Introduction
Los nanotubos de carbono de pared simple (SWNT) son atómicamente delgadas capas de átomos de carbono laminados en cilindros largos y delgados que exhiben propiedades electrónicas y ópticas únicas. 1 Tales propiedades incluyen una producción cercano (NIR) la emisión infrarroja de fluorescencia a través de recombinación de excitones que es altamente sensible a su entorno local de intervalo de banda. La emisión NIR de SWNT cae dentro de la ventana de infrarrojo cercano en el que la profundidad de penetración de la luz es máxima para el tejido biológico. 2,3 Además, los nanotubos exhiben varias características únicas atípicos en contraste con fluoróforos orgánicos: SWNT exhiben un gran desplazamiento de Stokes, no photobleach, y no parpadean. 4 Recientemente, la explotación de estas características se ha llevado al desarrollo de una variedad de sensores moleculares novedosas con aplicaciones a la biología. 5,6 sin modificar, sin embargo, SWNT son insolubles en agua, y la obtención de suspensiones de SWNT individuales puede ser un desafío. 7,8 Bundling y la agregación de los nanotubos en solución pueden ocultar su fluorescencia banda prohibida, 2 haciéndolos inadecuados para aplicaciones de detección.
La dispersión de los nanotubos de carbono individuales en solución acuosa requiere la modificación de su superficie para evitar la agregación hidrofobicidad impulsada. 9 Si bien la modificación covalente puede hacer que los nanotubos soluble en agua, 10, así como impartir la química de unión específica, los sitios con defectos en la red cristalina de SWNT reducen o reducir su emisión de fluorescencia. En su lugar, SWNT funcionalización se puede lograr mediante el uso de tensioactivos, lípidos, polímeros y ADN 9,11 - 13 que se adsorben a la superficie de nanotubos a través de interacciones de apilamiento hidrófobos y pi-pi. El ambiente químico resultante que rodea SWNT funcionalizados en la superficie se conoce como la fase de corona. Las perturbaciones a la fase de corona pueden tener un gran impacto en los excitones que viajan sobre la superficie de nanotubos, causando modulaciones a SWNT fluorEscence emisión. Es esta relación sensible entre la fase de corona y la fluorescencia SWNT que puede ser explotado para desarrollar nuevos sensores moleculares mediante la incorporación de modalidades de unión específicos a la gran área de superficie de SWNT. Las perturbaciones a la fase de corona SWNT sobre analito de unión pueden dar lugar a cambios en el entorno dieléctrico local, transferencia de carga, o introducir defectos en la red, todos los cuales pueden modular la emisión de fluorescencia de los SWNT para servir como un mecanismo de transducción de señales. 14 Este enfoque se utiliza en el desarrollo de sensores fluorescentes novedosos para la detección de muchas clases diferentes de moléculas de ADN incluyendo, 15,16 glucosa 17 y moléculas pequeñas tales como ATP, 18 especies reactivas de oxígeno 19 y el óxido nítrico. 20,21 Sin embargo, estos enfoques están limitados en que se basan en la existencia de una modalidad de unión conocida para el analito objetivo.
Recientemente, una aplicación más genéricaRoach para el diseño de sensores fluorescentes se desarrolló utilizando SWNT funcionalizados de forma no covalente con heteropolímeros anfifílicos, fosfolípidos y ácidos polinucleicos. Estas moléculas se adsorben a las superficies de nanotubos de carbono para producir suspensiones altamente estables de SWNT individuales 22 - 25 con fases de corona únicas que pueden unirse específicamente a las proteínas 26,27 o pequeñas moléculas que incluyen el neurotransmisor dopamina. 28 - 30 Ingeniería de la fase de corona para dispersar los nanotubos y específicamente analitos diana se unen se conoce como fase de reconocimiento molecular de corona (CoPhMoRe). 28 El pequeño tamaño, baja toxicidad, alta estabilidad y unbleaching fluorescencia de sensores NIR CoPhMoRe SWNT los hacen excelentes candidatos para la detección in vivo para las mediciones de tiempo de resolverse prolongados. 6 Trabajos recientes han demostrado sus aplicaciones en tejidos de la planta para la detección óptica de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. 31Una aplicación particularmente interesante para los sensores CoPhMoRe SWNT es el potencial para la detección sin etiqueta de neurotransmisores tales como la dopamina in vivo, donde otras técnicas, tales como un sensor electroquímico o inmunohistoquímica, sufren de una falta de resolución espacial, la resolución temporal, y especificidad.
