Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Brænd infektioner fortsat være en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed. Den stigende fremkomst af multiresistente (MDR) bakterier har ført til hyppige svigt af traditionelle antibiotiske behandlinger. Alternative lægemidler er et presserende behov for at tackle MDR bakterier.
En innovativ ikke-antibiotiske tilgang har antimikrobielle blåt lys (ABL), vist lovende effektivitet mod MDR-infektioner. Virkningsmekanismen af abl endnu ikke er godt forstået. Det er almindeligt antaget, at naturligt forekommende endogene fotosensibiliserende kromoforer i bakterier (fx jern-fri porphyriner, flaviner, etc.) exciteres af Abl, som herefter frembringer cytotoksiske reaktive oxygenarter (ROS) gennem en fotokemisk proces.
Modsætning til en anden lys-baserede antimikrobielle fremgangsmåde, antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT), abl terapi ikke kræver inddragelse af et exogent photosensitizis. Alt det skal træde i kraft, er bestråling af blåt lys; derfor, den er enkel og billig. ABL-receptorerne er de endogene cellulære fotosensibilisatorer i bakterier, snarere end DNA. Således bliver abl menes at være langt mindre genotoksisk værtsceller end ultraviolet-C (UVC) bestråling, som direkte forårsager DNA-skader i værtsceller.
I dette papir, præsenterer vi en protokol til at vurdere effektiviteten af abl terapi for MDR Acinetobacter baumannii infektioner i en musemodel af forbrændinger. Ved at bruge en manipuleret bioluminiscerende belastning, var vi i stand til ikke-invasiv overvågning af omfanget af infektion i realtid i levende dyr. Denne teknik er også et effektivt værktøj til overvågning af rumlige fordeling af infektioner hos dyr.
Burn infektioner, som ofte rapporteres på grund af kutane termiske skader, fortsat være en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed 1. Forvaltningen af brænde infektioner er blevet yderligere kompromitteret af den stigende fremkomst af multiresistente (MDR) bakteriestammer 2 grund af den massive anvendelse af antibiotika. Et vigtigt MDR Gram-negative bakterier er Acinetobacter baumannii, som er kendt for at være forbundet med seneste kamp sår og er modstandsdygtig over for næsten alle tilgængelige antibiotika 3. Tilstedeværelsen af biofilm på den skadede foci er blevet rapporteret 4, 5 og menes at forværre tolerance over for antibiotika og værtsforsvar 6, 7, der forårsager vedvarende infektioner 8, 9. Derfor er der et pressing behov for at udvikle alternative behandlinger. I det nyligt annoncerede nationale strategi til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier, er udvikling af alternative lægemidler til antibiotika blevet observeret som en handling fra regeringen i USA 10.
Lys-baserede antimikrobielle fremgangsmåder, som navnet antyder, kræver lys bestråling med eller uden andre midler. Disse fremgangsmåder omfatter antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT), ultraviolet-C (UVC) bestråling, og antimikrobiel blåt lys (ABL). I tidligere undersøgelser har de vist lovende effektivitet i at slå MDR bakteriestammer 11, 12, 13. Blandt de tre lys-baserede tilgange, har ABL tiltrukket stigende opmærksomhed i de senere år på grund af dets iboende antibakterielle egenskaber uden brug af fotosensibiliserende 14. I Comparmenligning til APDT, ABL involverer kun brugen af lys, mens APDT kræver en kombination af lys og en fotosensibilisator. Derfor abl er enkel og billig 14. I sammenligning med UVC er abl menes at være langt mindre cytotoksisk og genotoksisk værtsceller 15.
Målet med denne protokol er at undersøge effektiviteten af ABL til behandling af brænde infektioner forårsaget af MDR A. baumannii i en musemodel. Vi bruger bioluminiscerende sygdomsfremkaldende bakterier til at udvikle nye musemodeller af brænde infektioner, der tillader ikke-invasiv overvågning af den bakterielle belastning i realtid. Sammenlignet med den traditionelle metode med kropsvæske / væv prøveudtagning og efterfølgende udpladning og kolonitælling 16, tilvejebringer denne teknik nøjagtige resultater. Processen med vævsprøvetagning kunne indføre en anden kilde af eksperimentel fejl. Da det bakterielle luminescensintensitet er lineært proportional med de korresvandansamlinger bakteriel CFU 17, kan vi direkte måle overlevelsen af bakterier efter en vis dosis af lysbestråling. Ved at overvåge den bakterielle belastning i levende dyr, der modtog lysbehandlingen i realtid, kan kinetikken af bakteriedrab karakteriseres ved anvendelse af et væsentligt reduceret antal mus.
abl er en hidtil ukendt fremgangsmåde til behandling af infektioner. Siden dets virkningsmekanisme er helt forskellig fra den af kemoterapi, er det mere af en fysioterapi. Midlet, der medierer den antimikrobielle virkning er blåt lys bestråling (400-470 nm). Med udviklingen af blå lysdioder, tjente vi adgang til en effektiv og enkel lys-baserede antimikrobielle tilgang til MDR-infektioner.
I denne protokol, har vi beskrevet udviklingen af en musemodel af brænde infektioner f…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |