Introduction
Одностенных углеродных нанотрубок (ОСНТ) являются атомарно тонкие слои атомов углерода свернутые в длинные, тонкие цилиндры, которые обладают уникальными электронными и оптическими свойствами. 1 Такие свойства включают в себя ширину запрещенной зоны по производству ближней инфракрасной (NIR) флуоресцентное излучение с помощью экситонной рекомбинации , который очень чувствителен к своей локальной среде. Излучение NIR ОСУН попадает в ближней инфракрасной области окна, в котором глубина проникновения света максимальна для биологической ткани. 2,3 Кроме того, ОНТ обладают рядом уникальных особенностей атипичных в отличие от органических флуорофоров: ОНТ проявляют большой сдвиг Стокса, не photobleach, и не мигают. 4 В последнее время эксплуатации этих характеристик привело к развитию ассортимента новых молекулярных сенсоров с приложениями к биологии. 5,6 Unmodified, однако, ОНТ не растворяются в воде, а также получение суспензий индивидуальных однослойных может быть проблемой. 7,8 Bundliнг и агрегации однослойных в растворе может запутать их запрещенной зоны флуоресценции, 2 делает их непригодными для применения зондирования.
Диспергирование отдельных углеродных нанотрубок в водном растворе требует модификации их поверхности для предотвращения агрегации гидрофобность приводом. 9 В то время как ковалентной модификации могут оказывать SWNTs водорастворимым, 10, а также придания специфического связывания химией, дефектные участки в ОНТ решетки уменьшают или уменьшению их флуоресцентное излучение. Вместо этого ОНТ функционализации может быть достигнуто с помощью поверхностно -активные вещества, липиды, полимеры и ДНК 9,11 - 13 , которые адсорбируются на поверхности нанотрубки через гидрофобных и пи-пи - стэкинг - взаимодействий. Полученный в результате химической среды окружающей поверхности функционализованных ОСНТ называют его фазы коронным. Возмущения к фазе коронного может иметь большое влияние на экситонов, движущихся по поверхности нанотрубки, вызывая модуляций к ОНТ плавиковогоценции излучение. Именно эта чувствительная связь между фазой коронного и ОНТ флуоресценции, которые могут быть использованы для разработки новых молекулярных сенсоров путем включения специфических связывающих условий на большой площади поверхности ОНТ. Возмущения к фазе коронного ОНТ при связывании анализируемого вещества может привести к изменениям в локальной диэлектрической среде, перенос заряда, или ввести дефекты решетки, все из которых могут модулировать излучение флуоресценции ОСНТ, чтобы служить в качестве механизма передачи сигнала. 14 Этот подход используется в разработке новых люминесцентных датчиков для обнаружения множества различных классов молекул , включая ДНК, 15,16 глюкозы 17 и малых молекул , таких как АТФ, 18 активные формы кислорода 19 и оксида азота. 20,21 Тем не менее, эти подходы ограничены в том , что они опираются на существование известной связывающей модальности для целевого аналита.
В последнее время, более общим приложениемплотва к проектированию люминесцентных датчиков был разработан с использованием ОСНТ нековалентно функционализированные с амфифильных гетерополимерам, фосфолипидов и полиядерных кислот. Эти молекулы адсорбируются на поверхности углеродных нанотрубок для получения высоко стабильных суспензий индивидуальных однослойных 22 - 25 с уникальной коронных фаз , которые могут специфически связываются белки 26,27 или малые молекулы , в том числе нейромедиатора дофамина. 28 - 30 Инженерная фаза коронным для разгона ОСНТ и специфически связываются целевые аналиты называют коронным фазы молекулярного распознавания (CoPhMoRe). 28 Небольшой размер, низкая токсичность, высокая стабильность и unbleaching NIR флуоресценции датчиков CoPhMoRe ОСНТ делают их отличными кандидатами для зондирования в естественных условиях в течение длительного времени с разрешением измерений. 6 Последние исследования показали , их применение в тканях растений для оптического детектирования химически активного азота и кислорода видов. 31Особенно захватывающее приложение для датчиков CoPhMoRe ОСНТ является возможность свободного ярлыка обнаружения нейромедиаторов , таких как дофамин в естественных условиях, где другие методы, такие как электрохимического зондирования или иммуногистохимии, страдают от недостатка пространственного разрешения, временного разрешения, и специфичности.
