JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

In vivo Undersøgelse af antimikrobielle Blue Light terapi for multiresistent Acinetobacter baumannii Burn Infektioner Brug Bioluminescens Imaging

Published: April 28, 2017
doi:
10.3791/54997
, , , , ,
1Wellman Center for Photomedicine,Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology,Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service,Brooke Army Medical Center

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Brænd infektioner fortsat være en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed. Den stigende fremkomst af multiresistente (MDR) bakterier har ført til hyppige svigt af traditionelle antibiotiske behandlinger. Alternative lægemidler er et presserende behov for at tackle MDR bakterier.

En innovativ ikke-antibiotiske tilgang har antimikrobielle blåt lys (ABL), vist lovende effektivitet mod MDR-infektioner. Virkningsmekanismen af ​​abl endnu ikke er godt forstået. Det er almindeligt antaget, at naturligt forekommende endogene fotosensibiliserende kromoforer i bakterier (fx jern-fri porphyriner, flaviner, etc.) exciteres af Abl, som herefter frembringer cytotoksiske reaktive oxygenarter (ROS) gennem en fotokemisk proces.

Modsætning til en anden lys-baserede antimikrobielle fremgangsmåde, antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT), abl terapi ikke kræver inddragelse af et exogent photosensitizis. Alt det skal træde i kraft, er bestråling af blåt lys; derfor, den er enkel og billig. ABL-receptorerne er de endogene cellulære fotosensibilisatorer i bakterier, snarere end DNA. Således bliver abl menes at være langt mindre genotoksisk værtsceller end ultraviolet-C (UVC) bestråling, som direkte forårsager DNA-skader i værtsceller.

I dette papir, præsenterer vi en protokol til at vurdere effektiviteten af abl terapi for MDR Acinetobacter baumannii infektioner i en musemodel af forbrændinger. Ved at bruge en manipuleret bioluminiscerende belastning, var vi i stand til ikke-invasiv overvågning af omfanget af infektion i realtid i levende dyr. Denne teknik er også et effektivt værktøj til overvågning af rumlige fordeling af infektioner hos dyr.

Introduction

Burn infektioner, som ofte rapporteres på grund af kutane termiske skader, fortsat være en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed 1. Forvaltningen af brænde infektioner er blevet yderligere kompromitteret af den stigende fremkomst af multiresistente (MDR) bakteriestammer 2 grund af den massive anvendelse af antibiotika. Et vigtigt MDR Gram-negative bakterier er Acinetobacter baumannii, som er kendt for at være forbundet med seneste kamp sår og er modstandsdygtig over for næsten alle tilgængelige antibiotika 3. Tilstedeværelsen af biofilm på den skadede foci er blevet rapporteret 4, 5 og menes at forværre tolerance over for antibiotika og værtsforsvar 6, 7, der forårsager vedvarende infektioner 8, 9. Derfor er der et pressing behov for at udvikle alternative behandlinger. I det nyligt annoncerede nationale strategi til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier, er udvikling af alternative lægemidler til antibiotika blevet observeret som en handling fra regeringen i USA 10.

Lys-baserede antimikrobielle fremgangsmåder, som navnet antyder, kræver lys bestråling med eller uden andre midler. Disse fremgangsmåder omfatter antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT), ultraviolet-C (UVC) bestråling, og antimikrobiel blåt lys (ABL). I tidligere undersøgelser har de vist lovende effektivitet i at slå MDR bakteriestammer 11, 12, 13. Blandt de tre lys-baserede tilgange, har ABL tiltrukket stigende opmærksomhed i de senere år på grund af dets iboende antibakterielle egenskaber uden brug af fotosensibiliserende 14. I Comparmenligning til APDT, ABL involverer kun brugen af ​​lys, mens APDT kræver en kombination af lys og en fotosensibilisator. Derfor abl er enkel og billig 14. I sammenligning med UVC er abl menes at være langt mindre cytotoksisk og genotoksisk værtsceller 15.

Målet med denne protokol er at undersøge effektiviteten af ABL til behandling af brænde infektioner forårsaget af MDR A. baumannii i en musemodel. Vi bruger bioluminiscerende sygdomsfremkaldende bakterier til at udvikle nye musemodeller af brænde infektioner, der tillader ikke-invasiv overvågning af den bakterielle belastning i realtid. Sammenlignet med den traditionelle metode med kropsvæske / væv prøveudtagning og efterfølgende udpladning og kolonitælling 16, tilvejebringer denne teknik nøjagtige resultater. Processen med vævsprøvetagning kunne indføre en anden kilde af eksperimentel fejl. Da det bakterielle luminescensintensitet er lineært proportional med de korresvandansamlinger bakteriel CFU 17, kan vi direkte måle overlevelsen af bakterier efter en vis dosis af lysbestråling. Ved at overvåge den bakterielle belastning i levende dyr, der modtog lysbehandlingen i realtid, kan kinetikken af ​​bakteriedrab karakteriseres ved anvendelse af et væsentligt reduceret antal mus.

Protocol

1. Fremstilling af bakteriekultur Tilføje 7,5 ml Brain Heart Infusion (BHI) -medium til et 50 ml centrifugerør. Seed A. baumannii celler i BHI-medium og derefter inkubere A. baumannii kulturen i en orbital inkubator (37 ° C) i 18 timer. Centrifugeres kulturen af ​​celler ved 3.500 x g i 5 minutter, supernatanten fjernes, og vask pellets i phosphatbufret saltvand (PBS). Re-suspendere bakterier pellets i frisk PBS og grundigt pipetteres suspensionen. Indsam…

Representative Results

A. baumannii stamme, som vi brugte er en klinisk MDR isolat, som tidligere 12, 17 rapporteret. Den bakterielle stamme blev fremstillet bioluminescerende ved transfektion af luxCDABE opera 11. Figur 1A viser de successive bakterielle luminescens billeder fra en repræsentativ mus brænde inficeret med 5 x 10 6 A. baumannii og udsat for en enkelt Abl eks…

Discussion

abl er en hidtil ukendt fremgangsmåde til behandling af infektioner. Siden dets virkningsmekanisme er helt forskellig fra den af ​​kemoterapi, er det mere af en fysioterapi. Midlet, der medierer den antimikrobielle virkning er blåt lys bestråling (400-470 nm). Med udviklingen af ​​blå lysdioder, tjente vi adgang til en effektiv og enkel lys-baserede antimikrobielle tilgang til MDR-infektioner.

I denne protokol, har vi beskrevet udviklingen af en musemodel af brænde infektioner f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.

Materials

IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections – a matter of opportunity – monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. . National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria Available from: https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014)
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination?. J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond?. Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

Antimicrobial Blue Light TherapyMultidrug-resistant Acinetobacter BaumanniiBurn InfectionsBioluminescence ImagingNon-antibiotic ApproachLocalized Bacterial InfectionsThermal InjuryBacterial SuspensionCFUPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image