In vivo undersøkelse av antimikrobiell blå lysterapi for multidrug-resistent Acinetobacter baumannii Brenninfeksjoner ved bruk av bioluminescens-bildebehandling

Summary

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Abstract

Brenn infeksjoner fortsette å være en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Den økende veksten av multilegemiddelresistente (MDR) bakterier har ført til hyppige feil av tradisjonelle antibiotika behandlinger. Alternative behandlingsformer er sterkt behov for å takle MDR bakterier.

En innovativ ikke-antibiotiske tilnærmingen, har antimikrobiell blått lys (Abl), vist lovende effektivitet mot MDR-infeksjoner. Virkningsmekanismen av ABL er ennå ikke fullt ut forstått. Det er alminnelig antatt at naturlig forekommende endogene fotosensibiliserende kromoforer i bakterier (f.eks, jernfrie porfyriner, flavins, etc.) blir eksitert ved hjelp av Abl, som i sin tur frembringer cytotoksiske reaktive oksygenarter (ROS) gjennom en fotokjemisk prosess.

I motsetning til en annen lys-baserte antimikrobiell tilnærming, antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT), abl behandling ikke krever medvirkning av en eksogen photosensitizer. Alt den trenger for å tre i kraft er bestråling av blått lys; Derfor er det enkelt og billig. Abl-reseptorene er de endogene lyssensitiverende cellulære i bakterier, i stedet for DNA. Således er abl antas å være mye mindre genotoksiske vertsceller enn ultrafiolett-C (UVC) bestråling, som direkte fører til DNA-skade i vertsceller.

I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å vurdere effektiviteten av abl-terapi for MDR Acinetobacter baumannii infeksjoner i en musemodell for brannskader. Ved å bruke en konstruert bioluminescent belastning, kunne vi invasivt overvåke omfanget av smitte i sanntid i levende dyr. Denne teknikken er også et effektivt verktøy for å overvåke den romlige fordeling av infeksjoner hos dyr.

Introduction

Burn infeksjoner, som ofte rapportert på grunn av kutane termiske skader, fortsette å være en viktig årsak til sykelighet og dødelighet ^1. Styringen av forbrennings infeksjoner er blitt ytterligere svekket av den økende veksten av multilegemiddelresistente (MDR) Bakteriestammene ² på grunn av den massive bruk av antibiotika. Et viktig MDR Gram-negative bakterier er Acinetobacter baumannii, som er kjent for å være assosiert med siste sår kjempe og er resistente overfor nesten alle tilgjengelige antibiotika ^3. Tilstedeværelsen av biofilm på den skadede brennpunktene har blitt rapportert ^{4, 5} og antas å forverre toleranse overfor antibiotika og vertsforsvar ^{6, 7,} forårsaker vedvarende infeksjoner ^{8, 9.} Derfor er det en pressing behov for utvikling av alternative behandlinger. I den nylig annonserte Nasjonal strategi for bekjempelse av antibiotikaresistente bakterier, har utviklingen av alternative behandlingsformer mot antibiotika blitt bemerket som en handling av regjeringen i USA ^10.

Lys-baserte antimikrobielle tilnærminger, som navnet indikerer, krever lys bestråling med eller uten andre midler. Disse metodene inkluderer antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT), ultrafiolett-C (UVC) bestråling, og antimikrobiell blått lys (ABL). I tidligere studier har de vist lovende effektivitet i å drepe MDR-bakteriestammer ^{11, 12, 13.} Blant de tre lys-baserte tilnærminger, har ABL økt oppmerksomhet de siste årene på grunn av sine iboende antibakterielle egenskaper uten bruk av fotosensitisere ^14. i komparativeison til aPDT, ABL bare omfatter bruk av lys, mens aPDT krever en kombinasjon av lys og et fotosensibiliserende middel. Derfor er ABL enkel og rimelig ^14. I forhold til UVC er abl antas å være mye mindre cytotoksiske og genotoksiske vertsceller ^15.