Проектирование и обнаруживающие датчики CoPhMoRe SWNT до сих пор сдерживалось размера и химического разнообразия библиотеки диспергаторов, ограничивая вероятность обнаружения датчика для конкретной цели. На сегодняшний день исследователи лишь поцарапали поверхность доступной сопряженного совместного блока, биологических и биомиметические полимеров, которые могли бы служить в качестве функционально активные диспергаторы для датчиков ОСНТ. Здесь мы представляем различные методы для обоих диспергирующих ОСНТ и характеризующие их флуоресценции для высокопроизводительного скрининга и для одного анализа датчика ОНТ. В частности, мы опишем процедуру для однослойных покрытий с oligom полинуклеиновой кислотыERS с использованием прямого ультразвуковую обработку, а также как функционализации ОСНТ с амфифильных полимеров путем обмена поверхностно-активного вещества с помощью диализа. Мы используем (GT) 15 -DNA и полиэтиленгликоль функционализированного с родамина изотиоцианат (РИТЦ-PEG-РИТЦ) в качестве примеров. Демонстрируется использование (GT) 15 -DNA однослойных как датчик CoPhMoRe для обнаружения допамина. И, наконец, мы опишем процедуры выполнения одиночных измерений датчика молекулы, которые могут быть использованы для определения характеристик или одного зондирования молекулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (SDS) перед использованием. Наноматериалы могут иметь дополнительные риски по сравнению с их коллегой сыпучего материала. Используйте все надлежащие практики в области безопасности, включая технические средства контроля (вытяжкой, шум корпуса) и средств индивидуальной защиты (защитные очки, защитные очки, лабораторный халат, полная длина брюк, закрытые носок обуви).
1. Приготовление буферного раствора, сурфактант и растворах полимеров
- Получение 100 мМ раствора NaCl
- Растворить 584 мг NaCl в 80 мл деионизированной воды. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести общий объем до 100 мл.
- Приготовление 3% додецилсульфата натрия (ДСН)
- Растворить 3 г SDS в 80 мл деионизированной воды. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести общий объем до 100 мл.
- Получение 2% холата натрия раствор (SC)
- Растворить 2 г дернадович холат гидрат в 80 мл деионизированной воды. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести общий объем до 100 мл.
- Подготовка буфера изображений (1x Трис: 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl) ,
- Растворить 22.23 г Трис основания и 58,44 г NaCl в 500 мл деионизированной воды с использованием магнитной мешалки и пластины.
- Осторожно добавьте концентрированную соляную кислоту до достижения рН 8,1 не будет достигнута.
- Добавьте деионизированную воду до достижения конечного объема 1 л
- Синтез RITC-ПЭГ-RITC полимера
- Растворите амина difunctionalized полиэтиленгликоль (ПЭГ) (5 кДа или 20 кДа, 0,1 моль / л) и родамина изотиоцианат (RITC, 0,2 моль / л) в 1 мл смеси 1: 1 дихлорметана и диметилформамида (ДМФ).
- Добавить 0,2 моль / л N, N - диизопропилэтиламин (DIEA).
- Через 3 ч осадок с 10-кратным объемом диэтилового эфира с последующей вакуумной фильтрацией.
- Растворяться в ДМФ и повторяют эфир осаждения FOLLOср с помощью вакуумной фильтрации.
Примечание: Другие изотиоцианатные модифицированные молекулы (например, флуоресцеин изотиоцианат, FITC) могут быть прикреплены к ПЭГ или других полимеров аминов модифицированный с использованием аналогичного способа.
- Получение пегилированному-ДНК (ПЭГ-ДНК)
- Смешайте 100 мкл трис (2-карбоксиэтил) фосфина раствор гидрохлорида (ТСЕР) (0,5 М, рН 7,0) с 44,9 мкл 5'-тиол-модифицированной ДНК (1 мг / 10 мкл в 0,1 М NaCl) и добавляют к 4,855 мл деионизированной воды.
- Смесь перемешивают в течение 1 ч.
- Растворить 500 мг метоксиполиэтиленгликоль малеинимидом в 5 мл фосфатно-буферного раствора.
- Объединить растворы ДНК и ПЭГ (10 мл всего) и перемешивают в течение 24 ч.
2. Подготовка Single нанотрубка (ОСНТ) подвесов
- Мытье ОСНТ для удаления катализатора и примеси.
- Добавить 200-300 мг немытых однослойных в пластиковую Конта центрифугу трубкиоцен- ками 45 мл деионизированной воды.
