Introduction
Den største årsaken til brystkreft dødelighet er gjennom metastase 1, 2. Taxaner slik som docetaxel og paclitaxel, er for tiden brukes som førstelinjebehandling i behandling av metastatisk brystkreft 2, 3, 4, 5, 6. De er en del av en gruppe mikrotubulidynamikk målretting midler (MTAS) som forstyrrer mikrotubulidynamikk. Imidlertid er en av de største utfordringene for ved hjelp av taksaner i kurativ terapi er utviklingen av taksan resistens i cancerceller, noe som fører til tilbakefall av sykdommen 7. Drug motstand står for mer enn 90% av alle dødsfall blant pasienter med metastatisk brystkreft 7.
Mikrotubuli er dannet ved polymerisering av a- og p-tubulin heterodimererclass = "xref"> 8, 9. Den nøyaktige regulering av mikrotubulidynamikk er viktig for mange cellulære funksjoner, inkludert celle polarisering, cellesyklusprogresjon, intracellulær transport, og cellesignalisering. Dysregulering av mikrotubuler og deres dynamikk vil forstyrre cellefunksjon og føre til celledød 10, 11. Avhengig av hvordan de forårsaker denne feilregulering, kan MTA legemidler klassifiseres som enten mikrotubulidynamikk stabiliserende midler (dvs. taxaner) eller microtubule-destabalizing midler (dvs. vincaalkaloider eller kolkisin stedet bindemidler) 20. Til tross for deres motsatte effekter på microtubule masse, på en tilstrekkelig dose, kan begge klasser drepe kreftceller gjennom sine effekter på mikrotubulidynamikk 21.
Taxaner funksjon først og fremst ved å stabilisere microtubule spindelen 12, som fører tilkromosom forskyvning. Den påfølgende evigvarende aktivering av spindelenheten sjekkpunkt (SAC) arrestasjoner cellen i mitose. Langvarig mitotisk arrest deretter forårsaker apoptose 13, 14. Taxan samvirker med mikrotubuli gjennom taksan bindingssetet på β-tubulin 8, 15, som bare er til stede i montert tubulin 16.
Flere mekanismer for taxan motstand har vært foreslått 9, 17. Disse mekanismene innbefatter både generell multimedikamentresistens på grunn av overekspresjon av stoff-effluks proteiner og taxan-spesifikke motstand 5, 9, 18, 19. For eksempel kan taxan-resistente kreftcellene har forandret ekspresjon og funksjon av visse β-karSienna isotyper 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ved hjelp av en in vivo-metode for å måle mikrotubulus dynamisk ustabilitet viser vi at, sammenlignet med ikke-resistente, foreldre MCF-7-celler CC-17, de mikrotubul-dynamikk av docetaxel-resistent MCF-7-celler TXT er ufølsomme for docetaxel behandling.
For bedre å forstå funksjonen av MTA-er, og den eksakte mekanismen for taxan-resistens i kreftceller, er det viktig å måle mikrotubul-dynamikk. Her rapporterer vi en in vivo metode for å gjøre det. Ved å bruke levende avbildning i kombinasjon med uttrykket av GFP-merket tubulin i cellene, kan vi måle mikrotubulidynamikk av MCF-7 TXT og MCF-7 CC celler med og without docetaxel behandling. Resultatene kan hjelpe oss å designe mer effektive legemidler som kan overvinne taxan motstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klar cellene i live Imaging
- Cellekultur og poding
- Bruk MCF-7 brystkreftceller valgt for resistens mot docetaxel (MCF-7 TXT) og deres ikke-resistente opphavelige cellelinje (MCF-7 CC). Den detaljerte utvelgelsesprosessen og karakteriseringen av disse utvalgte cellelinjer ble beskrevet tidligere 24.
- Dyrke alle celler i 10 cm kulturskåler ved 37 ° C i et medium bestående av 90% Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) og 10% føtalt bovint serum (FBS) og supplementert med ikke-essensielle aminosyrer. Holde mediet i en 5% CO2 atmosfære. Oppretthold MCF-7 TXT celler på 5 nM docetaxel.
- Seed cellene på dekkglass for live bildebehandling. Steriliser 24 mm poly-L-lysin-belagte dekkglass ved å skylle dem med 70% alkohol og deretter utsette dem for UV natten. Plassere objektglassene i en 6-brønns kulturplate på 35 mm. pless en dekkglass i hver brønn.
- Fjern mediet fra den 10-cm kulturskål og vask av cellene med PBS. Legg 0,5 ml trypsin-EDTA til retten for å løsne cellene fra fatet. Tilsett 5 ml av kulturmedium til fatet for å nøytralisere trypsin etter løsgjøring av cellene.
