Introduction
유방암 사망률의 주요 원인은 전이 (1, 2)을 통해서이다. 첫번째 줄은 전이성 유방암 2, 3, 4, 5, 6의 치료식이 요법 등 도세탁셀과 같은 탁산 파클리탁셀은 현재 사용되고있다. 그들은 미세 소관 역학을 방해 미세 소관 타겟팅 에이전트 (MTA)의 그룹의 일부입니다. 그러나, 치료 요법 탁산을 사용하는 가장 큰 과제 중 하나는 재발 7 리드 암세포 탁산 저항의 개발이다. 약물 내성은 전이성 유방암 환자 중 7 모든 사망의 90 % 이상을 차지한다.
미세 소관은 α-와 β-tubulin에 이종의 중합에 의해 형성된다클래스 = "외부 참조"> 8, 9. 미소 관 역학의 정확한 조절은 세포 편광 세포주기 진행, 세포 이동, 및 세포 신호 전달을 포함한 많은 세포 기능에 중요하다. 미세 소관과 역학의 조절 곤란은 세포의 기능을 방해하고 세포 사멸 (10), (11)가 발생합니다. 그들은이 조절 곤란의 원인이 방법에 따라 MTA 약은 미세 소관 안정 화제 (즉, 탁산) 또는 미세 소관 - destabalizing 에이전트 (즉, 빈카 알칼로이드 또는 콜히친 현장 결합제) (20)로 분류 할 수있다. 미세 소관 질량에 대한 자신의 반대 효과에도 불구하고, 충분한 용량으로, 두 클래스는 미세 소관 역학 (21)에 미치는 영향을 통해 암 세포를 죽일 수 있습니다.
탁산은 선도, 미세 소관 스핀들 (12)을 안정화 주로 기능염색체 어긋남. 스핀들 어셈블리 검사 (SAC)의 후속 활성화는 영구 분열 셀을 체포. 장기간 유사 분열 체포는 세포 사멸 (13), (14)가 발생합니다. 탁 조립 튜 불린 (16) 만 존재하는 β-tubulin의 8, 15,에 탁산 바인딩 사이트를 통해 미세 소관과 상호 작용합니다.
탁산 저항 복합 메커니즘은, 17 (9)이 제안되어있다. 이러한 메커니즘으로 인해 약물 유출 단백질과 탁산 별 저항 5, 9, 18, 19의 과발현에 모두 일반적으로 다제 내성을 포함한다. 예를 들어 탁산 내성 암세포는 특정 β-욕조의 발현과 기능을 변경할 수도ulin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 이소 타입. 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 생체 내 방법을 사용함으로써, 우리는 무저항 부모 MCF-7 CC 셀 (17)에 비해, 도세탁셀 내성 MCF-7 TXT 세포의 미소 관 역학 도세탁셀 처리 둔감 보여준다.
MTA를 더의 기능과 암세포의 탁산 저항의 정확한 메커니즘을 이해하기 위해, 미세 소관의 동역학을 측정하는 것이 필수적이다. 여기, 우리는 그렇게하는 생체 내 방법을보고합니다. 세포에서 GFP 태깅 튜 불린의 발현과 결합 라이브 영상을 사용함으로써, 우리는 MCF-7 TXT 및 MCF-7 세포 CC 및 Wi 미세 소관의 동역학을 측정사전 통 보없이 도세탁셀 치료. 결과는 우리가 탁산 저항을 극복 할 수있는보다 효과적인 약물을 설계 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 라이브 영상에 대한 세포를 준비
- 세포 배양 및 시드
- 도세탁셀 (MCF-7 TXT) 및 무저항 부모 세포주 (MCF-7 CC)에 대한 내성을 위해 선택된 MCF-7 유방암 세포를 사용한다. 상세한 선택 프로세스 이들 선택된 세포주의 특성 (24)는 이전에 설명되었다.