- Вихревой раствор в течение 2 мин и гомогенат с использованием ванны ультразвукового в течение 5 мин. Обратите внимание , что настройки ультразвукового варьироваться от прибора к прибору, поэтому проверьте , что оптическая плотность раствора возрастает ОСНТ (т.е. чернеет) , чтобы гарантировать , что ОСНТ разгоняясь.
- Центрифуга раствор в течение 20 мин при 16100 х г и отбросить супернатант.
- Добавить приблизительно 45 мл свежей деионизированной воды.
- Повторите шаги 2.1.2-2.1.4 до 8 раз.
- Удалить столько воды, сколько возможно быть осторожным, чтобы не нарушить гранулированные ОСНТ и позволить ОНТ гранул высохнуть на воздухе.
- Суспензии нуклеиновых кислот однослойных
- Растворите нуклеиновых кислот (NA) в 0,1 М NaCl до концентрации 100 мг / мл.
- Удалить статическое электричество из одноразовых шпателем, микропробирок и ОНТ запаса с помощью антистатический пистолет. В вытяжном шкафу, добавляют 20 мкл раствора NA 980 мкл 00,1 М NaCl с последующим добавлением 1 мг одностенных углеродных нанотрубок.
- С помощью ультразвукового дезинтегратора с наконечником диаметром 3 мм, разрушать ультразвуком раствор в течение 10 мин при амплитуде 40% в бане со льдом.
- Центрифуга раствор ДНК-ОНТ ДВАЖДЫ в течение 90 мин при 16100 х г. При использовании ПЭГ-ДНК, очищают из избыток и непрореагировавший ДНК и ПЭГ с использованием 100 кДа спин-фильтр. Добавьте достаточно PBS, чтобы заполнить спин-фильтр и спина при 9300 мкг в течение 1,5 мин, повторите этот шаг мыть 3 раза.
- Собрать и сохранить супернатант, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить осадок, содержащий CNT пучки и агрегатов. Выбросите осадок в соответствии с институциональными процедурами опасных отходов, пригодных для наноматериалов.
- Измерьте оптическую плотность раствора при 632 нм с использованием UV / VIS спектрофотометр для определения приблизительного концентрации взвешенных с использованием однослойных e = 0,036 л / см · мг в соответствии с законом Ламберта-Бера и соответствующий коэффициент разбавления.
- Амфифильные полимерные суспензииОСУН
- Удалить статическое электричество из одноразовых шпателем, микро центрифужные пробирки и ОНТ складе. В вытяжном шкафу, добавляют 5 мг ОСНТ к 5 мл 2% раствора SC (в качестве альтернативы, раствор ДСН может быть использован).
- С помощью ультразвукового дезинтегратора с наконечником диаметром 6 мм, разрушать ультразвуком раствор в течение 1 ч при амплитуде 40% в бане со льдом.
- Образец Центрифуга при 150000 мкг в течение 4 ч с использованием ультрацентрифуге и тщательно собирают супернатант.
- Растворите 1% вес амфифильного полимера (например, RITC-ПЭГ-RITC) в растворе SC-ОНТ.
- Диализировать раствора полимера-SC-ОНТ с применением диализной мембраны 3,5 кДа против 1 л деионизированной воды или буфера в течение 5 дней. Изменение в воду или буфер, после того, как часа 2 и ч 4. Больший диализ мембрана может быть использована, при условии, что она обеспечивает возможность удаления поверхностно-активного вещества выбора, но сохранение как ОНТ и амфифильного полимера.
- Измеряют поглощение раствора при 632 нм с использованием UV / VIS спектрофотометр для определенияпримерную концентрацию взвешенных с использованием однослойных e = 0,036 л / см * мг в соответствии с законом Ламберта-Бера и соответствующий коэффициент разбавления.
3. Подготовка поверхности Прикол ОСНТ Датчики
- Приготовление БСА-биотин и растворов NeutrAvidin
- Растворите 10 мг лиофилизованного БСА-биотин в 1 мл деионизированной воды, чтобы сделать 10 мг мл маточного раствора / и хранят при температуре 4 ° С.
- Растворите 10 мг NeutrAvidin белка (СЧА, дегликозилированную авидин белка) в 2 мл деионизированной воды, чтобы сделать 5 мг / мл маточного раствора. Храните аликвоты при -20 ° C. Размороженные аликвоты можно хранить в течение нескольких дней при температуре 4 ° C.