El diseño y el descubrimiento de sensores CoPhMoRe SWNT ha sido hasta ahora restringido por el tamaño y la diversidad química de la biblioteca dispersante, lo que limita las posibilidades de encontrar un sensor para un objetivo particular. Hasta la fecha, los investigadores sólo han arañado la superficie de conjugado disponibles, co-bloque, biológica y polímeros biomiméticos que podrían servir como dispersantes funcionalmente activas para sensores de SWNT. A continuación, presentamos diferentes métodos tanto para la dispersión de los nanotubos y la caracterización de su fluorescencia de cribado de alto rendimiento para el análisis y el único sensor de SWNT. Específicamente, se describe el procedimiento para los nanotubos de pintura, haciendo oligom ácido polinucleicoERS mediante sonicación directa, así como la forma de funcionalizar SWNT con polímeros anfifílicos a través del intercambio de surfactante mediante diálisis. Utilizamos (GT) 15-DNA y polietilenglicol funcionalizado con isotiocianato de rodamina (RITC-PEG-RITC) como ejemplos. Se demuestra el uso de (GT) 15 -ADN SWNT como un sensor CoPhMoRe para la detección de la dopamina. Por último, se describe procedimientos para realizar mediciones de sensor molécula individuales, que se pueden utilizar para la caracterización o la detección de moléculas individuales.
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Protocol
Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (SDS) antes de su uso. Los nanomateriales pueden tener riesgos adicionales en comparación con su contraparte material a granel. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas, incluyendo controles de ingeniería (campana de humos, recinto de ruido) y el equipo de protección personal (gafas de seguridad, gafas, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos).
1. Preparación del tampón, tensioactivo y Polymer Solutions
- Preparación de solución de NaCl 100 mM
- Disolver 584 mg de NaCl en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml.
- Preparación de 3% de dodecilsulfato de sodio solución (SDS)
- Disolver 3 g de SDS en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml.
- Preparación de colato de sodio 2% de solución (SC)
- Disolver 2 g de SODium colato hidrato en 80 ml de agua desionizada. Añadir agua desionizada para llevar el volumen total a 100 ml.
- Preparación del tampón de imagen (1x Tris: Tris 20 mM, NaCl 100 mM)
- Disolver 22,23 g de base Tris y 58,44 g de NaCl en 500 ml de agua desionizada usando una barra de agitación magnética y la placa.
- Añadir cuidadosamente HCl concentrado hasta que se alcanza un pH de 8,1.
- Añadir agua desionizada para alcanzar un volumen final de 1 L.
- Síntesis del polímero RITC-PEG-RITC
- Disolver amina polietilenglicol difuncionalizado (PEG) (5 kDa o 20 kDa, 0.1 mol / L) e isotiocianato de rodamina (RITC, 0.2 mol / L) en 1 ml de una mezcla 1: 1 de diclorometano y dimetilformamida (DMF).
- Añadir 0,2 mol / L de N, N-diisopropiletilamina (DIEA).
- Después de 3 h, precipitar con 10 volúmenes de éter dietílico, seguido de filtración a vacío.
- Se vuelve a disolver en DMF y repetir Follo precipitación éterconducido por filtración al vacío.
NOTA: Otras moléculas modificadas isotiocianato (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, FITC) se puede unir a PEG u otros polímeros modificados con amina usando un método similar.
- Preparación de ADN-pegilado (PEG-DNA)
- Combinar 100 l de Tris (2-carboxietil) fosfina solución de clorhidrato de (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) con 44,9 l de 5 'modificado con tiol de ADN (1 mg / 10 l de 0,1 M NaCl) y se añade a 4,855 ml de agua desionizada.
- Se agita durante 1 h.
- Disolver 500 mg de metoxipolietilenglicol maleimida glicol en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato.
- Combinar las soluciones de ADN y PEG (10 ml total) y se agita durante 24 h.
2. Preparación de una sola pared nanotubos de carbono Suspensiones (SWNT)
- Lavado de SWNT para eliminar el catalizador y las impurezas.
- Añadir 200-300 mg de SWNT sin lavar en un tubo de centrífuga de plástico contacaniza 45 ml de agua desionizada.
- Vortex la solución durante 2 min y se somete a ultrasonidos utilizando un sonicador de baño durante 5 min. Tenga en cuenta que sonicador configuración varían de un instrumento a otro, a fin de comprobar que la densidad óptica de la solución aumenta SWNT (es decir, se vuelve negro) para asegurar que los SWNT se dispersan.