- 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 및 소 태아 혈청 (FBS)의 10 %의 90 %로 이루어지는 비 필수 아미노산이 보충 된 배지에서 37 ° C에서 10cm 배양 접시에있는 모든 세포를 성장한다. 5 % CO 2 분위기에서 매체를 유지한다. 5 나노 도세탁셀에서 MCF-7 TXT 세포를 유지한다.
- 라이브 이미징 된 커버에 씨앗 세포. 하룻밤 동안 UV에 노출 후 70 % 알콜로 세척 의해 24mm 폴리 -L- 리신 - 코팅 된 커버 글라스를 소독. 35mm의 6 웰 배양 판에 커버 슬립을 놓습니다. 경기 수각 웰에 하나 coverslip에 에이스.
- 10 cm 배양 접시에서 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 씻어. 접시에서 세포를 분리 접시에 트립신 EDTA 0.5 ML을 추가합니다. 세포의 분리 이후 트립신 중화 접시에 배양 배지 5 ㎖를 추가한다.
- 단위 부피 당 세포의 수를 결정하는 혈구 세포를 카운트.
- 각 웰 단위 부피 당 세포 수를 기준으로 약 10 5 세포를 추가한다. 부드럽게 흔들어 후, 세포가 된 커버에 부착 할 수 있도록 인큐베이터에 다시 접시를 넣어.
- GFP - 태그 α-tubulin의 발현
- , 미소 관 역학 분석을 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 GFP 전달 제어 (예 BacMam)와 GFP-α-tubulin의 태그와 함께 세포를 형질 도입하는 방법.
- 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에서 36 시간 동안 웰에 세포를 배양 할 수 있도록 COM현명한 방법 부착 및 60 %의 합류.
- 다음 식에있어서, 각 웰에 추가 GFP 표지 된 α-tubulin에 적절한 부피를 계산한다 :
세포의 수는 표시시의 웰에있는 세포의 추정 된 총계이다 원하는 PPC는 세포 당 입자의 수이다.
참고 : MCF-7 세포를 시드 (20)의 원하는 PPC 10 5 5 10 × 2의 세포 수를 두 배로해야, 각 coverslip에 필요한 볼륨 따라서 40 μL이다. 다른 셀 볼륨은 최고하지 않을 상기 공식에 따라 계산 하였다. 정확한 부피 GFP-tubulin의 실제 발현 수준에 따라 조절되어야한다. - 균질 용액이되도록 반전하여 GFP 표지 된 α-tubulin에 수회 섞는다. 소용돌이하지 마십시오.
참고 : 컨트롤의 경우, 널 (제어) 시약은 포유 동물의 유전 부족요소 및 잠재적 배큘로 바이러스 - 매개 효과 및 배경 형광을 결정하는데 도움이되도록 사용될 수있다. 비 대상 GFP 전달 제어는 전체 셀을 점등하는 사용될 수있다. - 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. 각 웰에 GFP - 태그 α-tubulin에의 새로운 매체의 2 mL의 40 μL를 추가합니다.
- 문화 매체와 GFP - 태그 α-tubulin에 완벽하게 혼합 할 수 있도록 부드럽게 판을 흔들어. 문화 인큐베이터에 접시를 반환하고 GFP - 튜 불린의 표현을 할 수 있도록 24 시간 동안 배양.
- 도세탁셀과 치료 세포
주 :이 실험은 미세 소관 동적 불안정성 도세탁셀의 효과를 테스트하는 것이다. 따라서, 셀은 도세탁셀의 원하는 농도로 처리된다.- 배지는 DMEM 중 90 % 및 10 % FBS가 이루어지는 비 필수 아미노산이 보충 준비한다. 페놀 레드가 fluorescen을 방해 할 수 있기 때문에 페놀 레드없이 DMEM을 사용하여GFP - 튜 불린의 가전. (10 nM 내지 10 μM까지) 도세탁셀의 원하는 농도를 추가합니다. 도세탁셀의 스톡 용액을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mm이다.
- 사전 따뜻한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 도세탁셀 함유 매체.