- Подготовка БСА-биотин микроскопа с покрытием слайды
- Очистить стекло микроскопа и 0,17 мм покровного стекла (или в случае необходимости для объектива микроскопа) с деионизированной водой, после чего метанол, ацетон и окончательной промывки деионизированной воды.
- Добавьте 100 мкл БСА-биотин маточного раствора до 900 мкл 1х буфера Трис до конечной концентрации 1 мг / мл.
- Поток 50 мкл БСА-биотин раствора в канал с помощью пипетки раствор в один конец и затекания прочь решение на другой с помощью ткани. Инкубировать в течение 5 минут, а затем 3-5 промываний с 50 мкл 0,1 М NaCl.
- Развести 40 мкл 5 мг / мл СЧА фонда в 960 мкл 1х буфера Трис до конечной концентрации 0,2 мг / мл.
- Поток 50 мкл раствора СЧА в канал с помощью пипетки раствор в один конец и затекания прочь решение на другой с помощью ткани. Выдержите в течение 2-5 минутс последующим 3-5 промываний с 50 мкл 0,1 М NaCl.
- Разбавляют растворы взвешенных одностенных углеродных нанотрубок в буфере изображений до концентрации 1-10 мг / л и 50 потока мкл раствора в канал и инкубировать в течение 5 мин.
- Осторожно смыть избыток ОСНТ с использованием 50 мкл буфера для формирования изображения.
- Приготовление APTES силанизированы микроскопа
Примечание: APTES силанизированы слайды позволяют способ иммобилизации отрицательно заряженной ДНК-обернутый ОСНТ на поверхность стеклянной подложки.- Приготовьте 10% -ный раствор (3-аминопропил) триэтоксисиланом (APTES) в этаноле.
- Используя каналы, выполненные с помощью шагов, описанных в 3.2.2, поток в 100 мкл 1х буфера Трис.
- Промойте канал с раствором APTES и инкубировать в течение 5 мин. Мытье с буфером 1x Трис.
- Разбавляют растворы взвешенных ДНК-одностенных углеродных нанотрубок в буфере изображений до концентрации 1-10 мг потока / Land 50 мкл раствора в канал и incubели в течение 5 мин.
- Осторожно смыть избыток ОСНТ с использованием 50 мкл буфера для формирования изображения.
4. флуоресцентная спектроскопия и микроскопия ОСНТ Датчики
- Nir флуоресцентной микроскопией
- Выполните снимки поверхности иммобилизованных ОСНТ с использованием лазерного возбуждения и инвертированного микроскопа, оборудованное массив датчиков InGaAs для работы с изображениями.
- Прямой лазерный луч, чтобы войти в задней подсветкой порт инвертированного микроскопа с помощью зеркал на регулируемых кинематических опор и пару почтовых монтажа ирисов, установленных на высоте порта. Убедитесь, что луч ровная и прямая, подтвердив, что проходит через обе ирисы при размещении между последующими зеркалами и перед входом в порт освещения. При необходимости, отрегулируйте высоту луча с помощью узла перископа. Удалите все тепловые фильтры короткого проходят по освещенности порта, который ослабило бы луч.
- Вставьте соответствующий фильтр куба в микроскопчтобы отражать свет возбуждения в объективное и собирать излучение света. Это , как правило , состоит из дихроичного фильтра длинный пас с обрезанием выше длины волны возбуждения, (например, 750 LP) и излучения длиной фильтром (например, 850 LP) для дальнейшего уменьшения рассеянного света возбуждения от удара датчика. Кроме того, фильтр эмиссии может быть выбран, чтобы быть избирательным для эмиссии однослойных конкретного хиральности.
- Выполните точную регулировку выравнивания луча путем вставки соответствующего выравнивания куба, заменяющего цели с двумя смещенными, матовыми дисками, содержащими 1 мм микроотверстий. Совместите луч в центре обеих нижних и верхних дисков выравнивания.
- Приложить массив датчиков InGaAs 2D к порту бокового обзора микроскопа с помощью соответствующего адаптера и объектив 0.5x, если это необходимо, чтобы приспособить размер сенсора.
- Использование нефти погружения цели 100X (1.4 NA), применяются флуоресценции свободное погружение масло и поместить IMMOBIтрализованную образец ОНТ на столик микроскопа.
- Поднимайте цель пока нефтяные контакты в нижней части покровного стекла (# 1,5, толщина 170 мкм). Внесите изменения в объективном воротник в случае необходимости для условий обработки изображений, например, температуры, толщины стекла и т.д.