- Centrifugar la solución durante 20 min a 16.100 xg y desechar el sobrenadante.
- Añadir aproximadamente 45 ml de agua desionizada fresca.
- Repita los pasos 2.1.2-2.1.4 hasta 8 veces.
- Eliminar el agua tanto como sea posible teniendo cuidado de no molestar a los nanotubos sedimentadas y permitir pellets SWNT se seque al aire.
- Suspensiones de ácido nucleico de SWNT
- Disolver ácidos nucleicos (NA) en 0,1 M NaCl a una concentración de 100 mg / mL.
- Retire la electricidad estática de espátula desechable, tubos de microcentrífuga y SWNT stock mediante una pistola antiestática. En una campana de humos, se añaden 20 l de la solución de AN a 980 l de 00,1 M NaCl seguido por la adición de 1 mg SWNT.
- El uso de un ultrasonicador con punta de 3 mm de diámetro, sonicar la solución durante 10 minutos a 40% de la amplitud en un baño de hielo.
- Centrifugar la solución de ADN-SWNT dos veces durante 90 minutos a 16.100 x g. Si el uso de PEG-ADN, purificar y eliminar el exceso de ADN que no ha reaccionado y PEG usando un spin-filtro de 100 kDa. Agregar suficiente PBS para llenar el spin-filtro y centrifugado a 9.300 xg durante 1,5 minutos, Repita este paso de lavado 3 veces.
- Recoger y guardar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento que contiene los paquetes y los agregados de la CNT. Se desecha el precipitado de conformidad con los procedimientos de desechos peligrosos institucionales apropiadas para los nanomateriales.
- Medir la absorbancia solución a 632 nm utilizando un espectrofotómetro UV / Vis espectrofotómetro para determinar la concentración aproximada de los nanotubos en suspensión utilizando ε = 0,036 L / cm · mg de acuerdo con la ley de Lambert-Beer y el factor de dilución apropiado.
- Suspensiones de polímeros anfifílicosde SWNT
- Retire la electricidad estática de espátula desechable, microtubos de centrífuga, y SWNT de valores. En una campana de extracción, añadir 5 mg SWNT a 5 ml de solución de SC 2% (alternativamente, solución de SDS se puede utilizar).
- El uso de un ultrasonicador con punta 6 mm de diámetro, sonicar la solución durante 1 h en 40% de la amplitud en un baño de hielo.
- la muestra se centrifuga a 150.000 xg durante 4 h utilizando una ultracentrífuga y recoger cuidadosamente el sobrenadante.
- Disolver 1% en peso de polímero anfifílico (por ejemplo, RITC-PEG-RITC) en solución SC-SWNT.
- Se dializa la solución de polímero-SC-SWNT utilizando una membrana de diálisis 3,5 kDa contra 1 L de agua desionizada o tampón durante 5 días. Cambiar el agua o tampón después de horas y 2 horas 4. Una membrana de diálisis más grande puede ser usada, con tal de que permite la eliminación del agente tensioactivo de elección, pero la retención tanto de la SWNT y el polímero anfifílico.
- Medir la absorbancia solución a 632 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS para determinarconcentración aproximada de los nanotubos en suspensión utilizando ε = 0,036 L / cm * mg de acuerdo con la ley de Lambert-Beer y el factor de dilución apropiado.
3. Preparación de superficie inmovilizada Sensores SWNT
- Preparación de soluciones madre neutravidina BSA-biotina y
- Disolver 10 mg de liofilizado BSA-biotina en 1 ml de agua desionizada para preparar una solución de 10 mg ml / acción y se almacena a 4 ° C.
- Disolver 10 mg de proteína NeutrAvidin (NAV, desglicosilada proteína avidina) en 2 ml de agua desionizada para preparar una solución madre 5 mg / ml. almacenar alícuotas a -20 ° C. alícuotas descongeladas se pueden mantener durante varios días a 4 ° C.
- Preparar BSA-biotina portaobjetos de microscopio recubiertos
- Limpiar un portaobjetos de microscopio y vidrio de 0,17 mm de la cubierta (o según sea apropiado para el objetivo del microscopio) con agua desionizada, seguido de metanol, acetona y un enjuague final de agua desionizada.
- Añadir 100 ml de BSA-biotina solución madre de 900 l de tampón de 1x Tris a una concentración final de 1 mg / mL.
- De flujo 50 l de la solución de BSA-biotina en el canal pipeteando la solución en un extremo y con efecto de mecha de distancia solución en el otro usando un pañuelo de papel. Incubar durante 5 minutos, seguido de 3-5 rubores con 50 l de 0,1 M NaCl.
- Diluir 40 l de 5 mg / mL de stock NAV en 960 l de tampón 1x Tris a una concentración final de 0,2 mg / mL.
- De flujo 50 l de la solución de NAV en el canal pipeteando la solución en un extremo y con efecto de mecha de distancia solución en el otro usando un pañuelo de papel. Incubar durante 2-5 minutosseguido de 3-5 descargas con 50 l de 0,1 M NaCl.
- Diluir las soluciones madre de los SWNT en suspensión en tampón de formación de imágenes a una concentración de 1 a 10 mg / L y el flujo de 50 l de la solución en el canal y se incuba durante 5 min.
- Enjuague suavemente el exceso de distancia SWNT con 50 l de buffer de imágenes.
- Preparación de APTES silanizado portaobjetos de microscopio
NOTA: APTES silanizan portaobjetos permiten una manera de inmovilizar SWNT ADN envuelto con carga negativa a la superficie de un sustrato de vidrio.- Preparar una solución de 10% de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en etanol.
- El uso de canales realizados siguiendo los pasos descritos en el apartado 3.2.2, el flujo en 100 l de tampón de Tris 1x.
- Enjuague el canal con solución de APTES y se incuba durante 5 min. Lavar con 1 x tampón Tris.
- Diluir las soluciones madre de ADN-SWNT en suspensión en tampón de formación de imágenes a una concentración de 1 a 10 mg de flujo / Tierra 50 l de la solución en el canal y incubcomió durante 5 min.
- Enjuague suavemente el exceso de distancia SWNT con 50 l de buffer de imágenes.
4. espectroscopia de fluorescencia y microscopía de SWNT Sensores
- Nir microscopía de fluorescencia
- Realizar las imágenes de la superficie de los nanotubos inmovilizados por excitación láser y un microscopio invertido equipado con una serie de sensores de InGaAs para la imagen.
- Dirigir el rayo láser para entrar en el puerto de iluminación posterior de un microscopio invertido usando espejos en los montajes cinemáticos ajustables y un par de diafragmas con puestos montados fijados a la altura del puerto. Compruebe que el haz esté nivelada y recta mediante la confirmación de su paso por ambos iris cuando se coloca entre los espejos posteriores y antes de que entre en el puerto de iluminación. Si es necesario, ajuste la altura del haz usando un conjunto de periscopio. Quitar los filtros de calor de paso corto en el puerto de iluminación que atenuaría la viga.
- Inserte un cubo de filtro adecuado en el microscopiopara reflejar la luz de excitación en el objetivo y recoger la luz de emisión. Este consiste típicamente en un filtro de paso largo dicroico con un punto de corte por encima de la longitud de onda de excitación, (por ejemplo, 750 LP) y un filtro de paso largo de emisión (por ejemplo, 850 LP) para minimizar aún más la luz de excitación dispersa de golpear el sensor. Además, el filtro de emisión puede elegirse para que sea selectivo para la emisión de SWNT de una quiralidad particular.
- Realizar ajustes precisos en la alineación del haz mediante la inserción de un cubo de alineación apropiada reemplazando el objetivo con dos discos de compensación, esmerilado que contienen agujeros de 1 mm. Alinear el haz del centro de ambos los discos de alineación inferior y superior.
- Adjuntar un array sensor 2D InGaAs al puerto de imágenes lado del microscopio utilizando un adaptador apropiado y una lente 0.5X si es necesario para acomodar el tamaño del sensor.
- El uso de un 100X objetivo de inmersión en aceite (1,4 NA), aplique aceite de inmersión libre de la fluorescencia y colocar el immobilized muestra de SWNT en la platina del microscopio.
- Elevar el objetivo hasta que los contactos de aceite de la parte inferior de la cubierta de vidrio (# 1.5, 170 espesor m). Realizar ajustes en el cuello objetivo si es necesario para las condiciones de formación de imágenes, por ejemplo, temperatura, espesor del vidrio, etc.
- Lentamente levante el objetivo con la fuente de excitación y controlar en la señal de fluorescencia de la cámara InGaAs. La intensidad de fluorescencia debe aumentar gradualmente a medida que el plano focal se aproxima a la superficie y los sensores inmovilizados entrar en foco.
