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Neuroscience

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.

Abstract

Dans la maladie de Parkinson (PD), il y a une perte neuronale répandue dans le cerveau avec une dégénérescence marquée des neurones dopaminergiques dans le snc, conduisant à la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. L'identification des neurones dopaminergiques vivant dans ventral mésencéphalique (VM) des cultures primaires en utilisant un marqueur fluorescent fournit une autre façon d'étudier la vulnérabilité sélective de ces neurones sans compter sur la immunocoloration des cellules fixes. Ici, nous isoler, dissocier, et les neurones VM de souris de culture pendant 3 semaines. Nous identifions alors les neurones dopaminergiques dans les cultures en utilisant eGFP fluorescence (entraînée par un promoteur Tyrosine hydroxylase (TH)). neurones individuels sont récoltés dans des tubes à centrifuger à l'aide de micropipettes de verre. Ensuite, nous Lyse des cellules récoltées, et nous effectuons la synthèse d'ADNc et transposon médiée "tagmentation" pour produire seule cellule ARN-Seq bibliothèques 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Après avoir passé une vérification de contrôle de qualité, les bibliothèques unicellulaires sont séquencées et l'analyse ultérieure est réalisée pour mesurer l'expression génique. Nous présentons les résultats transcriptome pour dopaminergique individuel et neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été recueillies et ont été séquencées neurones dopaminergiques. Ces techniques auront des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.

Introduction

Maladie de Parkinson (PD) est une maladie incurable liée à l'âge neurodégénérative. La cause de ce trouble relativement courant reste mal comprise. Il y a une perte généralisée des neurones dans le cerveau, avec la dégénérescence neuronale prononcée des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra (SNC), conduisant à des caractéristiques cliniques de diagnostic de la bradykinésie, la rigidité et les tremblements.

cultures mixtes primaires contenant des neurones dopaminergiques SNc sont particulièrement pertinents pour la maladie de Parkinson. Ventral tegmentale Area (VTA) neurones dopaminergiques ont été impliqués dans la récompense et la dépendance. Ventral mésencéphalique (VM) cultures embryonnaires mixtes primaires contiennent à la fois les neurones Snc VTA dopaminergique (DA) et les neurones GABAergiques. VM cultures primaires peuvent être utiles pour des essais de neuroprotection et d'élucider la vulnérabilité sélective des neurones dopaminergiques. Il n'y a aucun moyen fiable pour identifier les cellules dopaminergiques dans la culture en fonction de la morphologie. Ilre nous développons des techniques pour identifier et récolter les neurones dopaminergiques simples, et de construire une seule cellule, à rendement élevé des bibliothèques de séquençage de l'ARN.

Nous rapportons les données ARN transcriptomiques représentatives pour dopaminergique unique et les neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Ce protocole peut être utilisé pour la neuroprotection, la neurodégénérescence, et les dosages pharmacologiques pour étudier les effets de divers traitements sur le transcriptome DA / GABA. Parce que les neurones dopaminergiques représentent une petite minorité des neurones exprimés dans les cultures primaires VM, la capacité à identifier de manière fiable ces neurones dans les cultures vivantes permettra une gamme élargie d'études unicellulaires. Ces nouvelles techniques faciliteront les progrès dans la compréhension des mécanismes qui se déroulent au niveau cellulaire et peuvent avoir des applications ailleurs dans les domaines des neurosciences et de la biologie moléculaire.

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Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été menées en conformité avec les lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux fournis par les National Institutes of Health, et des protocoles ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Institut de Technologie de Californie.