- Медленно поднимите цели с источником возбуждения на и контролировать сигнал флуоресценции камеры InGaAs. Интенсивность флуоресценции должна постепенно возрастать по мере фокальной плоскости приближается к поверхности и иммобилизованные датчики приходят в фокус.
- Nir флуоресцентной спектроскопии
Примечание: Флуоресцентная спектроскопия может быть выполнена с использованием тех же настройки микроскопа, но направляя собранный свет из тела микроскопа и в спектрометре и InGaAs детектор линейный массив.- Используя кинематические опоры и зеркала рассчитаны на NIR, направлять световой путь к входной щели спектрометра. Фокусируют свет вниз к поинт на входную щель с помощью фокусирующей линзы (например, плоско-выпуклая, F = 150 мм). Это выравнивание достигается путем ослабления мощности лазера на <1 мВт и замена объектива микроскопа с «зеркалом 1 и с использованием светофильтров 50:50 светоделительная. Возбуждающий свет будет затем покидают корпус микроскопа через выпускное отверстие и может использоваться для регулировки зеркала и линзы для фокусировки луча на входную щель.
- После замены объектива микроскопа и длинный фильтр нижних частот, поместите луночного планшета на сцену и записывать спектры образца в фокусе с помощью спектрометра и InGaAs массив.
- Измерение обратимой реакции (GT) 15 ДНК-ОСНТ до допамина
- Датчик Маунт покрытием каналов на столик микроскопа и привести в фокус с использованием объектива масла 100X и InGaAs камеру. Добавляют 50 мкл 100 мкМ раствора дофамина в фосфатном буферном растворе (PBS) в проточном канале и записиизменение интенсивности флуоресценции.
- Промывают раствор дофамина с использованием фосфатно-солевом буферном и наблюдать изменение флуоресценции отдельных датчиков ОСНТ.
- Хорошо пластина скрининга для аналита реакции однослойных датчиков
Примечание: Скрининг различных аналитов может быть выполнена с использованием прозрачной луночного планшета, регулировали с помощью моторизованного столика. Идеальная пластина хорошо является прозрачным для видимого и ИК и имеет черные боковые стенки, чтобы свести к минимуму перекрестные помехи между скважинами.- Пипетка равные объемы взвешенных датчика ОСНТ (например, 5 мг / л концентрация) в каждую лунку, достаточно , чтобы покрыть дно колодца равномерно, то обычно> 100 мкл для 96-луночного планшета и> 30 мкл для 384-луночного планшета ,
- Пипетировать аналитов (например, 2 мкл, 100 мкМ конечный объем) от скрининга библиотеки в луночные планшеты. Подготовка каждого аналита в трех экземплярах для учета потенциальной ямы к яме вариации, fluctuatИоны интенсивности возбуждения или температуры.
- Поднимите цель (например, 20X achroplan, 0,45 NA) при мониторинге спектров излучения с помощью спектрометра и InGaAs массив. Оптимальное положение объектива поместит фокальной плоскости примерно в середине объема образца в скважине, которое должно соответствовать максимальному измеренных значений интенсивности.
- Для каждого образца скважины, записи 1-10 сек экспозиции для сбора спектра.
- Сравнение спектров излучения для каждой лунки с контролем, содержащим только ОСНТ без дополнительных аналита для количественного определения реакции флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ОНТ суспендировали в водном растворе с использованием как поверхностно-активные вещества и амфифильных полимеров путем прямого озвучивания и путем обмена диализом. На рисунке 1 показана ОСНТ, выращенных с использованием карбонила железа , катализируемой метод (HiPCO), подвесить с помощью SC, RITC-PEF20-RITC, и (GT) 15 -DNA. Оптическая плотность одностенных углеродных нанотрубок с ДСН (или полимер) , резко возрастает после обработки ультразвуком и уменьшается при удалении агрегатов и загрязняющих веществ путем очистки с помощью центрифугирования (рисунок 1). Измерения оптической плотности при 632 нм количественно концентрацию взвешенных ОНТ. 28
Фотофизические свойства ОСНТ суспензий характеризуются использованием оптической плотности и флуоресцентной спектроскопии. На рисунке 2 показана поглощения и флуоресценции спектров однослойных взвешенных с использованием (GT) 15 -DNA и RITC-PEG20-RITC. ThСпектры электронной оптической плотности представляют собой суперпозицию отдельных пиков оптической плотности для каждого отдельного хиральности нанотрубок, присутствующих в образце. Аналогичным образом, каждая хиральности демонстрирует свой уникальный пик излучения флуоресценции. Различия в относительной интенсивности пика эмиссии являются результатом различий в распределении населения киральностей, а также различия в эффективности возбуждения с использованием 721 нм лазер.