- Tell cellene med et hemocytometer for å bestemme antall celler pr volumenhet.
- Tilsett ca 10 5 celler i hver brønn på grunnlag av celletallet pr volumenhet. Etter risting det forsiktig, sette platen tilbake i kuvøse for å la cellene å feste til dekk.
- Uttrykk av GFP-merket α-tubulin
- For å analysere mikrotubul-dynamikk, transduce cellene med GFP-merket α-tubulin med den kommersielle GFP transduksjon kontroll (f.eks BacMam) i henhold til produsentens protokoll.
- Kultur ble cellene i brønnen i 36 timer i en 37 ° C inkubator cellekultur for å tillate complett vedheft og 60% samløpet.
- Beregn passende volum av GFP-merket α-tubulin for å legge til hver brønn, i henhold til følgende ligning:
Antall celler er beregnet totalt antall celler i brønnen på tidspunktet for merkingen og den ønskede PPC er antall partikler per celle.
MERK: poding av MCF-7-celler skulle ha fordoblet celletallet fra 10 5 til 2 x 10 5 med en ønsket PPC av 20, volumet nødvendig for hvert dekkglass er derfor 40 ul. For ulike celler, beregnet volumet basert på formelen ovenfor er kanskje ikke den beste. Den eksakte volumet skal justeres i henhold til selve uttrykket nivået av GFP-tubulin. - Bland GFP-merket a-tubulin flere ganger ved inversjon for å sikre en homogen løsning. Ikke vortex.
MERK: For kontrollen mangler Null (kontroll) reagent noen pattedyr genetiskelementer og kan brukes til å bidra til å påvise baculovirus-mediert effekter og bakgrunn fluorescens. En ikke-målrettet GFP transduksjon kontroll kan også brukes, noe som vil ses i hele cellen. - Erstatte dyrkningsmediet med friskt medium. Tilsett 2 ml av det nye medium og 40 ul av GFP-merket α-tubulin til hver brønn.
- Rist platen forsiktig for å tillate fullstendig blanding av GFP-merket α-tubulin med kulturmediet. Returner platen til inkubatoren og kulturen inkuberes i 24 timer for å tillate ekspresjon av GFP-tubulin.
- Behandle celler med docetaxel
MERK: Dette eksperimentet er å teste effekten av docetaxel på microtubule dynamisk ustabilitet. Således blir cellene behandlet med den ønskede konsentrasjon av docetaxel.- Fremstille et medium bestående av DMEM 90% og 10% av FBS og supplementert med ikke-essensielle aminosyrer. Bruk DMEM uten fenolrødt fordi fenolrødt kan interferere med fluorescence av GFP-tubulin. Legge til den ønskede konsentrasjon av docetaxel (i området fra 10 nM til 10 uM). Stamoppløsningen av docetaxel er 10 mM i dimetylsulfoksid (DMSO).
- Forvarme den docetaxel-inneholdende medium til 37 ° C i en vevskulturinkubator.
- Erstatte vanlig kulturmedium med den docetaxel-inneholdende medium og inkuber i 30 min i vevskultur-inkubator. Det bør være minst 3 Dekk per brønn for hver docetaxel konsentrasjon.
2. Levende Imaging å undersøke microtubuli Dynamic Ustabilitet
- Sette opp systemet
- Utføre eksperimenter i et kammer holdt ved 37 ° C og 5% CO2. Acquire fluorescens bilder av tid forfalle med en mikroskopisk system utstyrt med en 60X, 1,42 NA olje objektiv på en omvendt fluorescens mikroskop og med en CCD-kamera.
- Sett opp cellene for live bildebehandling. Pre-varme både prøveholderen ogmediet til 37 ° C. Velg et dekkglass for å undersøke. Monter dekk av interesse på en prøveholder og inkuber det med 1 ml av docetaxel holdig medium fremstilt i trinn 1.3.1.
- Live-avbildning av microtubule dynamisk ustabilitet
- Identifisere de cellene som skal brukes til bildebehandling. De bør være flat, har en høy fluorescens intensitet uttrykt GFP-tubulin, og har klare mikrotubulidynamikk strukturer.
- Velge en celle fra gruppen av identifiserte cellene fra trinn 2.2.1 for å undersøke først. Fokuserer på det perifere området av den identifiserte cellen. Sett opp programmet for eksponeringstid og hyppigheten av bildet oppkjøpet. Som eksponeringstiden er vanligvis 0,5 s, vil bildene bli kjøpt hver s.
- Tillat en ekstra 20 min for trinnene fra 1.33 til 2.2.3. Således nøyaktig 50 min etter tilsetningen av docetaxel, som beskrevet i trinn 1.3.3, start imaging (dette er for standardisering).
- Noter microtubule dynamics i 2 min, ta et bilde hver 2 s. Totalt erverve 60 bilder for den identifiserte cellen.
- Flytt til neste identifiserte cellen og gjenta trinn 2.2.2 til 2.2.4. Gjenta prosedyren til 5 celler har blitt avbildet. Det er viktig å gjøre dette før tiden når 70 minutter etter tilsetningen av docetaxel, som beskrevet i trinn 1.3.3.
- For hver behandling tilstand, gjenta trinn 2.2.1 til 2.2.5 i 3 forskjellige dekkglass. Totalt bilde 15 celler, som er nok data til å måle microtubule dynamisk ustabilitet.
3. Bildebehandling og dataanalyse
- Deconvolution av bilder
- Dekonvolvere de oppkjøpte bildene for å oppnå en høy kvalitet. Åpne dekonvolveringen program er utstyrt med mikroskopet system.
- Klikk "Process" og velg "dekonvolvere." Dra bildefilen til "Input" vinduet og klikk "Do." Bildefilen vil bli dekonvolveres, ogdekonvolveres filen vil bli lagret som en ny fil automatisk.
- Generering av videoer
- Klikk på dekonvolveres bildefilen for å åpne med utstyrt programvare.
- Klikk på "File" og velg "Lagre som film." Velg "Movie format" som "AV" og "animasjon stil" som "Forward". Sett "Compression kvalitet" til "100%" og "Frame rate" til "5 / sekund."
- Kryss av i boksen for "Animate gjennom tiden" og klikk "Gjør det." Videoen vil bli generert.
- Måling av microtubule forkorting og vekst
- Identifiser mikrotubuli som skal brukes for måling. For hver celle, vil bare noen få mikrotubuli kunne ha sin forkorting eller vekst fulgt klart og helt.
- Undersøke hver ramme av video for å identifisere den ramme som viser start lengden av mikrotubuli ennd rammen med den mest forlenges eller forkortes microtubule. Måle endringen i lengde mellom de to mikrotubuler og tiden som har gått mellom de to rammer.
- Beregn veksthastigheten eller fett ved å dividere endringen i lengde av tid (enheten er um / s). For hver behandling tilstand, følger minst 10 celler og måle minst 20 mikrotubuli.
- Beregn gjennomsnitt og standard feil for hver behandling tilstand. Analyser statistisk forskjell mellom forholdene ved hjelp av Student test. Rapportere data i en tabell og / eller i et diagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse av protokollen som presenteres her studerte vi effektene av docetaxel på mikrotubul-dynamikk av normal (MCF-7 CC) og docetaxel-resistente (MCF-7) TXT brystkreftceller. To sett med bilder viser effekten av docetaxel (0,5 mm) på microtubule vekst og forkorting i MCF-7 CC og MCF-7 TXT-celler (figur 1A).
Vi har også beregnet hastigheten av mikrotubuli vekst eller forkorte under disse betingelser for de to cellelinjer, og viste at ved 0,5 uM, docetaxel sterkt hemmer tubulin dynamikken i MCF-7-CC-celler, men ikke TXT-celler (figur 1B) MCF-7.
Figur 1: Effekter av Docetaxel på microtubule Dynamics av MCF-7 TXT og MCF-7 CC Cells. Det levende avbildning ble utført som beskrevet. (A) Utvalgte bilder fra live avbildning av mikrotubulidynamikk i MCF-7 CC og MCF-7 TXT-celler etter behandling med 0,5 mikrometer docetaxel i 1 time. Pilen indikerer strekker mikrotubuli. Pilspissen angir forkortelse mikrotubuli. Størrelse bar = 5 mikrometer. (B) Forlengelsen hastighet og forkorte frekvensen av mikrotubuli ble målt fra innspilte bilder. Hvert nullpunkt er gjennomsnittet av 20 målinger fra minst 8 forskjellige celler. Feilen Baren er standard feil. ** Angir at forskjellen er statistisk signifikant, med p <0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to hovedfremgangsmåter for å måle mikrotubul dynamisk ustabilitet: in vitro og in vivo. Ved in vitro-metoden, ble renset tubulin brukes til å måle mikrotubul dynamisk ustabilitet med datamaskinen forbedret time-lapse differensialinterferenskontrastmikroskopi. I in vivo-metode, mikroinjisert fluorescerende tubulin, eller uttrykt GFP-tubulin, er innlemmet i mikrotubuli. Dynamikken (vekst og forkorting) av mikrotubuli blir deretter registrert av time-lapse ved hjelp av et følsomt kamera i det perifere området av interfaseceller 10, 20, 25. Mens forskjellige typer av mikroskoper er blitt anvendt for dette formål, protokollen vi rapportert her anvender en dekonvolvering mikroskop.