1. Dérivation de dopaminergiques primaire Cultures cellulaires de cerveau embryonnaire de souris

  1. Solutions et Culture Medium
    1. Préparation de l'acide ascorbique Stock Solution
      1. Peser 352 mg d'acide ascorbique. Ajouter la lettre H 2 O stérile jusqu'à un volume total final de 20 ml. Place à 37 ° C bain d'eau pour dissoudre. Filtrer à travers la pointe de la seringue de 0,2 um et stocker dans 500 aliquotes pi à -20 ° C.
    2. Préparation de la papaïne Stock Solution
      1. Diluer papaïne à 15 unités / ml dans une solution de sel 1x Hanks' équilibrée (HBSS). Pipeter haut et en bas 5 fois pour bien mélanger. Préparer le jour de la dissection.
    3. Préparation de DNase Stock Solution
      1. Peser 20 mg de DNase. Ajouter la lettre H 2 O stérile jusqu'à un volume final total de 20 ml. Filtre stérile avec 0,2 um pointe de filtre seringue. Conserver à -20 ° C en aliquotes de 1 ml.
    4. Préparation de la solution d'arrêt
      1. Diluer 5 ml de sérum de cheval donneur équin à 10% dans 45 ml de 1 x HBSS. Filtre stérile avec une pointe de filtre à seringue de 0,2 um. Conserver à 4 ° C.
    5. Préparation de 4% de sérum albumine bovine (BSA) solution mère
      1. Peser 2 g de BSA et ajouter 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) jusqu'à un volume final total de 45 ml. Filtre stériliser à 0,2 um bout filtre de seringue. Conserver à 4 ° C.
    6. Préparation de Placage Medium
      1. Dans 494 ml de milieu, ajouter 1,25 ml de milieu de culture qui contient de la L-alanyl-L-glutamine (une source stabilisée de la L-glutamine) et 5 ml de sérum de cheval donneur. Filtre stériliser à 0,2 um seringue filpointe de ter. Conserver à 4 ° C.
    7. Préparation du milieu de culture cellulaire
      1. Dans 196 ml de milieu de placage, ajouter 4 ml B27 et 200 ul d'acide ascorbique. Stériliser par filtration avec filtre de 0,2 um. Conserver la solution à 4 ° C et utiliser dans une semaine.
    8. Préparation de 4% paraformaldéhyde (PFA) Solution
      Attention: les précautions générales d'utilisation de paraformaldéhyde sont les suivantes: Utilisez une hotte, éviter le contact avec la peau et les yeux, éviter l'inhalation de la vapeur, tenir à l'écart de la chaleur ou des flammes nues. Porter un vêtement de protection individuelle approprié. PFA peut entraîner une sensibilisation et une dermatite, donc laver soigneusement les mains après manipulation.
      1. Ajouter 10 ml de 16% de PFA à 30 ml de 1 x PBS, pH 7,4.
    9. Préparation de 0,1% de Triton X-100
      1. Introduire à la pipette 1 ml de Triton X-100 dans du PBS 1X 9 ml pour obtenir une solution à 10%. Pipette lentement pour permettre une solution visqueuse pour remplir la pointe de la pipette. Chaud en 37 ° C bain d'eau à disrésoudre. Conserver 10% stock à 4 ° C.
      2. Diluer 10% actions à 0,01% (par exemple, en effectuant 2 série des dilutions 1:10: diluer 1 ml de solution à 10% dans 9 ml 1x PBS pour préparer une solution à 1%; 1 ml de solution à 1% dans 9 ml 1x PBS pour faire une solution à 0,1%).
    10. Préparation de 10% et 1% de sérum d'âne
      1. Ajouter 1 ml de sérum d'âne à 9 ml de PBS 1x pour une solution à 10%. Ajouter 0,5 ml de sérum d'âne à 49,5 mL de PBS 1x, pH 7,4 pour une solution à 1%.
    11. Préparation du PBS 1x
      1. Diluer 10x PBS 1x par addition de 50 ml dans 450 ml de H 2 O. ajuster le pH de la solution à pH 7,4 en utilisant un pH - mètre.
  2. Le revêtement des plats Culture
    1. Poly-L-ornithine Revêtement
      1. Une seule couche de 10 mm à fond de verre de diamètre au centre de tous les plats de 35 mm avec 120 ul de poly-L-ornithine en utilisant une technique stérile. Incuber pendant 1 h à 37 ° C. Utilisez un aspirateur à vide pour aspirer le poly-Lornithine. Rincer les plats deux fois avec H 2 O. stérile
    2. Laminine Coating (concentration du stock de 1 mg / mL)
      1. Diluer 20 pi de laminine avec 2 ml d'H 2 O stérile (concentration finale de 0,01 mg / ml).
      2. Une seule couche de 10 mm à fond de verre de diamètre au centre de tous les plats avec 120 pi de laminine diluée à 0,01 mg / ml en utilisant une technique stérile, et incuber pendant 1 h ou O / N à 37 ° C avant utilisation.
  3. Souris Dissection
    REMARQUE: Les méthodes décrites dans cette dissection sont conçues pour une exposition minimale des cellules, telles qu'elles sont transférées à partir des sacs embryonnaires à l'incubateur de culture. La viabilité des cellules est préservée en enlevant uniquement une partie du cerveau pour la dissection du cerveau moyen. L'isolement du produit mésencéphale plus rapidement sans la nécessité de disséquer le cerveau entier pour accéder à la région. Voir le tableau des matériaux pour la souche de souris utilisée dans cette étude. Euthanasier une souris enceinte chronométré sur la gestation de 14 jours en utilisant le CO 2.
  4. Vaporiser l'abdomen de la souris euthanasiées avec 70% d'éthanol. Attrapez la peau de l'abdomen inférieur en utilisant une pince avec 2 x 3 dents et ouvrir la cavité abdominale en utilisant la lame émoussée ciseaux chirurgicaux. Faire deux entailles se déplaçant latéralement et proximale de chaque côté. Replier la paroi abdominale en utilisant une pince pour exposer la cavité abdominale.