Флуоресценции реакция (GT) 15 ДНК-ОСНТ (где 0 является начальная интенсивность ОНТ флуоресценции и I- интенсивность ОНТ после добавления дофамина) в присутствии различных концентраций дофамина измеряется путем мониторинга флуоресценции образца с использованием спектрофотометр и InGaAs линейный массив (рисунок 3). Общая флуоресценция (GT) 15 -DNA-ОНТ увеличивается с увеличением концентрации дофамина (рис 3а). Флуоресценции гesponse является функцией пика излучения (рис 3b), что свидетельствует о том , что ответ может быть хиральности конкретными. Флуоресценция 1,044 нм и 1078 нм достигает максимума увеличение интенсивности в 2 раза, как концентрация дофамина приближается к 2 мкМ. На рисунке 3е показана зависимость интенсивности всего спектра излучения ПЕГ (GT) 15 ДНК-ОНТ увеличение в ответ на добавление допамина.
Отдельные ОНТ с покрытием с использованием альтернативной последовательности ДНК, С 26 -DNA (полученный с использованием тех же методов в (GT) 15), привязанные к поверхности предметного стекла микроскопа измеряют под действием лазерного излучения с использованием камеры InGaAs и 100X цель масло погружения (рис 4). Мониторинг одиночных излучателей привязанным к поверхности может быть использована для проверки обратимости реакции датчика путем промывки молекул-мишеней с использованием прочь буферного раствора. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) MICROSкопирования также могут быть использованы для ДНК красителем, конъюгированным изображений, адсорбированным на одностенных углеродных нанотрубок, чтобы определить число молекул ДНК, присоединенных к каждой трубе через фотообесцвечиванию экспериментов. На рисунке 4 показаны 3 различных отбеливающих событий Cy- 3 меченой ДНК вытекает из квантованных шагов интенсивности флуоресценции следа одного эмиттера. Эти результаты указывают на то, что три молекулы ДНК прикреплены к ОНТ.
Рисунок 1: Полимер и сурфактанта Подвесной ОСНТ. (А) Фотография RITC-PEG20-RITC однослойных приостановлено с использованием 2% SC в различных точках подготовки. Слева: ОНТ добавляют непосредственно к раствору SC до озвучивания. Центр: Через 10 мин ванну с последующей обработкой ультразвуком 10 мин наконечника зонда обработки ультразвуком при 90% амплитуды с последующим центрифугированием. Оптическая плотность раствора возрастает по мере ОСНТ расслоениядиспергируют (~ 100 мг / л Концентрация ОНТ). Справа: После того, как диализ с RITC-PEG20-RITC полимера, конечная концентрация RITC-PEG-РИТЦ подвешенный ОСНТ составляет ~ 20 мг / л. (Б) выход ОНТ подвески может изменяться в зависимости от используемого полимера , чтобы приостановить ОСНТ. Оптическая плотность раствора обеспечивает хорошую оценку концентрации раствора фазы ОНТ. Изображенный различные концентрации (GT) 15 -DNA подвесные трубки при различных концентрациях. Слева направо: 100 мг / л, 10 мг / л, 1 мг / л, 0 мг / л. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: спектры поглощения и флуоресценции выбросов поверхностно -активного вещества и полимера приостановлено ОСНТ. (А) представитель абсорбцию зрectra ОСУН взвешенных с использованием (GT) 15 -DNA путем прямого ультразвуковую обработку. Концентрация ОНТ составляет 10 мг / л. Вставки: УФ-области спектра поглощения показывает характерный пик ДНК поглощения при 260 нм. (Б) спектры поглощения RITC-PEG20-RITC ОНТ после обмена SC диализом. Врезка: Абсорбция из 10-кратного разбавленного образца RITC-PEG-RITC однослойных показывает характерную абсорбцию родамина. (С) эмиссионные спектры Представитель NIR ОСУН взвешенных с использованием (GT) 15 -DNA путем прямого озвучивания (785 нм возбуждение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Обнаружение флуоресценция дофамина с использованием (GT) 15 -DNA завернутые ОНТ. (а сильный>) Флуоресцентная реакция (GT) 15 -DNA обернутые ОСНТ добавлением дофамина. Образцы датчиков при концентрации 5 мг / л возбуждались с использованием 500 мВт, 721 нм CW лазер. Интегрированный флуоресценция излучения датчика от 900-1,350 нм возрастает с увеличением концентрации добавленного допамин 1 мкМ до 250 мкМ. (Б) Спектры флуоресцентной эмиссии ПЕГ (GT) 15 -DNA обернуты ОНТ до и после добавления допамина. Концентрация датчика составляет 10 мг / мл, к которому дофамина был добавлен до конечной концентрации 100 мкМ. Образцы возбуждались с использованием 500 мВт, 721 нм CW лазер. Два Наибольшая интенсивность пиков примерно в два раза по интенсивности после добавления допамина. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