In vivo forekommer dynamisk ustabilitet bare på mikrotubulus pluss ender (endene med β-tubulin vendt utover), mensminus ender (de ender med α-tubulin vendt utover) forblir den samme lengde 26. På den annen side, for mikrotubuli satt sammen in vitro, oppstår dynamisk ustabilitet i begge ender av mikrotubuli, med pluss endene være mer robust enn minus 27 ender. Den største fordelen med å analysere dynamisk ustabilitet in vitro er at det gir mekanistisk informasjon om den spesifikke rollen til ulike agenter på mikrotubulidynamikk i fravær av mobilnettet Maps. Dessuten, under in vitro-betingelser, dynamisk ustabilitet kan studeres i begge ender. Dette gir innsikt i de mekanismer som narkotika eller regulerende proteiner påvirker microtubule stabilitet ved motsatt ende. Historisk sett blir minus endene sporet mye mindre enn pluss-ender 10. Mye av vår forståelse av microtubule atferd kommer fra studier av mikrotubuli sammen av renset tubulin in vitro. Imidlertid, mens mange av de grunnleggende prinsipper for virkemåten mikrotubulus fått fra disse studiene kan også anvendes til mikrotubuli i cellene, er det visse forskjeller i mikrotubul-dynamikk mellom in vitro og in vivo. I celler mikrotubuli ofte vokser på en fem til ti ganger raskere hastighet, og overganger mellom vekst og / eller fett skje ~ 10 ganger oftere enn med mikrotubuli sammen av renset tubulin in vitro. Det er også dramatiske endringer i microtubuli organisasjon og dynamikk gjennom cellesyklusen, noe som reflekterer en høy grad av romlig og tidsmessig regulering av celle mikrotubuli-oppførsel. Dette kan ikke bli studert ved in vitro forskning. Videre er regulering av mikrotubulidynamikk oppnås ved tubulin posttranslational modifikasjon, tubulin isotype uttrykk, og en stor gruppe av kart og andre mikrotubulidynamikk-samspill proteiner som enten stabilisere eller destabilisere microrørelementene 28, 29. Derfor studerer microtubule ustabilitet i levende celler er mye mer fysiologisk relevant.
Metoden som beskrives her er en enkel og meget pålitelig protokoll for å studere mikrotubul-dynamikk i levende celler. Trinnene som krever mer oppmerksomhet er valget av cellen for observasjon og bestemmelse av eksponeringstiden. Det er viktig å velge celler som er flat og har høy fluorescensintensitet av GFP-tubulin. Det er også ønskelig å redusere intensiteten av magnetisering og eksponeringstiden for å unngå svekking av GFP fluorescens. Absolutt, i likhet med alle de andre in vivo-metoder, er denne protokollen ikke er egnet for å studere mikrotubul dynamisk ustabilitet under forskjellige manipulerte betingelser. For eksempel kan ulike isoformer av α- og β-tubulin oppfører seg annerledes når det gjelder mikrotubulidynamikk. Bare i vitro metoder kan anvendes for å study effektene av individuelle renset tubulin isoformer på microtubule dynamisk ustabilitet. Videre, sammenlignet med mikroinjeksjon av fluorescens-merket tubulin, kan ekspresjon av GFP-merket tubulin ved transfeksjon eller transduksjon av plasmider oppviser en forholdsvis lavere signal-til-støy-forhold. Imidlertid ekspresjon av GFP-merket tubulin i cellene ved transfeksjon eller transduksjon av plasmider som gir større frihet til å endre eksperimentelt andre cellulære egenskaper.
Av protokollen angitt her kunne brukes for forskjellige undersøkelser. På den ene side kan det tilveiebringe nye og kritisk innsikt angående funksjonen av mikrotubuli under forskjellige faser av cellesyklusen, spesielt i mitose. Den kan også brukes til å studere effekten av forskjellige cellulære prosesser, slik som migrering, på mikrotubul-dynamikk. På den annen side, kan den brukes for å studere effekten av forskjellige mikrotubul-inhibitorer (mange av dem er kreftlegemidler) på mikrotubul-dynamikk i normal ogkreftceller under flere fysiologiske forhold. Vi har brukt denne metoden for å studere effekten av ulike anti-mitotiske kreft narkotika på microtubule dynamisk ustabilitet i både docetaxel resistente og ikke-docetaxel resistent brystkreft celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
| 22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| 6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |
References
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414 (2013).
- Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
- Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
- Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
- Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
- Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
- Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
- McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
- Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
- Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
- Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
- Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
- Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
- Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
- Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
- Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
- Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
- Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
- Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
- Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318 (2008).
- Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
- Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).