    NOTE: L'utérus est maintenant exposée. Exposer la cavité pleurale et la création de pneumothorax assure également que l'animal ne se rétablit pas.
  5. Couper les deux extrémités de la corne utérine pour séparer l'utérus. Placer dans une boîte de Pétri dans une hotte stérile.
  6. En utilisant une pince droite pointe dans chaque main ouvrir le sac embryonnaire et retirer l'embryon. décapite rapidement en pinçant la tête hors au niveau du cou avec la pince. Stabiliser la tête avec la pince solidement placé sur le museau de telle sorte que la surface dorsale est accessible.
  7. Utilisation de la pince tenue à l'autre hand, pincer la couche de la peau et le crâne juste avant la crête du mésencéphale. Peler la peau et le crâne caudale le long de la ligne médiane. Placez la pince autour de la crête avec une pointe entre le cortex et le mésencéphale et l'autre sur le cervelet.
  8. Pincez et retirez l'ensemble du mésencéphale, laissant derrière le cerveau antérieur sur le côté rostrale et le cervelet du côté caudal. Placez dans une boîte de Pétri avec HBSS froid sous un microscope à dissection.
  9. Répétez la procédure pour les embryons restants.
  10. Sous le microscope de dissection, retournez sur le segment du cerveau de telle sorte que la face ventrale est maintenant accessible. Il y a maintenant 4 quadrants visible. Retirez tous les méninges et vasculature en saisissant délicatement les méninges et en tirant vers le haut loin du cerveau.
  11. Utilisez une pince pour stabiliser le segment du cerveau tout en séparant le mésencéphale. Placez une tong de pinces dans le ventricule à peu près au centre du segment. Faire la première dorsalement de pincement, pointant into le plat, puis médial de chaque côté. Prenez les deux quadrants inférieurs en faisant des coupes latérales des deux côtés.
    NOTE: Le tissu d'intérêt est dans la partie inférieure ventrale, qui apparaît dense. Cette région contient à la fois le VTA et la SNc.
  12. Couper et jeter le tissu qui est moins dense: cela inclut la collicules supérieure et inférieure. Placez le tissu disséqué contenant à la fois le VTA et Snc à HBSS frais sur une zone séparée de la boîte de Pétri.
    Remarque: À ce stade du développement du cerveau de souris (E14), la région d'intérêt dans le mésencéphale ventral est séparé par un ventricule du zona incerta et d'autres groupes de cellules hypothalamiques. La structure plus allongée du cerveau de souris en développement embryonnaire permet de distinguer parmi ces zones qui se trouvent plus rapprochées dans le cerveau de souris adulte.
  13. Répéter l'opération pour tous les segments restants du cerveau.
  14. Après que tous les segments du cerveau ont été disséqués, utilisez une pince et un scalpel n ° 11 à ea trimestresection mésencéphale ch en morceaux de taille à peu près égale.
  • Dissocier les cellules
    1. Le traitement enzymatique des cellules
      1. Utiliser un embout pipette P1000 grand alésage pour prendre tous les segments du mésencéphale écartelés dans le HBSS et les placer dans un tube de 15 ml conique. Laissez les segments se déposent au fond du tube et enlever HBSS qui a été prise avec les pièces en quartiers.
      2. Ajouter 500 pi de solution de papaïne dans le tube et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Resuspendre les cellules par le doigt effleurant le tube après 7,5 min.
      3. En utilisant une pointe de P1000 grand alésage, pipettes uniquement les segments du mésencéphale dans une aliquote de 1 ml de I (DNase) solution de désoxyribonucléase. Permettre aux segments de se déposer au fond du tube.
      4. En utilisant une pointe de P1000 grand alésage, transférer uniquement les segments du mésencéphale à un tube de 15 ml contenant 1 ml de solution d'arrêt à froid pour rincer. Que les segments se déposent au fond du tube et répéter le rinçage àCE plus.
    2. La trituration mécanique de suspension cellulaire
      1. Remplacer le dernier rinçage avec 1 ml de solution d'arrêt fraîche et pipette de haut en bas 7x avec une pointe de pipette P1000 à triturer cellules. Éviter une trituration excessive pour réduire au minimum la lyse cellulaire.
      2. Sous-couche de la suspension de cellules par pipetage lentement 200 pl de solution de BSA à 4% dans le fond du tube. retirer délicatement la pointe de la pipette pour éviter de perturber la couche de suspension de cellules. Après centrifugation à 280 g pendant 6 min, le surnageant à aspirer P1000 et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu d'étalement.
  • Comptage et Placage les cellules
    1. Effectuer le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Diluer la suspension cellulaire 1.000 cellules / ul, avec placage milieu.
    2. L'utilisation d'un aspirateur à vide, aspirez le laminine des plats enrobés, par lots d'au plus trois plats. Plaque 120 pi (1,2 x 10 5 cellules / boîte (78,5 mm 2
    3. Après 1 h, ajouter avec précaution 3 ml de milieu de culture à une zone non ensemencée de la boîte de culture pour minimiser la perturbation de cellules.
    4. Effectuer un demi à changement de milieu complet sur des boîtes de culture cellulaire à des intervalles de 3 j pendant 3 semaines.