г "/>
Рисунок 4: Флуоресцентная визуализация одной поверхности с иммобилизованным однослойных. (А) Флуоресцентная эмиссия индивидуальной C 26 -DNA-ОНТ (красные стрелки) иммобилизуют на кремнезем покровным (# 1.5) , используя процедуру APTES силанизация и визуализируют с помощью сенсорного массива 2D InGaAs, инвертированный микроскоп с объективом 100X масла погружения ( план апохромат, 1.4 NA) и 500 мВт, 721 нм CW лазера. (Б) Флуоресцентный отбеливающий эксперимент С 26 -Cy3 ДНК-ОСНТ привязанным к поверхности с помощью APTES. Нити ДНК 3 'неизлечимо помечены Cy3 до приостановления трубки. Отслеживание инкрементный пошаговый фотообесцвечивание (красный встроенна трассировку) отдельных датчиков используется для определения количества молекул ДНК, адсорбированных на поверхности одностенных углеродных нанотрубок. Изображения были получены с использованием инвертированного микроскопа в режиме TIRF с целью 100X иммерсионным (план Apochromat, 1,4 NA) и 561 нм лазерным возбуждением. Шкала бар: 10 мкм.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ОНТ легко суспендируют в водном растворе с помощью прямого озвучивания с SDS или одноцепочечной ДНК, как показано увеличением оптической плотности, представленной коллоидной дисперсии полученного ОНТ-полимера гибрид. SDS и оцДНК рассеивает и растворяет пучки одностенных углеродных нанотрубок путем адсорбции на поверхности ОНТ через гидрофобных или пи-пи-взаимодействий. Кроме того, другие полимеры, такие как геномную ДНК, амфифильных полимеров, конъюгированных полимеров и липидов, могут адсорбироваться на поверхности одностенных углеродных нанотрубок путем диализа образцов взвешенных с использованием SC или SDS. Гидрофильные полимеры, такие как PEG, может быть в конечном модифицированные с гидрофобными "якоря", такие как РИТЦ или FITC, чтобы позволить поверхностную адсорбцию блок-сополимера. Для получения полимеров, которые восприимчивы к стрижке или деградации под воздействием высоких степеней зондами наконечника озвучивания, или для полимеров с низкой аффинностью связывания с ОНТ, диализ является наилучшим способом для получения стабильной ОНТ-полимерной суспензии. После полимерных Encapsавляет, центрифугирование устраняет крупные ОНТ пучки, аморфный углерод, катализатор остаточного металла, и другие нерастворимые загрязняющие вещества, чтобы оставить однородно диспергированной пробы. Типичные конечные концентрации дисперсных однослойных после диапазона центрифугирование между 10-100 мг / л.
Озвучивание мощность и продолжительность может быть скорректирована и оптимизирована для конкретного выбора диспергатора. Это очень важный шаг в процедуре для однослойных покрытий, потому что слишком мало или слабый Озвучивание может привести к плохой разгон, в то время как слишком много или слишком мощный Озвучивание может привести к ухудшению флуоресценции. Как правило, более низкие силы необходимы, чтобы свести к минимуму повреждения при использовании полимеров, восприимчивых к стрижке, таких как ДНК. Более длительные или более высокие Ультразвуком интенсивности может привести к уменьшению длины ОСНТ, где ОНТ ниже нм экситонной рекомбинации длина ~ 100 становятся нефлуоресцирующего. Размер наконечника зонда Sonicator должен также соответствовать объему образца, чтобы избежать разбрызгивания и пенообразования для оптимальногоРезультаты (обычно предоставляется изготовителем). Избегайте касания кончиком зонда к сторонам контейнера и поместите раствор на блок со льдом, чтобы свести к минимуму нагрев раствора. После того, как разошлись, решения однослойных стабильны при комнатной температуре на неопределенный срок.
