33 milímetros filtro.
- Prepare meio de cultura
- Culturas metatarsos embrionárias em 300 ul de meio de cultura (em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços). Prepara-se o meio de cultura pela adição de 0,2% w / v de BSA; 5 ug / ml de L-ASCOfosfato ácido rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opcional - veja seção de resultados); 0,05 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg de anfotericina B a aMEM e filtro de esterilização através de um filtro de seringa de 0,22 um de diâmetro, 33 mm.
3. Murino Embryonic metatarso Dissecção e Cultura
- Abater o mouse grávida, abrigando embriões de 15 dias de idade, por deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido
- Coloque o supino animais e desinfectar a pele por pulverização com 70% de etanol. Utilizando tesouras de dissecação fazer uma grande incisão na linha média, penetrar a pele e o peritoneu para expor a cavidade abdominal.
- Localizar os dois cornos uterinos do animal na região dorsal da cavidade do corpo. Retire os cornos uterinos, começando por libertar cada uterina do mesométrio por incisões cuidadosas com tesouras de dissecação e, finalmente, cortar os cornos uterinos livre em sua base. Place cornos uterinos em meio de dissecção.
- Separe cada embrião, cortando entre locais de implantação ao longo do corno uterino e remover os embriões de seus sacos individuais usando uma pinça. embriões de reforma por decapitação, em conformidade com as diretrizes de escritório em casa no Reino Unido
- Após desinfecção da pele por pulverização com 70% de etanol, usa Vannas micro tesouras para remover os membros posteriores dos embriões por incisão em torno do fémur proximal. Isto assegura tanto do membro posterior quanto possível é removido. Colocar os membros posteriores para uma placa de Petri em meio submerso dissecção antes da dissecação metatarso.
- Sob um microscópio de dissecação, começar a remover a pele ao redor do pé embrionário, por beliscar e puxá-lo usando o # 5 pinças, enquanto segurando o membro posterior constante usando o # 4 pinças. Isto é mais eficazmente realizada, agarrando a pele em torno do nível da tíbia e puxando para as falanges. A utilização de tesouras, nesta fase, para cortar opele muito fina não é necessária.
- Cuidadosamente manter os tarsos do pé embrionária com # 4 pinças e retire o primeiro e quinto metatarsos por beliscar fora perto dos tarsos utilizando # 5 pinças e descarte.
- Com o pé realizada na mesma posição, utilize o # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre as três falanges restantes e metatarsos. Insira a ponta do # 5 pinças na articulação entre as falanges e metatarsos para remover as falanges dos metatarsos.
- Finalmente, use # 5 pinças para perturbar os tecidos conjuntivos entre os tarsos e metatarsos. Mais uma vez colocar a ponta do # 5 pinças no espaço da articulação entre os tarsos e metatarsos e gentilmente liberar os metatarsos dos tarsos.
- Levante com cuidado os metatarsos agora livres com # 4 pinças e lugar em meio dissecção fresco.
NOTA: dissecção cuidadosa deve fornecer 6 metatarsos de cada embrião. - Quando todos os metatarsos necessários foram dissecados, carefully lugar metatarsos individualmente em placas de 24 poços pré-aquecido contendo 300 ul de meio de cultura. Metatarsos de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% durante até 14 dias.
NOTA: Não altere os meios de comunicação de culturas E15, pelo menos até o dia 5 de cultura como isso afeta a sua capacidade de mineralização 26. As razões para isso não são claras, mas o crescimento linear e mineralização da matriz pode ser dependente de estimulação por fatores de crescimento liberados a partir dos metatarsos.
4. Análise e manipulação de culturas Metatarsal
- No dia da dissecção (dia 0) fazer medições longitudinais iniciais utilizando um microscópio com uma câmara montada e análise de imagem digital de software. Medir o comprimento da zona de mineralização central quando aparece depois de alguns dias de cultura.
- Periodicamente, se necessário, fazer as medições posteriores (geralmente a cada 2º dia) até o último dia da cultura em que ponto mossos etatarsal são processados depende de resultados necessários (discutido na introdução).
- Médio Suplemento de culturas metatarso de órgãos com vários factores exógenos, por exemplo, fatores de crescimento, hormônios e agentes farmacológicos do dia 0 da cultura 22,24. Em todos os estudos deste tipo, o controlo não tratados metatarsos são necessários.