    • Neurones 2. récolte Cultured-dopaminergiques pour ARN Séquençage

    NOTE: Une vue d' ensemble du protocole cellulaire récolte et une seule cellule ARN-séquençage est donnée à la figure 1.

    1. Étapes à effectuer avant le jour de l'expérience
      1. Nettoyer le verre borosilicate capillaire tube par sonication dans 100% d' éthanol pendant 15 min, puis à nouveau dans H2O distillée pendant 15 minutes. Égoutter le tube et cuire au four pendant une nuit dans un four à 200 ° C pour inactiver RNase.
      2. Utilisez fraîchement ouvertembouts de pipette sans RNase pour préparer une solution stock de 10x tampon de réaction en mélangeant 19 pi de 10x tampon de lyse du kit de séquençage avec 1 pl de la solution d'inhibiteur de RNase (20 pl de volume total) dans un tube à centrifuger. Isoler le mélange brièvement à l'aide d'une micro-centrifugeuse et garder sur la glace.
      3. Ajouter 2 ul de tampon de réaction 10X à chacun des tubes individuels de PCR ml (0,2 utilisées pour collecter les neurones) récoltés. Etiqueter les tubes avec des étiquettes appropriées identifiant les neurones à récolter et stocker congelés à 4 ° C.
    2. Etapes à effectuer sur le jour de l'expérience
      1. Fabrication des Pipettes récolte.
        1. Pipette à tirer de grand diamètre à pointe (2-8 um) à partir du tube capillaire au four à l'aide d'un extracteur de micro-électrodes et le filament chauffant d'un microforge revêtu de verre. Réglez l'extracteur pour former micropipettes avec un long cône. Utilisez un microforge équipé d'un réticule oculaire calibré et un ob-haute puissancejectif de briser la pointe de la micropipette à la taille de la pointe souhaitée (10 - 20 um).
        2. Fixer la micropipette dans le porte-pipette microforge et monter le support sur le microforge. Apportez la pointe de la micropipette dans le foyer au-dessus du filament chauffant revêtu de verre en utilisant le manipulateur mécanique du microforge et l'interrupteur du courant au filament pour la chauffer. Appuyez sur la pointe de la pipette au filament chauffé. Coupez le courant lorsque la pointe de la pipette a fondu au diamètre approprié.
          REMARQUE. Éteindre le courant provoque le filament de se déplacer brusquement vers le bas et se détacher de la pointe de pipette, produisant une grande pipette, ouverte à bout avec le diamètre désiré.
        3. Stocker les micropipettes complétés dans une boîte fermée jusqu'à ce que nécessaire.
      2. La récolte des Neurones.
        REMARQUE. On a récolté les cultures de neurones suite à une version modifiée d'un protocole précédemment publié 6.
        1. Bien clean toutes les surfaces de la salle de cellule récolte qui entrent en contact avec les plats de cultures et des tubes de collecte en utilisant un liquide désinfectant et de l'eau suivi d'un rinçage à l'eau. Essuyez les surfaces désinfectées avec 80% d'éthanol, puis essuyez une RNase-inhibiteur infusé.
        2. Remplir deux contenants isothermes avec de la glace, une avec (eau) régulière de la glace et un autre avec de la glace sèche. Placer les PCR de 0,2 mL collection de tubes remplis précédemment avec 2 pi de 10x tampon de réaction sur la glace régulière.
        3. Retirer la boîte de culture contenant les neurones de l'incubateur, drainer le milieu de culture de l'antenne, rincer avec 2 ml de PBS de RNase Dulbecco (DPBS) et le remplacer par 1 ml de DPBS pour la récolte.
        4. Identifier fluorescents, les neurones TH-positifs dans les cultures mésencéphale primaires à l'aide d'un inversé, microscope à épifluorescence équipé d'un objectif 40X de phase, une lampe Hg, et un jeu de filtres de GFP.
        5. Placez la pipette sur le soma cellulaire à l'aide d'un mi motorisé ou manuelcromanipulator. Aspirer le neurone dans la micropipette de verre en utilisant une aspiration douce appliquée par la bouche à travers le tube en plastique fixée à l'orifice latéral du porte-micropipette. Retirer immédiatement la micropipette contenant la cellule à partir de la solution de bain.
        6. Placez la pointe de la pipette dans un contenant tampon de réaction PCR 0,2 mL de collecte de tube, et de briser la pointe contre le côté du tube, près du fond. Expulser le liquide restant (0.5 - 1.5 pi) à partir de l'extrémité cassée de la micropipette en plaçant une aiguille de 21 G seringue stérile à l'arrière de la micropipette et en appliquant une pression vers l'extérieur.
        7. Centrifuger le tube de collecte pour 5 s en utilisant un ordinateur de bureau micro-centrifugeuse et le congeler dans de la glace sèche. Conserver les tubes de prélèvement contenant les cellules individuelles à -80 ° C. Typiquement, les 5 cellules sont récoltées par boîte sur une période de 1 h à température ambiante.