Målet med denne protokollen er å undersøke effektiviteten av abl for behandling av brann infeksjoner forårsaket av MDR A. baumannii i en musemodell. Vi bruker bioluminescerende patogene bakterier for å utvikle nye musemodeller av brann infeksjoner som gjør at ikke-invasiv overvåkning av bakteriebelastning i sanntid. Sammenlignet med den tradisjonelle metoden for kroppsfluid / vevsprøver og påfølgende platekledning og kolonitelling ^16, gir denne teknikken nøyaktige resultater. Prosessen med prøvetagnings kunne innføre en annen kilde til eksperimentelle feil. Siden den bakterielle luminescens intensitet er lineært proporsjonal med tilsvrende bakterie CFU ^17, kan vi direkte måle overlevelse av bakterier etter en viss dose av lysbestråling. Ved å overvåke bakteriemengden i levende dyr som mottar lyset behandling i sann tid, kan kinetikken av bakteriedrep karakteriseres ved anvendelse av et betydelig redusert antall mus.

Protocol

1. Fremstilling av bakteriekultur Legg 7,5 ml hjerne-hjerte-infusjon (BHI) medium til et 50 ml sentrifugerør. Seed A. baumannii cellene i BHI-medium og deretter inkubere A. baumannii kulturen i en inkubator (37 ° C) i 18 timer. Sentrifuger kulturen av celler ved 3500 x g i 5 minutter, fjern supernatanten, og vask pelletene i fosfat-bufret saltvann (PBS). Re-suspendere bakteriene pelletene i frisk PBS og grundig pipettere suspensjonen. Samle 100 pl av bakteries…

Representative Results

A. baumannii belastningen som vi brukte er en MDR klinisk isolat, som rapportert tidligere 12, 17. Bakteriestammen ble gjort selvlysende ved transfeksjon av luxCDABE opera 11. Figur 1A viser de suksessive bakteriell luminescens bilder fra en representativ mus brenne infisert med 5 x 10 6 A. baumannii og eksponert til en enkel ABL eksponering ved 24 tim…

Discussion

Abl er en ny fremgangsmåte for behandling av infeksjoner. Siden dens virkningsmekanisme er helt forskjellig fra den til kjemoterapi, er det mer av et fysikalsk. Det middel som medierer den antimikrobielle virkning er blått lys bestråling (400-470 nm). Med utviklingen av blå lysdioder, fikk vi tilgang til en effektiv og enkel lys-baserte antimikrobielle tilnærming for MDR infeksjoner.

I denne protokoll har vi beskrevet utviklingen av en musemodell for brann infeksjoner forårsaket av et …

Materials

IVIS	PerkinElmer Inc, Waltham, MA	IVIS Lumina Series III	Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED	VieLight Inc, Toronto, Canada	415 nm	Light source for illumination
Power/energy meter	Thorlabs, Inc., Newton, NJ	PM100D	Light irradiance detector
Mouse	Charles River Laboratories, Wilmington, MA	BALB/c	7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii	Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX	Clinical isolate	Engineered luminescent strain
Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-826-79	BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride	Fisher Scientific	721016	0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1X Solution	Fisher Scientific	BP24384	A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion	Fisher Scientific	B11059	Bacterial culture medium
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C	For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers	Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH	Incu-Shaker Mini	For culturing of bacteria
Inoculating Loops	Fisher Scientific	22-363-605	For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL	Fisher Scientific	02-707-502	Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-220	For bacterial suspension seperation
Brass Block	Small Parts, Inc., Miami, FL	10 mm by 10 mm	For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves	Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY	PBI83514	Heat Resistant Gloves
Greiner dishes	Sigma-Aldrich Co. LLC	P5112-740EA	35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate	Cole-Parmer Instrument Company, LLC	UX-84301-65	10" x 10", 220 VAC, for boiling water
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed	E-Z Systems	EZ-211	Prevents heat loss and hypothermia during surgery