- 도세탁셀 함유 매체와 일반 배지를 교체하고 조직 문화 인큐베이터에서 30 분 동안 품어. 각 도세탁셀의 농도에 잘 당 적어도 3 커버 슬립이 있어야한다.
2. 라이브 영상은 미세 소관 동적 불안정성을 검사합니다
- 시스템 설정
- 37 ° C, 5 % CO 2로 유지 챔버에서 실험을 수행합니다. 60X, 반전 된 형광 현미경과 CCD 카메라로 1.42 NA 오일 대물 렌즈를 구비 한 현미경 시스템 시간 경과하여 형광 이미지를 획득.
- 라이브 영상에 대한 세포를 설정합니다. 사전 따뜻한 샘플 홀더 모두와37 ° C까지 매체. 검사하기 위해 커버 슬립을 선택합니다. 샘플 홀더에 주목 커버 슬립을 장착하고, 단계 1.3.1에서 제조 한 도세탁셀 함유 배지 1 ㎖와 함께 배양한다.
- 미세 소관 동적 불안정성의 라이브 영상
- 이미징을 위해 사용되는 세포를 확인한다. 그들은 평탄한 표현 GFP-tubulin에 높은 형광 강도를 가지고 있고, 명확한 미세 소관 구조를 가져야한다.
- 첫 번째 검사 단계 2.2.1에서 확인 된 세포의 그룹에서 하나의 셀을 선택합니다. 식별 된 셀의 주변 영역에 초점을 맞 춥니 다. 노출 시간에 대한 프로그램 및 이미지 수집의 주파수를 설정합니다. 노광 시간은 약 0.5 초이므로, 영상이 매 2 S를 취득한다.
- 1.33에서 2.2.3 단계에 대한 추가 20 분을 허용합니다. 단계 1.3.3에서 설명 된 바와 같이 즉, 정확히 50 분 도세탁셀의 첨가 후에, (이 표준화이다) 촬상을 시작한다.
- 미세 소관 d 개를 기록ynamics 2 분 동안 사진마다 2 S 복용. 전체적으로 상기 식별 된 셀 (60)의 이미지를 획득.
- 다음 식별 셀로 이동 및 반복 2.2.4에 2.2.2 단계를 반복합니다. 5 세포가 몇 군데 될 때까지 절차를 반복합니다. 단계 1.3.3에서 설명 된 바와 같이 시간, 도세탁셀의 첨가 후 70 분에 도달하기 전에이를 수행하는 것이 필수적이다.
- 각 처리 조건의 경우, 반복 3 가지 커버 슬립을 위해 2.2.5에 2.2.1 단계를 반복합니다. 총 이미지 15 세포, 충분한 데이터가 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 것입니다있다.
3. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석
- 이미지의 디컨 볼 루션
- 높은 품질을 달성하기 위해 상기 취득 된 영상을 Deconvolve. 현미경 시스템을 갖추고 디컨 볼 루션 프로그램을 엽니 다.
- "프로세스"를 클릭하고 "Deconvolve을." "입력"창에 이미지 파일을 드래그하고 클릭 "해야할 일" 이미지 파일은 deconvolved하고 것deconvolved 파일이 자동으로 새 파일로 저장됩니다.
- 동영상의 생성
- 갖춘 소프트웨어를 엽니 다 deconvolved 이미지 파일을 클릭합니다.
- "파일"을 클릭하고 "동영상으로 저장합니다." 같은 "AV"과 "애니메이션 스타일"로 "영화 형식"선택 "앞으로." 에 "100 %"와 "프레임 속도"로 "압축 품질"설정 "5 / 초를."
- "시간을 통해 애니메이션"을 클릭의 상자 확인 "을 수행합니다." 동영상이 생성됩니다.
- 미세 소관 단축 및 성장률 측정
- 측정에 사용되는 미세 소관을 확인합니다. 각 셀에 대해, 몇 미세 소관은 단축 또는 성장 명확하고 완전하게 따랐다 수있을 것이다.