- Nir espectroscopia de fluorescencia
NOTA: La espectroscopia de fluorescencia se puede realizar utilizando la misma configuración de microscopio, pero por la dirección de la luz recogida fuera del cuerpo del microscopio y en un espectrómetro y InGaAs detector de matriz lineal.- El uso de montajes cinemáticos y espejos clasificados para Nir, dirigir la trayectoria de la luz hacia la rendija de entrada del espectrómetro. Enfocar la luz hacia abajo a un POInt en la entrada de hendidura utilizando una lente de enfoque (por ejemplo, plano-convexa, f = 150 mm). Esta alineación se logra mediante la atenuación de la potencia del láser a <1 mW y la sustitución del objetivo del microscopio con un espejo 1 "y el uso de un filtro de cubo divisor de haz 50/50. La luz de excitación y luego dejará el cuerpo del microscopio a través del orificio de salida y puede ser utilizado para ajustar los espejos y lente para enfocar el haz sobre la rendija de entrada.
- Después de reemplazar el objetivo del microscopio y el filtro de paso largo, colocar una placa en el escenario y registrar los espectros de una muestra de enfoque utilizando el espectrómetro y la matriz de InGaAs.
- Medición de la respuesta reversible de (GT) 15 ADN-SWNT a dopamina
- Montar el sensor recubierto canales más en la platina del microscopio y se analizan detalladamente utilizando un objetivo de aceite de 100X y la cámara InGaAs. Añadir 50 l de 100 mM solución dopamina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el canal de flujo y el registroel cambio en la intensidad de fluorescencia.
- Lavar la solución de dopamina utilizando solución salina tamponada con fosfato y observar el cambio en la fluorescencia de los sensores individuales SWNT.
- Detección de placa de pocillos para la respuesta de los sensores de analito SWNT
NOTA: Proyección de diferentes analitos se puede realizar utilizando una placa transparente controlada utilizando una platina motorizada. Una placa de ideal es transparente a la visible y de infrarrojos y tiene paredes laterales negras para minimizar la interferencia entre los pozos.- De pipeta volúmenes iguales de sensor SWNT suspendido (por ejemplo, 5 mg / L de concentración) en cada pocillo, lo suficiente para cubrir el fondo del pozo de manera uniforme, normalmente> 100 l para una placa de 96 pocillos y> 30 l para una placa de 384 pocillos .
- Analitos de pipeta (por ejemplo, 2 l, 100 mM volumen final) a partir del cribado de biblioteca en las placas. Preparar cada analito por triplicado para tener en cuenta el potencial acomodada así variación, fluctuationes de intensidad de excitación, o la temperatura.
- Elevar el objetivo (por ejemplo, 20X Achroplan, 0,45 NA) durante el seguimiento de los espectros de emisión utilizando el espectrómetro y matriz de InGaAs. posición óptima del objetivo pondrá el plano focal aproximadamente en la mitad del volumen de muestra en el pozo, que debe corresponder a un máximo en la intensidad medida.
- Para cada pocillo de muestra, la exposición grabar un 1-10 s para recoger un espectro.
- Comparación de los espectros de emisión para cada pocillo a un control que contiene sólo SWNT sin analito adicional para cuantificar la respuesta de fluorescencia.
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Representative Results
SWNT se suspendieron en solución acuosa utilizando ambos tensioactivos y polímeros anfifílicos por sonicación directa y por intercambio de diálisis. La Figura 1 muestra los nanotubos, que se cultiva utilizando el método catalizado carbonilo de hierro (HiPCO), suspendido usando SC, RITC-PEF20-RITC, y (GT) 15-DNA. La densidad óptica de un SWNT con SDS (o polímero) aumenta drásticamente después de la sonicación y disminuye después de la retirada de los agregados y contaminantes a través de la purificación por centrifugación (Figura 1). Las mediciones de absorbancia a 632 nm cuantificar la concentración de SWNT suspendida. 28
Las propiedades de las suspensiones photophysical SWNT se caracterizaron utilizando espectroscopia de fluorescencia y absorbancia. La Figura 2 muestra la absorbancia y la emisión de fluorescencia espectros de SWNT en suspensión usando (GT) 15-DNA y RITC-PEG20-RITC. The absorbancia espectros son una superposición de los picos de absorbancia individuales para cada quiralidad distinta de nanotubos presente en la muestra. Del mismo modo, cada quiralidad exhibe su pico de emisión de fluorescencia única. Las diferencias en la intensidad de pico de emisión relativa son el resultado de diferencias en la distribución de la población de quiralidades así como las diferencias en la eficiencia de la excitación con el láser de 721 nm.
La respuesta de fluorescencia de (GT) 15 ADN-SWNT (donde 0 es la intensidad inicial de fluorescencia SWNT y I es la intensidad SWNT después de la adición de dopamina) en presencia de diferentes concentraciones de dopamina se mide mediante el control de la fluorescencia de una muestra usando una espectrofotómetro y InGaAs disposición lineal (Figura 3). La fluorescencia total de (GT) 15-DNA-SWNT aumentado con el aumento de la concentración de dopamina (Figura 3a). La fluorescencia respuesta es una función del pico de emisión (Figura 3b), lo que indica que la respuesta puede ser quiralidad específico. La fluorescencia de la 1044 nm y 1078 nm picos de aumento en la intensidad de 2 veces como la concentración de dopamina se aproxima a 2 mM. La figura 3e muestra la intensidad de la totalidad de los espectros de emisión de PEG- (GT) 15 aumento DNA-SWNT en respuesta a la adición de la dopamina.
SWNT individuales recubiertas usando una secuencia de ADN alternativa, C 26 -ADN (preparado utilizando los mismos métodos en (GT) 15), sujetos a la superficie de un portaobjetos de microscopio se miden bajo iluminación láser utilizando una cámara InGaAs y 100X objetivo de inmersión en aceite (figura 4). Monitoreo de emisores individuales atados a una superficie se puede utilizar para verificar la reversibilidad de la respuesta del sensor por moléculas diana lavar utilizando solución tampón. Fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) microscopia también se puede usar para ADN colorante conjugado imagen adsorbido en los SWNT para cuantificar el número de moléculas de ADN unidas a cada tubo a través de experimentos de fotoblanqueo. La figura 4 muestra 3 eventos de blanqueamiento distintas de ADN marcado con Cy3 infiere a partir de las medidas cuantificadas de la traza de la intensidad de fluorescencia de un único emisor. Estos resultados indican que tres moléculas de ADN están unidos a la SWNT.
Figura 1: El polímero y surfactante Suspendido SWNT. (A) La fotografía de SWNT RITC-PEG20-RITC suspendido usando 2% SC en varios puntos de la preparación. Izquierda: SWNT añadirse directamente a la solución de Carolina del Sur antes de la sonicación. Centro: Después de 10 minutos de tratamiento con ultrasonidos de baño seguido por 10 min punta de la sonda de ultrasonidos con una amplitud de 90%, seguido de centrifugación. La densidad óptica de la solución aumenta a medida que SWNT paquetes sondispersado (~ 100 mg / L concentración SWNT). Derecha: Después de la diálisis con el polímero RITC-PEG20-RITC, la concentración final de RITC-PEG-RITC suspendido SWNT es de ~ 20 mg / L. (B) el rendimiento de SWNT suspensión puede variar dependiendo del polímero utilizado para suspender el SWNT. La densidad óptica de la solución proporciona una buena estimación de la concentración de SWNT en fase de solución. En la foto aparecen diferentes concentraciones de (GT) 15-ADN en suspensión tubos a diferentes concentraciones. De izquierda a derecha: 100 mg / L, 10 mg / L, 1 mg / L, 0 mg / L. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La absorción y espectros de emisión de fluorescencia de surfactante y el polímero suspendido SWNT. (A) la absorbancia sp Representanteectra de los nanotubos en suspensión usando (GT) 15-DNA mediante sonicación directa. La concentración de SWNT es 10 mg / L. Recuadro: La región UV del espectro de absorbancia muestra la característica de pico de absorbancia del ADN a 260 nm. (B) Absorbancia espectros de RITC-PEG20-RITC SWNT después del intercambio de SC por diálisis. Recuadro: La absorbancia de una muestra diluida 10x de SWNT RITC-PEG-RITC muestra la absorbancia característica de rodamina. (C) los espectros de emisión NIR Representante de los nanotubos en suspensión usando (GT) 15-DNA mediante sonicación directa (785 nm de excitación). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Detección de fluorescencia de la dopamina usando (GT) 15-DNA SWNT envueltos. (a strong>) la respuesta de fluorescencia de (GT) 15-DNA SWNT envueltos a la adición de dopamina. Las muestras de los sensores a una concentración de 5 mg / L estaban emocionados utilizando un 500 mW, 721 nm láser CW. La fluorescencia integrada de emisión de los sensores de 900-1.350 nm aumenta con la concentración de dopamina añadido 1 M a 250 mM. (B) los espectros de emisión de fluorescencia de PEG (GT) 15-DNA envuelta SWNT antes y después de la adición de la dopamina. La concentración de sensor es ml al que la dopamina se añadió 10 mg / hasta una concentración final de 100 mM. Las muestras se excitaron usando un 500 mW, 721 nm láser de CW. Los dos picos de mayor intensidad aproximadamente el doble de la intensidad después de la adición de la dopamina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4: imágenes de fluorescencia de los nanotubos individuales superficie inmovilizada. (A) La emisión de fluorescencia del individuo C 26-DNA-SWNT (flechas rojas) inmovilizado sobre una hoja de cubierta de sílice (# 1.5) usando un procedimiento de silanización APTES y la imagen utilizando una matriz de sensores 2D InGaAs, microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite 100X ( apocromático plan, 1,4 NA), y un 500 mW, 721 nm láser de CW. (B) el experimento de blanqueo de fluorescencia de C 26 -Cy3 ADN-SWNT atado a una superficie utilizando APTES. Las hebras de ADN son 3 'marcado terminalmente con Cy3 antes de la suspensión tubo. El seguimiento de la photobleaching paso a paso incremental (rastro rojo entallada) de sensores individuales se utiliza para determinar el número de moléculas de ADN adsorbidos en la superficie de los SWNT. Las imágenes fueron adquiridas mediante un microscopio invertido en el modo TIRF con un objetivo de inmersión en aceite 100X (Apocromático plan, 1,4 NA), y 561 nm de excitación láser. Barra de escala: 10 micras.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
SWNT se suspenden fácilmente en solución acuosa a través de sonicación directa con SDS o ssDNA, como se indica por un aumento en la densidad óptica proporcionada por la dispersión coloidal del híbrido SWNT-polímero resultante. SDS y ssDNA dispersa y solubiliza haces de SWNT por adsorción sobre la superficie de SWNT a través de interacciones hidrofóbicas o pi-pi. Adicionalmente, otros polímeros, tales como ADN genómico, polímeros anfifílicos, polímeros conjugados y los lípidos, pueden ser adsorbidos sobre la superficie de SWNT por diálisis de muestras en suspensión usando SC o SDS. Los polímeros hidrofílicos, tales como PEG, se pueden terminar-modificados con "anclas" hidrófobos tales como RITC o FITC para permitir la adsorción superficial del copolímero de bloques. Para los polímeros que son susceptibles a la degradación de cizallamiento o después de la exposición a las altas potencias de sonicación con sonda de punta, o de polímeros con bajas afinidades de unión a SWNT, la diálisis es el mejor método para producir una suspensión de SWNT-polímero estable. Tras encaps polímeroulación, centrifugación elimina grandes haces de SWNT, carbono amorfo, catalizador de metal residual y otros contaminantes insolubles a dejar una muestra uniformemente dispersada. concentraciones finales típicos de los nanotubos dispersados después de centrifugación rango entre 10-100 mg / L.
La sonicación de potencia y la duración se puede ajustar y optimizar para la elección particular de dispersante. Este es un paso crítico en el procedimiento de los nanotubos de recubrimiento debido a demasiado poco o débil sonicación puede resultar en un pobre dispersión, mientras que sonicación demasiado o demasiado poderoso puede conducir a una mala fluorescencia. Típicamente, potencias inferiores son necesarias para minimizar el daño al utilizar polímeros sensibles al cizallamiento tal como el ADN. Más largas duraciones de sonicación o intensidades más altas pueden conducir a la reducción de la longitud de los nanotubos, donde SWNT por debajo de la longitud de la recombinación de excitones nm ~ 100 se convierten en no fluorescente. El tamaño de la punta de la sonda de ultrasonidos también debe coincidir con el volumen de la muestra para evitar salpicaduras y formación de espuma para una óptimaresultados (normalmente proporcionado por el fabricante). Evitar tocar la punta de la sonda a los lados del recipiente y colocar la solución en un bloque de hielo para minimizar el calentamiento de la solución. Una vez dispersado, soluciones de SWNT son estables a temperatura ambiente indefinidamente.