Абсорбция и излучения растворов, диспергированных генерируемых ОСНТ содержат множество пиков, что указывает на присутствие смеси диспергированных одностенных углеродных нанотрубок разной хиральностью. Альтернативные методы генерации или очистки методами ОСНТ может изменить распределение хиральности, что приводит к различным пика возбуждения и спектров флуоресценции излучение. Кроме того, различные методы синтеза могут давать образцы однослойных с различными распределениями хиральности населения. Например: CoMoCAT (катализатор кобальт-молибден), выращенных ОНТ богаты (6,5) хиральность, в то время как HiPCO (высокое давление с катализатором карбонила железа), выращиваемые ОНТ богаты (7,6) хиральность, что приводит к различиям в поглощении и фотoluminescence спектры.
Некоторые адсорбированные полимеры позволяют специфической детекции аналитов путем модуляции флуоресценции ОСНТ путем изменения местной окружающей среды на поверхности трубки. Этот подход предлагает неоспоримое преимущество перед ковалентного присоединения связывания фрагментов, не постоянно нарушая ОНТ решетку, которая может уменьшить интенсивность флуоресценции. 6,32 - 34 Кроме того, CoPhMoRe подход имеет потенциал для разработки сенсоров антител , свободных для целей там , где не может уже существовать известный связывающий фрагмент. 28 В частности, (GT) 15 -DNA было показано, выборочно усилить флуоресцентное излучение ОСНТ в присутствии дофамина, что позволяет использовать его в качестве датчика дофамина. Объемные измерения флуоресценции показывают увеличение на 80% в пик эмиссии для некоторых ОСНТ хиральности. Иммобилизации (GT) 15 -DNA ОНТ на предметном стекле позволяет флуоресценции соотвonse измерений индивидуальных (GT) 15 -DNA функционализированного ОНТ, показывая , что флуоресценция может увеличиться более чем в 3 раза для отдельных датчиков ОСНТ в присутствии дофамин, без какого - либо заметного фотообесцвечиванию, при непрерывном лазерном освещении. Взаимодействие между дофамином и датчиком ОНТ является обратимым, как это видно по восстановлению первоначального флуоресцентного сигнала после промывки дофамина из микрожидком камеры с буфером. Кроме того, измерения одной молекулы может быть мощным средством для количественного определения характеристик полимера адсорбции (рисунок 4) или кинетику связывания событий. Кроме того , радиометрический зондирования может быть достигнуто за счет химической изоляции особую ОНТ хиральность с уникальным пиком возбуждения эмиссии, функционализации ее (GT) 15 -DNA, и выделение второго ОНТ хиральность нечувствительной к допамин. Мониторинг как ОНТ киралыюсть обеспечивает постоянный контроль флуоресценции канал, который можно сравнить с м odulating флуоресценцию (GT) 15 -DNA однослойных. Комбинирование различных полимеров (например, полиэтиленгликоль и (GT) 15 -DNA) можно добавить дополнительные функциональные возможности, такие как модифицирующие температуропроводности или клеточное поглощение характеристик, свойств , которые имеют решающее значение при проведении экспериментов в естественных условиях.
В настоящее время ограничение CoPhMoRe подхода к датчику развития включают в себя полимерную развитие библиотеки. Поскольку связывающие фрагменты не известны априори, разрабатывает датчик для конкретной цели может быть вычислено время интенсивного и требуют большого количества химически разнообразных полимеров для конструирования библиотеки датчика для скрининга. Кроме того, стабильность и совместимость датчиков в среде в естественных условиях может варьироваться от датчика к датчику. Тем не менее, как только датчик кандидат был определен, дальнейшие стратегии модификации могут быть использованы для оптимизации свойств по мере необходимости для применения в естественных условиях.
ve_content "> При этом мы продемонстрировали методологию для диспергирования ОСНТ в водных растворах, применяемых для широкого спектра диспергирующих агентов. Такой подход может быть использован для создания библиотеки дисперсных однослойных для открытия новых новых датчиков NIR для малых молекул и биологических маркеров . Особый интерес представляют собой датчики для обнаружения нейротрансмиттеров, что могло бы позволить в реальном масштабе времени, пространственно точное обнаружение этих молекул в сложных биологических средах.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