- 미세 소관 (A)의 출발 길이를 표시 프레임을 식별하는 비디오의 각 프레임을 검사차 가장 연장 또는 단축 미세 소관와 프레임. 두 개의 미세 소관과 두 프레임 사이에 경과 된 시간의 길이의 변화를 측정한다.
- 시간 길이의 변화를 분할함으로써 증가 또는 단축의 비율을 계산한다 (단위는 ㎛의 / s이다). 각 처리 조건에 대해, 적어도 10 세포를 따라 적어도 20 마이크로 튜브를 측정한다.
- 각 처리 조건에 대한 평균 및 표준 오차를 계산한다. 학생 테스트를 사용하여 조건 사이에 통계적으로 유의 한 차이를 분석 할 수 있습니다. 테이블 및 / 또는 차트의 데이터를보고합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 프로토콜을 사용하여, 우리는 (MCF-7 TXT) 유방암 세포 (MCF-7 CC) 정상 및 도세탁셀 내성의 미소 관 역학 도세탁셀의 효과를 연구 하였다. 이미지의 두 세트 MCF-7 및 MCF-CC 7 TXT 세포 (도 1A)에서 미세 소관의 성장과 단축의 도세탁셀 (0.5 μM)의 효과를 나타낸다.
우리는 또한 두 세포주 이러한 조건에서 미세 소관의 성장 또는 단축의 비율을 계산하여 0.5 μM에서 도세탁셀 강하게 MCF-7 CC 셀 튜 불린 역학 아니지만 MCF-7 TXT 세포 (도 1b)를 억제하는 것으로 나타났다.
그림 1 : 미세 소관 동적에 도세탁셀의 효과MCF-7 TXT 및 MCF-7 CC 세포의의. 한 바와 같은 라이브 영상을 시행 하였다. (A) MCF-7 CC 1 시간 동안 0.5 μM 도세탁셀로 치료 다음 MCF-7 TXT 세포에서 미세 소관 역학의 라이브 영상에서 선택한 이미지. 화살표는 연장 미세 소관을 나타냅니다. 화살촉은 단축 미세 소관을 나타냅니다. 크기 바 = 5 μm의. (B) 신장율 및 미세 소관의 단축 비율은 녹화 된 영상으로부터 측정 하였다. 각 데이텀은 적어도 8 개의 다른 셀로부터 20 측정의 평균이다. 에러 바는 표준 오류입니다. ** 차이가 P <0.01로 통계적으로 유의 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 외 및 생체 내에서 : 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외 방법에서는, 정제는 튜 불린 컴퓨터 향상된 경과 미분 간섭 현미경과 달리 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 데 사용된다. 생체 내 방법에있어서, 형광 튜 불린를 미세 주입 또는 GFP - 튜 불린을 표현, 미세 소관에 포함된다. 미세 소관의 동역학 (성장과 단축)가 다음 상간 셀 (10), (20), (25)의 주변 영역에 민감한 카메라를 이용하여 시간 경과에 의해 기록된다. 현미경의 다양한 형태가 이러한 목적으로 사용되었지만, 우리는 여기에보고 된 프로토콜은 컨벌루션 현미경을 사용한다.