NOTA: Embora seja aconselhável que os ossos de controle são o rudimento equivalente da perna contralateral, até hoje não houve quaisquer diferenças no crescimento linear ou potencial mineralização da cultura E15 2º, 3º e 4º metatarsos (ver abaixo, Figura 2) .
Representative Results
O objectivo deste método foi isolar metatarsos e cultura los embrionárias para exame do crescimento longitudinal do osso e ECM mineralização. Utilizando o nosso protocolo aqui descrito, ossos metatarsos embrionários foram dissecados com sucesso, como visualizado por microscopia de luz. As medições de ossos metatarsos, realizados como indicado na Figura 1, demonstrou a sua capacidade para crescer em comprimento longitudinal e mineralizar sua ECM (Figuras 2 e 3). Mineralização da matriz é referido pela primeira vez em meados da diáfise do rudimento óssea e é facilmente observado por microscopia de luz. Nenhuma coloração é necessária, embora a absorção de calceína pode oferecer visualização melhorada do mineral recém-formado.
Estudos utilizando metatarsos embrionárias até à data 22,27,28 reuniram a dissecados 2º, 3º e 4º (CENtrais três) metatarsos, assumindo o crescimento in vitro e mineralização de ser comparáveis. In vivo do desenvolvimento de metatarsos murino, no entanto, revela que os 3º e 4º dígitos ter provas de mineralização antes de todas as outras metatarsos e falanges 29. Avaliação do potencial de crescimento e mineralização dos individualmente isoladas e cultivadas E15 2º, 3º e 4º metatarsos não revelou diferenças significativas na aparência ou a extensão da mineralização após 7 dias de cultura (Figura 2). Nenhuma diferença na percentagem de aumento da linha de base foi encontrado durante o período de cultura. Como há diferenças no potencial de mineralização foi observado o protocolo padrão de congregar as 2ª 3ª e 4ª metatarsos parece válida para estudos futuros.
Tradicionalmente, os investigadores acrescentaram βGP aos meios de comunicaçãousado para cultura metatarsos embrionárias para promover ECM mineralização. No entanto, em estudos de cultura de células, demonstrou-se que se TNAP enzima é adicionada aos meios de comunicação osteogénicos contendo βGP, a deposição mineral de hidroxiapatite ectópica ainda ocorre mesmo na ausência de células 30. Para examinar os efeitos de vários substratos de mineralização e agonistas da capacidade do metatarso mineralização, foi realizada cultura metatarsos E15 em meios de cultura contendo uma variedade de suplementos, e as imagens e medições de comprimento foram registados diariamente. Os resultados indicaram que E15 ossos metatarsos ainda crescer e mineralizar sua ECM na ausência de βGP. E15 ossos metatarsos cultivadas em ácido ascórbico meios que apenas apresentaram aumentos comparáveis de comprimento e mineralização como metatarsos cultivadas na presença de βGP (Figura 3).
Também mostrámos que lentivírus podem ser utilizados para transfectar ADN exógeno em metata cultivadasrsals. Aqui nós transfectadas com sucesso ossos metatarsos no dia 0 de cultura (isto é, dia da dissecção) com 2 x 10 6 de proteína fluorescente (GFP) partículas de vírus por verdes metatarso. Para permitir que a transdução de vírus, polibreno foi adicionada simultaneamente às culturas a 1: 500. As culturas foram deixados durante 7 dias, sem mudanças de meio, conforme necessário para E15 metatarso mineralização de ocorrer, antes de serem incubados com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha durante 5 min e, em seguida, directamente visualizadas utilizando um microscópio confocal ( A Figura 4). A nossa prova de conceito experiências mostram claramente a transdução eficaz. No entanto, seria prudente examinar as secções ao longo da totalidade do metatarso para avaliar a sua transfecção e eficaz manipulação genética.