La absorbancia y espectros de emisión de las soluciones de SWNT generados dispersos contienen múltiples picos, lo que indica la presencia de una mezcla de SWNT dispersas de diferentes quiralidades. Los métodos alternativos de generación de purificación o métodos SWNT pueden cambiar la distribución de quiralidad, dando lugar a diferentes excitación máxima y espectros de emisión de fluorescencia. Además, los diferentes métodos de síntesis se pueden producir muestras de los nanotubos con diferentes distribuciones de la población quiralidad. Por ejemplo: ComoCat (catalizador de cobalto-molibdeno) SWNT cultivadas son ricos en (6,5) quiralidad, mientras que los SWNT HiPCO (alta presión con catalizador de carbonilo de hierro) obtenidas son ricos en (7,6) quiralidad, lo que conduce a diferencias en la absorción y photLos espectros oluminescence.
Ciertos polímeros adsorbidos permiten la detección específica de analitos mediante la modulación de la emisión de fluorescencia de la SWNT cambiando el medio ambiente local en la superficie del tubo. Este enfoque ofrece la ventaja distinta sobre la unión covalente de restos de unión al no interrumpir de forma permanente la red SWNT, que puede reducir la intensidad de emisión de fluorescencia. 6,32 - 34 Además, el enfoque CoPhMoRe tiene el potencial para el desarrollo de sensores libre de anticuerpos para los objetivos en los que no pueden existir ya un resto de unión conocido. 28 Específicamente, (GT) 15-ADN se ha demostrado para mejorar selectivamente la emisión de fluorescencia de SWNT en la presencia de la dopamina, lo que permite su uso como un sensor de la dopamina. mediciones de fluorescencia a granel muestran un aumento de hasta el 80% en la emisión de pico para ciertos quiralidades SWNT. Inmovilizante (GT) 15-DNA SWNT sobre un portaobjetos de vidrio permite resp fluorescenciamediciones Onse de individuo (GT) 15 -ADN funcionalizado SWNT, mostrando que la fluorescencia puede aumentar en más de 3 veces para sensores SWNT individuales en la presencia de la dopamina, sin ningún photobleaching apreciable, bajo iluminación láser continuo. La interacción entre la dopamina y el sensor de SWNT es reversible, como es evidente por la recuperación de la señal fluorescente original después de lavar la dopamina fuera de la cámara de microfluidos con tampón. Además, las mediciones de una sola molécula pueden ser una poderosa técnica de caracterización para la cuantificación de la adsorción del polímero (Figura 4) o la cinética de eventos de unión. Además, la detección radiométrica puede lograrse aislando químicamente una quiralidad SWNT singular, con un pico de emisión de excitación única, funcionalización con (GT) 15-ADN, y aislar un segundo quiralidad SWNT a ser insensible a la dopamina. Monitoreo ambos quiralidades SWNT proporciona un canal de control de la fluorescencia constante que puede ser comparado con el m odulating fluorescencia de las (GT) 15-DNA SWNT. La combinación de polímeros diferentes (por ejemplo, polietilenglicol y (GT) 15-ADN) puede agregar funcionalidad adicional, como la modificación de las características de difusividad o de la absorción celular, propiedades que son críticos cuando se realizan experimentos in vivo.
Actualmente, una limitación del enfoque CoPhMoRe al sensor de desarrollo incluyen el desarrollo de bibliotecas de polímero. Debido a restos de unión no se conocen a priori, el desarrollo de un sensor para un objetivo particular, puede llevar mucho tiempo y requieren un gran número de polímeros químicamente variados para la construcción de la biblioteca de sensor para la detección. Además, la estabilidad y la compatibilidad de los sensores en entornos en vivo puede variar de un sensor a otro. Sin embargo, una vez que un sensor candidato ha sido identificado, más estrategias de modificación se pueden emplear para optimizar las propiedades como sea necesario para aplicaciones en vivo.
ve_content "> Aquí, hemos demostrado una metodología para la dispersión de los SWNT en soluciones acuosas aplicables a una amplia variedad de agentes de dispersión. Este enfoque se puede utilizar para crear bibliotecas de SWNT dispersos para el descubrimiento de nuevos nuevos sensores NIR para pequeñas moléculas y marcadores biológicos . de particular interés son los sensores para la detección de neurotransmisores, lo que podría permitir a tiempo real, espacialmente detección precisa de estas moléculas en entornos biológicos complejos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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