    3. unicellulaire ARN-Seq Generation Library

      <li> Génération du premier brin d'ADNc
      NOTE: Pour les étapes suivantes utilisent des réactifs du kit de séquençage commercial.
      1. Amener les réactifs ci-dessous sur la glace à l'armoire PCR. Préparer un premier mélange maître brin plus 10% en combinant les réactifs suivants à la température ambiante dans une armoire PCR: 2 pl 5x tampon premier brin, 0,25 ul de DTT (100 mM), 1 pl de mélange de dNTP (10 mM), 1 ul oligonucléotide ( 12 uM), 0,25 pi RNase Inhibitor, et 1 ul de transcriptase inverse (100 unités). Ceci est le maître de la transcriptase inverse mélange (5,5 pi de volume total par réaction).
      2. Prenez les échantillons du -80 ° C sur de la glace sèche et porter à l'armoire PCR. Ajouter ce qui suit à l'échantillon de cellule unique: 1 pi 3 'amorce 1 et 1 ul quantifiée pointes d'ARN. Apportez des échantillons sur un bloc de refroidissement à un thermocycleur préréglée chaud couvercle à 72 ° C.
      3. Incuber les tubes dans le thermocycleur pendant 3 min à 72 ° C, puis mettre les échantillons sur une grille de refroidissement PCR.Ajouter 5,5 pi du mélange maître (de l'étape 3.1.1) à chaque tube de réaction et mélanger par pipetage. Faire tourner les tubes de 0,2 pi pendant 5 s et on incube dans un thermocycleur comme suit: 42 ° C pendant 90 min, 70 ° C pendant 10 min. Tenir à 4 ° C.
    1. Purification de Amplified premier brin d'ADNc.
      NOTE: L'ADNc amplifié par PCR est purifié par immobilisation sur des billes magnétiques. Utiliser un dispositif de séparation magnétique pour tubes de 0,2 ml.
      1. Aliquoter les billes magnétiques dans des tubes de 1,5 mL. Avant chaque utilisation, apportez aliquotes de perles à la température ambiante pendant au moins 30 minutes et bien mélanger pour disperser. billes magnétiques Vortex jusqu'à mélangés de façon homogène.
      2. Ajouter 25 ul de billes magnétiques pour chaque échantillon. Mélanger en pipetant la totalité du volume de haut en bas au moins 10x pour bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 8 min pour laisser l'ADNc se lient aux billes.
    2. Préparation du PCR Master Mix
      1. Préparer le mélange maître ds-ADNc amplification par PCR pour toutes les réactions avec un suppional 10% en mélangeant du tampon 5 ul de PCR 10X, 2 ul de mélange de dNTP (10 mM), 2 pi amorce de PCR 2 (12 pM) 2 pl 50x 2 un mélange de polymerases et 39 ul d'eau sans nuclease (50 pl de volume total / réaction).
    3. L'amplification du premier brin
      1. Placer les échantillons et les billes magnétiques sur la séparation magnétique dispositif ≥5 min, jusqu'à ce que le liquide soit complètement clair, et il n'y a pas de perles laissées dans le surnageant.
      2. Garder les échantillons sur le dispositif de séparation, pipette le surnageant et le jeter. Faire tourner les échantillons pendant 5 s pour recueillir le liquide à partir du côté du tube. Placer les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant 30 s, puis retirez tout le surnageant restant avec une pipette P10.
      3. Ajouter 50 ul du mélange maître de PCR pour l'ADN de chaque tube contenant liée aux billes de l'étape précédente. Placer le tube dans un cycleur thermique préchauffé (95 ° C) avec un couvercle chauffé. Commencer le cycle thermique utilisant le progra suivantm: 95 ° C pendant 1 min, 26 cycles de 95 ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 6 min. Puis 72 ° C 10 min. Tenir à 4 ° C.
        REMARQUE: Consultez l'utilisateur de séquençage manuel pour plus de détails et pour optimiser les réglages de l'échantillon.
    4. Purification de l'ADNc Amplified double brin
      1. Ajouter 90 ul de billes à chaque échantillon. Mélanger en pipetant la totalité du volume de haut en bas au moins 10x pour bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 8 min pour laisser l'ADNc se lient aux billes. Placer les échantillons ainsi que des perles sur le dispositif de séparation magnétique pour ≥5 min, jusqu'à ce que le liquide soit complètement clair, et il n'y a pas de perles laissées dans le surnageant.
      2. Bien que les échantillons sont sur le dispositif de séparation magnétique, éliminer le surnageant et le jeter. Gardez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique. Ajouter 140 ul de fraîchement préparé 85% d'éthanol à chaque échantillon sans perturber les perles. Attendre 30 s. Pipeter le surnageant. ADNc restera lié à la beads lors du processus de lavage.
      3. Répétez le lavage à l'éthanol une fois de plus.
      4. centrifuger brièvement les échantillons pour recueillir le liquide à partir du côté du tube. Placer les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant 30 s, puis retirez tout l'éthanol restant avec une pipette. Placer les échantillons à température ambiante pendant 2 à 2,5 min jusqu'à ce que le culot est sec et ne brille plus (avant une fissure apparaît).
        NOTE: Sécher le culot seulement jusqu'à ce qu'il est juste sec. Le culot se penchera mat sans brillance. Si le culot est pas sec, l'éthanol restera dans les puits d'échantillon, ce qui permettra de réduire le taux de récupération d'ADNc amplifié et le rendement. Si le culot est trop sec, il y aura des fissures dans la pastille. Il faudra plus de 2 min pour réhydrater et peut réduire la récupération d'ADNc amplifié et le rendement.
      5. Une fois que les billes sont sèches, ajouter 22,5 pi de tampon d'élution pour couvrir le culot de perles. Retirer les échantillons du dispositif de séparation magnétique et bien mélanger pour remettre en suspension les perles. Danscubate à température ambiante pendant 10 min à réhydrater.