Figura 1: Metodologia padrão utilizada para medir tele Comprimento e Mineralização Zone of embrionárias Metatarsos. (A) Total de medição do comprimento dos metatarsos E15 no dia 0 da cultura (dia de dissecção), tomada através do centro do metatarso. (B) Medidas de comprimento longitudinal total de um metatarso após sete dias em cultura. Note-se a ligeira curvatura no metatarso. (C) A medição do comprimento da zona de mineralização após sete dias de cultura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Crescimento e Mineralização Capacidade de Anatomicamente Distintas E15 Metatarsos de imagem e medição do 2º, 3º e 4º metatarsos do membro posterior de ratos E15 w.como foi executado. (A) imagens em série do 2º, 3º e 4º metatarsos durante todo o período de cultura. (B) Aumento percentual do comprimento a partir do dia 0 em cada dia de cultura. (C) comprimento Mineral do 2º, 3º e 4º metatarsos durante o período de cultura, expressa em percentagem do comprimento total metatarso. Dados em são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). (D) C57BL / 6J comprimentos metatarso em cada dia de cultura. Dados em são representados como média ± desvio padrão (n = 6). Preto bar = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Crescimento e mineralização Capacidade do tipo selvagemE15 Metatarsos cultivadas em vários meios de comunicação Osteogénica. (A) imagens seriadas de metatarsos cultivadas em apenas ácido ascórbico, βGP 1 mM, fosfocolina 3 mM, cloreto de cálcio 1,5 mM ou cloreto de cálcio 3 mM contendo mídia. (B) Aumento percentual em comprimento desde o dia 0 de metatarsos cultivadas com os vários suplementos. (C) de comprimento mineral de metatarsos cultivadas em vários meios, expressa em percentagem do comprimento total do metatarso. Os dados são representados como média ± erro padrão da média (SEM), (n = 6). Preto bar = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Transfecção de E15 Metatarsos com vírus GFP Partigos. ossos metatarsos (A) E15 foram transfectadas com partículas de vírus GFP para prova de conceito. (B) Os ossos foram coradas com DAPI para visualização DNA. (C) as imagens duplas indicada a transfecção bem sucedida de vírus GFP em toda a totalidade dos ossos metatarsos. As barras brancas = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A cultura dos metatarsos embrionárias murinas fornece um modelo altamente fisiológica de crescimento endocondral e mineralização. Os primeiros estudos têm validado que E15 metatarsos do rato passar por um padrão normal de crescimento do esqueleto e diferenciação. A cartilagem (condrócitos) e o osso (osteoblastos e osteoclastos) células e as respectivas matrizes colagénicas são indistinguíveis dos observados in vivo. No entanto, existem algumas limitações reconhecidas desse modelo. A velocidade da diferenciação dos osteoclastos é prejudicada, como é o crescimento ósseo (mas não cartilagem diferenciação). O crescimento ósseo é de aproximadamente 50% mais lenta do que a observada in vivo e pode ser devido a deficiências em factores sistémicos que influenciam a produção de factores locais (por exemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Além disso, é bem reconhecido que o osso é sensível ao ambiente mecânico e este é também o caso para metatarsos cultivadas, que respondem a CHanges em 32,33 carga mecânica. Por isso, em situações de carga, como descrito no presente protocolo, a mineralização e reabsorção mineral pode ser comprometida. No entanto, o modelo metatarso oferece a capacidade de medir directamente o crescimento ósseo linear que não é possível através de 2D e 3D em sistemas de cultura in vitro.
Nós fornecemos uma descrição abrangente do protocolo envolvido na dissecção e cultura de E15 metatarsos murino e, na verdade, pela primeira vez, confirmar a validade de reunir o 2º, 3º e 4º metatarsos para experimentos.
Metatarsos de E17 / E18 são comumente utilizados para investigar os mecanismos de crescimento de osso, devido ao seu grande potencial para crescer ex vivo por longos períodos de tempo (isto é, para além de 14 dias em cultura). Eles são um modelo bem estabelecido para investigar os papéis de fatores de crescimento no crescimento ósseo longitudinal embrionário.Além disso, a dissecção e a cultura de metatarsos pós-natal é normalmente utilizados para delinear os mecanismos que rodeiam o crescimento do osso pós-natal, como é entendido que o crescimento do osso e o crescimento pós-natal do osso fetal são reguladas de forma diferente 21. O crescimento do osso observada nos metatarsos cultivadas pós-natais é contudo significativamente menor do que a observada em rudimentos embrionárias 25,34, o que limita o seu potencial em estudos a longo prazo e destacando a influência sistémica mais no crescimento ósseo, nesta fase, pós-natal. Com efeito, 3 dias de idade de ratos pós-natais metatarsos são tipicamente o último estágio que podem ser usadas para se obter 34 crescimento mensurável.