생체 내에서 동적 불안정성 반면, 단지 미세 소관 플러스 종료합니다 (β-tubulin의 바깥쪽으로 향하게 끝) 발생마이너스 단부 (외측으로 향하게 α-tubulin에 함께 단부)는 동일한 길이 (26) 남아있다. 한편, 시험 관내 조립 미세 소관은 동적 불안정성은 플러스 마이너스 단부 (27) 단부보다 더 강하다과 함께 미 세관의 양단에 발생한다. 시험관 내에서의 동적 불안정성을 분석의 주요 장점은 셀룰러지도의 부재에서 미소 관 역학에 다른 제제의 특정 역할에 대한 기계적인 정보를 제공한다는 것이다. 또한, 체외 조건에서, 동적 불안정성은 양쪽 끝에서 공부 할 수 있습니다. 이것은 약물 또는 조절 단백질의 대향 단부에서 미세 소관의 안정성에 영향을하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. 역사적으로, 마이너스 끝 플러스 10을 종료보다 훨씬 적은 추적됩니다. 미세 소관의 행동에 대한 우리의 이해의 대부분은 체외에서 정제 튜 불린 조립 미세 소관에 대한 연구에서 비롯됩니다. 이 연구에서 얻은 미세 소관 동작의 기본 원리의 대부분은 또한 세포에서 미세 소관에인가 될 수 있지만 단, 시험 관내 및 생체 내 사이에 미소 관 역학 일정한 차이가있다. 세포에서 미세 소관은 종종에 5- 성장 빠른 속도를 10 배, 성장 및 / 또는 단축 사이의 전환은 시험 관내에서 정제 튜 불린 조립 미세 소관보다 더 자주 ~ 10 회 발생한다. 셀룰러 미세 소관 거동의 공간 및 시간 조절 고도 반영 세포주기 전반에 걸쳐 극적 미세 소관 조직의 변화와 역학도있다. 이 문제는 시험 관내 연구에서 연구 할 수 없습니다. 또한, 미세 소관 역학의 규제는 튜 불린 번역 후 변형, 튜 불린 이소 식, 안정 또는 마이크로 불안정하거나지도 및 기타 미세 소관 - 상호 작용하는 단백질의 큰 그룹에 의해 달성된다29, 28 세관. 따라서, 살아있는 세포에 미세 소관의 불안정성을 공부하는 것이 훨씬 더 생리 학적으로 적용 할 수있다.
여기에 기재된 방법은 살아있는 세포에서 미세 소관의 동역학을 연구하기 위해 간단하고 믿을만한 프로토콜이다. 더주의를 요구하는 단계는 관찰 용 셀의 선택 및 노출 시간을 결정한다. 평평 셀을 선택하고 GFP-tubulin의 높은 형광 강도를 가지고하는 것이 중요합니다. 이 여진 강도 및 GFP 형광의 변색을 방지하기 위해, 노광 시간을 단축하는 것이 바람직하다. 물론, 생체 방법의 다른 모든 것처럼,이 프로토콜은 다양한 조작 된 조건에서 미세 소관 동적 불안정성을 연구하기에 적합하지 않다. 예를 들어, α-와 β-tubulin의 다른 아형은 미세 소관 역학의 관점에서 다르게 동작 할 수 있습니다. 오직 체외 방법에서 s로 사용할 수 있습니다tudy 미세 소관 동적 불안정성에 대한 개별 정제 튜 불린 동종의 효과. 또한, 형광 표지 된 튜 불린의 마이크로 인젝션에 비해 형질 전환 또는 형질 도입하여 플라스미드 GFP 태깅 튜 불린의 발현은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음비를 나타낼 수있다. 그러나, 형질 전환 또는 플라스미드의 전달에 의한 세포에서 GFP - 태그 튜 불린의 표현은 더 많은 자유가 실험적으로 다른 세포 특성을 변화 할 수 있습니다.
여기에보고되는 프로토콜은 다양한 연구에 사용될 수있다. 한편으로는, 특히 유사 분열에서 세포주기의 여러 단계에서 미세 소관의 기능에 대한 신규 중요한 식견을 제공 할 수있다. 또한, 미소 관 역학, 마이그레이션 등 각종 세포 프로세스의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 한편, 정상의 미소 관 역학 (그들 중 많은 항암제이다) 다양한 미세 소관 억제제의 효과를 연구하기 위해 사용될 수 있고더 생리적 조건에서 암 세포. 우리는 모두 도세탁셀 저항 및 비 도세탁셀 저항하는 유방암 세포에서 미세 소관 동적 불안정성에 다양한 항 유사 분열 항암제의 효과를 연구하기 위해이 방법을 사용했다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
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