      6. Faire tourner les échantillons pendant 5 s pour recueillir le liquide à partir du côté du tube. Placer les échantillons de retour sur le dispositif de séparation magnétique pour ≥1 min, jusqu'à ce que la solution est tout à fait clair.
        NOTE: Une petite population de perles peut ne pas sédimenter contre l'aimant pendant l'incubation. Pipeter ces perles non pastillée vers le haut et vers le bas pour les remettre en suspension avec le surnageant, puis la pipette eux vers l'aimant, où le reste des perles ont déjà granulée (sans perturber le culot existant).
      7. Continuer l'incubation jusqu'à ce qu'aucune des billes restent dans le surnageant. Transférer le surnageant clair contenant de l'ADNc purifié à partir de chaque tube à un tube à faible adhérence sans nucléase. Etiqueter chaque tube avec des informations échantillon et conserver à -20 ° C. Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C indéfiniment.
    5. Mesure de la concentration de l'ADN et la taille Fragment
      1. Effectuer une vérification de contrôle de qualité en quantifiant un 1 ul alIQUOT de l'ADNc sur un fluoromètre. Évaluer 1 ul (3 ng) d'ADNc-ds en utilisant un système d'électrophorèse (comme décrit en 1).
    6. Fragmentation de l'ADN
      REMARQUE: Utilisez un kit de préparation d'ADN de l'échantillon.
      1. Ajouter 20 pi d'ADNc (35 ng au total) à un tube. Ajouter 25 ul d'ADN Tagment (TD) du tampon dans le tube contenant l'ADNc.
      2. Ajouter 5 ul de TDE1 (Tagment ADN Enzyme) au tube. Pipeter haut et en bas 10x pour mélanger. Utilisez une nouvelle astuce pour chaque échantillon. Centrifuger à 280 g à 20 ° C pendant 1 min.
      3. Placer les échantillons dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé et l'exécuter à: 55 ° C, 5,5 min. Rapidement ajouter 50 pi de solution QG (kit d'extraction de gel). Pipeter haut et en bas 10x pour mélanger. Continuer directement à l'étape suivante.
    7. Purification de l'ADN Fragmenté
      1. Ajouter 170 pi de perles, pipette de haut en bas 10x pour mélanger. Laisser reposer pendant 10 min. Mettez les tubes sur l'aimant. Laissez les tubes sont assis sur l'aimant pendant 10 min.Bien que les échantillons sont sur le dispositif de séparation magnétique, pipette le surnageant et le jeter.
      2. Laisser le tube sur l'aimant et ajouter 200 ul d'éthanol à 85%. Laisser reposer pendant 30 s, puis retirer l'éthanol. Répétez le lavage à l'éthanol. Spin the xg tube de 1000 à la température ambiante.
      3. Placer le tube de retour sur l'aimant. Pipeter hors tout éthanol résiduel. Laissez les échantillons sécher à température ambiante pendant 15 min.
      4. Ajouter 21 ul de tampon d'élution du kit d'extraction de gel. Laissez reposer le tube hors de l'aimant, la pipette de haut en bas 10x pour mélanger. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 15 min.
      5. Retour le tube à l'aimant pendant 5 min. Introduire à la pipette 20 ul de la solution (ADN purifié) dans un nouveau tube.
    8. Tagging et PCR Amplification de l'ADN Fragmenté
      NOTE: Dans cette étape, l'ADN purifié est amplifié par PCR au moyen d'un programme limité de cycle. L'étape PCR ajoute également l'indice 1 (i7) et l'indice 2 (i5), ainsi que des adaptateurs communs (P5 et P7) (requis pour la production de la grappe et séquençage). Reportez-vous à l'ADN sguide de préparation suffisant pour plus de détails.
      1. Dans un nouveau tube ajouter 5 ul d'indice 2 amorces (bouchon blanc). L'utilisation d'un nouvel embout de pipette, ajouter 5 pl d'index 1 amorce (bouchon orange). Ajouter 15 pi de mélange maître PCR dans chaque tube.
      2. Ajouter 5 ul de cocktail de PCR amorce à chaque tube. Ajouter 20 ul de l'ADN purifié au tube. pipette doucement vers le haut et vers le bas 3 - 5 fois.
      3. Effectuer une PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur: 72 ° C pendant 3 min, 98 ° C pendant 30 s, 5 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 63 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 3 min. Tenir à 10 ° C. Procéder immédiatement à la PCR clean-up ou de stocker l'échantillon à 4 ° C pendant 2 d.
    9. Purification de fragments d'ADN Amplified
      1. Apportez les perles à RT. Préparer une solution fraîche à 85% d'éthanol. Prélever des échantillons en machine PCR et centrifuger brièvement.
      2. Ajouter 30 ul de billes dans le tube. Doucement pipette mélanger haut et en bas 10x. Laissez le tube reposer à température ambiante pendant 5 min. Lieu back sur l'aimant pendant 5 min. Avec le tube sur l'aimant en utilisant une pipette pour éliminer le surnageant.
      3. Ajouter 200 ul d'éthanol à 85% à chaque tube. Pipette éthanol après 30 s. Répétez le lavage à l'éthanol 85%. Pipette éthanol après 30 s.
      4. Avec les tubes fixes sur l'aimant et les bouchons ouverts, permettre aux billes sécher à l'air pendant 15 min. Retirer les tubes de l'aimant.
      5. Ajouter 32,5 ul de tampon d'élution. pipette doucement vers le haut et vers le bas 10x. Incuber hors l'aimant pendant 10 - 15 min.
      6. Remettre les tubes à l'aimant pendant 2 minutes, ou jusqu'à ce que le surnageant a été compensé. transférer soigneusement 30 ul du surnageant dans un nouveau tube.
    10. Mesure de la concentration de l'ADN et le fragment Taille
      1. Effectuer une vérification de contrôle de la qualité par la quantification de la concentration d'ADN de 1 ul de l'ADNc sur un fluoromètre. Déterminer la taille des fragments d'ADN par électrophorèse. Évaluer 1 pi (3 ng) de ds-ADNc.
    11. séquençage
      1. Apportez les bibliothèques d'ARN-Seq seule cellule à une installation de séquençage. Générer 100 pb séquençage lit sur un séquenceur suivant un protocole précédemment publié 4.
        NOTE: Chaque bibliothèque de séquençage génère> 20 millions uniquement la cartographie lit.