Aqui nós descrevemos nosso protocolo para o isolamento de ossos metatarsos embrionárias em E15. A ausência de mineral nos ossos metatarsos hydroxyapaptite E15 significa que eles proporcionam um modelo inigualável para investigar não apenas os mecanismos em torno do crescimento longitudinal do osso, mas também a iniciaçãode mineralização óssea. A matriz mineralizada da zona de condrócitos hipertrófica terminal fornece um andaime para invadir osteoblastos fixar um osso matriz específica (osteóide), que é posteriormente mineralizada, e como tal esta mineralização inicial é vital para a formação óssea bem-sucedido e funcional 35. Com efeito, uma série de relatórios recentes que utilizam metatarsos E15 já confirmaram a sua capacidade única para a investigação do 28,36,37 processo de mineralização. Além disso, os investigadores descreveram a utilização de metatarsos E15 como um modelo de angiogénese 38, destacando o potencial de metatarsos embrionárias como modelo fora do ambiente de crescimento de osso / mineralização.
O protocolo, descrevemos requer apenas equipamentos de laboratório padrão, incluindo um capuz de fluxo laminar, um microscópio de dissecação para a realização da dissecção e uma incubadora de CO 2 para a cultura de rudimentos excisadas. Além disso, um cul muito básicostura contendo meio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos e ácido L-ascórbico (um co-factor na síntese de hidroxiprolina e hidroxilisina, dois ácidos aminados essenciais para a produção de colagénio 39) evita o uso de aditivos não definidos, tais como soros de animais . Tradicionalmente, os investigadores têm adicionado βGP aos meios usados para cultura metatarsos embrionárias mas como revelado nos nossos resultados, o uso de uma fonte de fosfato adicional não é necessária para a mineralização sucesso neste sistema de cultura. Este é um achado importante em nossa busca da compreensão dos mecanismos subjacentes ECM mineralização.
Metatarsos tenham sido previamente infectadas com adenovírus contendo formas dominantes negativas de Smad2 para explorar o papel do fator transformador de crescimento β na regulação do desenvolvimento a longo osso 40. Aqui, também revelam a transfecção bem sucedida de ossos de tipo selvagem E15 metatarsos com partículas de vírus GFP, indicando ttécnicas de chapéu de lentivírus podiam ser facilmente adotado para manipular a expressão de genes em culturas metatarso. Da mesma forma, o sistema de cultura de órgãos metatársico é um excelente modelo em que a comparação do crescimento de ossos de ratos geneticamente alterados para melhor compreender o papel de um gene em particular no processo de crescimento do osso. Os nossos estudos anteriores têm utilizado o sistema de cultura de órgãos metatarso para determinar o papel de supressor de citocina-2 (SOCS2) no crescimento do osso endocondral. Usando ossos metatarsos de ratinhos deficientes em SOCS2, temos mostrado que o hormônio do crescimento é capaz de simular a sua independência crescimento longitudinal de insulina como fator de crescimento (IGF-1), ao contrário dos ossos metatarsos do tipo selvagem que não respondem ao crescimento tratamento hormonal 34, 41. Isto realça a medida em que as culturas metatarsos pode ser manipulado para examinar os efeitos de diferentes genes e / ou factores exógenos de crescimento de osso endocondral.
Em resumo, temos detaiconduziu a um método para a extracção e cultura bem sucedida de ossos metatarsos embrionárias que podem ser manipulados e examinada usando uma variedade de análises. Este modelo ex vivo mantém célula-célula e as interacções célula-matriz, assim como contém condrócitos em diferentes fases de condrogénese, proporcionando assim um modelo mais fisiológico do que as células em monocamada ou cultura 3D. culturas de órgãos metatarsos são, portanto, um modelo único para investigar os mecanismos moleculares responsáveis pela ossificação endocondral, e são essenciais para promover nossa compreensão de ambos fisiologia óssea e fisiopatologia
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
| Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
| SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
| α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C |
| Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
| Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |
References
- Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
- Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
- Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
- de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
- Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. , Elsevier Academic Press. (2005).
- Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
- Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
- Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
- Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
- Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. , 22-32 (1978).
- Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
- Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
- Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
- Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
- Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
- Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
- Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
- Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
- Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
- Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
- Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
- MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
- Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
- Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
- Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
- Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
- Kaufman, M. The atlas of mouse development. , 3, Academic Press. (1992).
- Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
- Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
- Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
- Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
- Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
- Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
- Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
- Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
- Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
- Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).