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    Representative Results

    Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d' une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de la tyrosine hydroxylase, la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome d'ARN en utilisant l' ARN-seq (figure 1). Les données montrent que 100% des cellules TH-EGFP-positives qui ont été récoltés et séquencés sont des neurones dopaminergiques, basée sur la présence des trois transcrits du gène de DA liés suivants, TH, la dopa décarboxylase (DDC), et le transporteur de la dopamine DAT (SLC6A3). Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l'ARN-Seq. Dans chaque banque d'ARN-Seq unicellulaire 6000 - 8000 gènes codant des protéines ont été détectées (figure 2). Les neurones dopaminergiques expriment vigoureusement la transcription liés à la dopamine , en plus de plusieurs sous - unités du récepteur nicotinique de l' acétylcholine (nAChR) (tableau 1). Nous avons observé que past toutes les cellules qui étaient négatifs pour les TH étaient GABAergique; donc nous avons défini les cellules comme GABAergique basées sur la présence de la transcription GAD1 tel qu'évalué par l'ARN-seq. Les cellules qui nous avons défini les neurones GABAergiques n'expriment pas transcrits liés à la dopamine, mais comme mentionné n'expriment un gène majeur pour la synthèse de GABA, GAD1. Les bibliothèques monocellulaires ont également révélé longue ARN non codant, ainsi que des transcrits codant pour des chaînes, des récepteurs, des protéines nucléaires, les histones, les protéines des organites et des facteurs de transcription.

    Figure 1
    Figure 1. ARN-Seq dans Neurones individuels, comme Interprété dans nos expériences sur les cultures TH-eGFP souris Mésencéphale primaires. (1) Culture TH-eGFP souris neurones ventraux pendant 3 semaines. (2) Identifier les neurones isolés fluorescents par GFP passionnante en utilisant une source de lumière Hg et FITC filtre / GFP. (3) With le même objectif 40X dans l'optique de phase, de visualiser les neurones simples et positionner correctement la pipette. (4-5) Aspirer la cellule unique dans la micropipette de verre. Images montrent une cellule après la récolte: (4) Phase 40X; (5) la fluorescence de la EGFP. (6) des cellules Lyse avec du tampon de lyse avec de l' oligo-dT à 72 ° C. (7) Synthèse de l' ADNc; 26 cycles d'amplification. (8) un transposon à médiation par "tagmentation" d'ADNc. (9) Contrôle de contrôle de la qualité de l' ADNc et séquençage multiplexé. (10) l' analyse computationnelle subséquente en utilisant Tophat, Cufflinks et Cuffdiff 7. L'abondance relative des gènes exprimés a été mesurée en unités de fragments par kilobase de la transcription par million mappé lit (FPKM). L'objectif de l'ARN-seq est de fournir une liste de gènes exprimés dans une cellule et leur abondance relative. Images (2-4) sont de la wor actuellek, (6-10) sont modifiés à partir d' un précédent rapport 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    La figure 2. Le nombre de protéines de codage des gènes détectés dans les bibliothèques unique dopaminergique ARN-Seq générés à partir de cellules TH-eGFP-positifs. 6000 - 8000 gènes de protéines ont été détectées dans les bibliothèques de cellules isolées. FPKM: Fragments par kilobase de la transcription par million mappé lit (FPKM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Genes DA cellules individuelles n = 10 Cellules individuelles GABAergiques n = 7
    FPKM (moyenne ± SEM)
    TH 4714 ± 764 1,2 ± 0,14
    DDC 779 ± 167 0,8 ± 0,1
    SLC6A3 / DAT 506 ± 144 0,5 ± 0,04
    DRD2 14 ± 8 0,1 ± 0,004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    CHRNA4 (α4) 17 ± 5 26,4 ± 2,3
    CHRNB2 (β2) 9 ± 3 17,3 ± 1,2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    GAD1 0.0 959,0 ± 70,0
    HTR3A 0.0 0,6 ± 0,01
    Htr3b 0.0 0.0

    Tableau 1. et nAChR Gene Transcriptions en dopaminergique et GABAergique Neurones au jour 21 dans les cultures VentrMidbrain liées Dopamine. données d'ARN-Seq pour les neurones positifs et négatifs TH-eGFP sont présentés. Les cellules individuelles ont été récoltées le jour de la culture 21. Les données d'ARN-Seq montrent que les neurones positifs TH-eGFP avaient des niveaux élevés de transcrits de gènes DA-connexes, y compris la tyrosine hydroxylase (TH), dopa décarboxylase (DDC), le transporteur de la dopamine DAT (SLC6A3) , et le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (nAChR) sous-unités dont α6, α4, β2 et β3. Cependant, ces cellules avaient de faibles niveaux de l'acide glutamique décarboxylase du gène marqueur GABAergique 1 (GAD1) ​​et la sérotonine 5-HT3 récepteur A et des sous-unités B (HTR3A et Htr3B). neurones GABAergiques ont faible à aucun niveaudes transcriptions DA liées gènes, chrna6, chrnb3 et HTR3A / B, mais qui ont des niveaux élevés de GAD1. ARN-Seq (Cuffdiff) les données sont présentées pour les transcriptions liées à la dopamine, GABAergiques, récepteur nicotinique et la sérotonine. FPKM: Fragments par kilobase de la transcription par million mappé lit (FPKM).

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    Discussion

    Ici, nous isolons des cellules individuelles à partir d'une population hétérogène utilisant un marqueur fluorescent, puis étudier chaque cellule avec une seule cellule ARN-seq. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP que nous récoltés et séquencés étaient neurones dopaminergiques en effet, en fonction de la présence des trois transcrits du gène DA liées suivantes, TH, DDC et SLC6A3. Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l'ARN-Seq. Cela a été concordant avec les études électrophysiologiques montrant que chaque cellule TH-eGFP affiche également un répertoire de canaux ioniques associés aux neurones dopaminergiques 8, 9. Dans ce protocole , nous avons utilisé l'GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP souche de souris 10 comme un marqueur fiable pour les neurones dopaminergiques vivants. Dans les cultures WT il n'y a actuellement aucun moyen fiable pour identifier les neurones dopaminergiques en direct en fonction de leur morphologie. En dépit de notre vaste expérience dans identifiant et l'enregistrement des neurones dopaminergiques, dans les cultures de type sauvage seulement trois sur dix des cellules dopaminergiques soupçonnés récoltées étaient des neurones dopaminergiques. De plus, nous avons observé que toutes les cellules qui étaient négatifs pour le TH étaient GABAergique. Nous avons défini des cellules en tant que GABAergique en fonction de la présence du transcrit GAD1 et l'absence de transcrits de DA liés telle qu'évaluée par l'ARN-seq.

    Parce que les neurones dopaminergiques représentent une petite minorité des neurones exprimés dans les cultures primaires VM, la capacité à identifier de manière fiable ces neurones dans les cultures vivantes permettra d'améliorer la gamme des études disponibles sur une seule cellule. Ce protocole peut être utilisé pour la neuroprotection, la neurodégénérescence, et les dosages pharmacologiques pour étudier les effets de divers traitements sur le transcriptome dopaminergique. En outre, on peut utiliser ce protocole pour immunohistochimique, électrophysiologique, biophotonique 11, et en principe, les essais protéomiques. ledosages soi sont particulièrement utiles pour la recherche sur la maladie et la dépendance de Parkinson. Mais bien sûr, des protocoles analogues, sur des souris GENSAT ou des souris marquées de manière similaire, pourraient être utilisés pour d'autres états pathologiques ou des cellules qui sont rares. En outre, ce protocole donne une vue émergente de l'hétérogénéité au sein d'un sous-type neuronal donné.

    Dans des études antérieures, après la récolte de la cellule unique, nous avons placé directement dans PBS; Mais maintenant, nous plaçons la cellule unique récolté directement dans le tampon de réaction. Cela se traduit par de meilleures bibliothèques d'ARN-Seq qualité évaluée par le nombre de gènes détectés dans chaque bibliothèque. L'une des principales limites de la technique est que les cellules marquées par fluorescence sont nécessaires. Comme indiqué plus haut, il n'y a aucun moyen vraiment fiable pour identifier un type de cellule spécifique dans une culture mixte basée sur la morphologie. La large gamme de fluorescence spécifique des cellules ou Cre exprimant des lignées de souris fournit maintenant des cellules marquées de manière appropriée dans de nombreux cas. Cependant, les soins shoULD être prises lors de la sélection d' une lignée de souris fluorescent approprié, comme une étude approfondie des lignées de souris transgéniques a révélé que TH-Cre knock-in des lignées de souris présentent prononcé l' expression du transgène dans les cellules nondopaminergic 12.

    En outre, une autre étape qui peut avoir besoin d'être optimisé dans des expériences futures est la taille de la pointe souhaitée de la micropipette. Si les futures expériences comprennent l'utilisation de types de cellules autres que des neurones dopaminergiques, la taille de la pointe de la micropipette peut avoir besoin d'être optimisé pour la cellule d'intérêt.

    ARN profonde séquençage est une technique plus puissante que microarrays. ARN-Seq donne une bonne reproductibilité run-to-run. La gamme dynamique détectée est comparable à l'abondance de la transcription réelle au sein des cellules. On peut détecter les formes d'épissage alternatif et nouvelles isoformes. De l' analyse de novo des échantillons sans un gène de référence est possible; et si un nouveau gène de référence est découvert les données peuvent être ré-analysés pour lagène (s) spécifique sans avoir à courir à nouveau 13 l'expérience humide de travail.

    Pour résumer, nous déclarons que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été récoltés et séquencés étaient les neurones dopaminergiques. Cette technique étend d' autres rapports qui identifient très dissociés ou les neurones dopaminergiques en culture à long terme à partir de souris GENSAT, 14, 15 et la technique aura des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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    References

    1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
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    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
    5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
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    8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
    9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
    10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
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