Introduction
단층 카본 나노 튜브 (SWNT로)를 원자 적으로 탄소수 박층 고유 전자 및 광학 특성을 나타내는 길고 얇은 실린더로 압연된다. 1 이러한 특성은 지역 환경에 매우 민감 여기자 재조합을 통해 근적외선 (NIR) 형광 방출을 생산하는 밴드 갭을 포함한다. 단일 벽 탄소 나노 튜브의 근적외선 발광 광의 관통 깊이가 생체 조직에 대한 최대 인 근적외선 윈도우 내에. , SWNT 전시 큰 스톡스 이동 photobleach하지 않으며, 깜박하지 않습니다 : 2,3는 또한 단일 벽 탄소 나노 튜브는 유기 형광 달리 비정형 몇 가지 독특한 특징을 나타낸다. 4 최근, 이러한 특성을 활용하는 생물학에 응용 프로그램과 새로운 분자 센서의 구색의 개발을 주도하고있다. 5,6- 미 변성 그러나, 단일 벽 탄소 나노 튜브는 물에 불용성이며, 개별 단일 벽 탄소 나노 튜브의 현탁액을 얻는 것이 어려울 수있다. 7, 8 BundliNG 및 솔루션의 단일 벽 탄소 나노 튜브의 응집이 감지 애플리케이션에 적합을 렌더링 자신의 밴드 갭 형광, 2를 당황하게 할 수 있습니다.
수용액 중에서 개개의 탄소 나노 튜브를 분산하는 것은 소수성 구동 응집을 방지하기 위해 그 표면을 수정이 필요하다. 공유 변형의 SWNT를 수용성 10 렌더링뿐만 아니라 화학 특이 적 결합을 부여 할 수 있지만 9 SWNT 격자의 결함 부위를 감소 또는 형광 방출을 경감. 소수성 및 PI-PI 스태킹 상호 작용을 통해 나노 튜브 표면에 흡착 13 - 대신 SWNT 기능화 계면 활성제, 지질, 폴리머 및 9,11 DNA를 사용하여 달성 될 수있다. 표면 작용 화 된 단일 벽 탄소 나노 튜브를 둘러싼 얻어진 화학적 환경의 코로나 단계로 지칭된다. 코로나 위상 섭동은 불소 SWNT하는 변조를 일으키는 나노 튜브 표면 상에 여기자 이동에 큰 영향을 미칠 수있다방출을 escence. 이 코로나 위상 SWNT의 큰 표면적 상에 특이 적 결합 양상을 통합하여 새로운 분자 센서를 개발하는 데 이용 될 수 SWNT 형광 간의 중요한 관계이다. 분석 물을 결합시 SWNT 코로나 위상 섭동은 로컬 유전체 환경의 변화로 이어질 전하 전송 또는 신호 전달기구로 사용하기 위해 단일 벽 탄소 나노 튜브의 형광 방출을 조절할 수 모두의 격자 결함을 도입 할 수있다. (14)이 방법은 DNA 분자를 포함한 다양한 종류의 검출, 15, 16 17 글루코스 및 ATP와 같은 작은 분자에 대한 신규 한 형광 센서의 개발에 사용되는 18 반응성 산소 종 (19) 및 산화 질소. (20, 21) 그러나, 이러한 접근법들은 표적 피검위한 공지 결합 양상의 존재에 의존하는 것을 제한한다.
최근,보다 일반적인 응용 프로그램형광 센서를 설계에 바퀴벌레가 아닌 공유 양친 heteropolymers, 인지질 및 다핵 산으로 기능화 된 단일 벽 탄소 나노 튜브를 사용하여 개발되었다. 특히 단백질의 26, 27 또는 신경 전달 물질 도파민을 포함한 소형 분자를 결합 할 수있는 독특한 코로나 단계 25 - 이들 분자는 개별 단일 벽 탄소 나노 튜브 (22)의 매우 안정한 현탁액을 생성하기 위해 탄소 나노 튜브 표면에 흡착. 28-30 공학의 SWNT와 특이 적으로 결합 분석 대상 물질을 분산시키는 코로나 상으로서 코로나 위상 분자 인식 (CoPhMoRe)이라한다. (28) 작은 크기, 낮은 독성, 높은 안정성 및 CoPhMoRe SWNT 센서의 unbleaching 근적외선 형광 그들에게 오랜 시간 해결 측정을위한 생체 감지를위한 우수한 후보자를합니다. (6) 최근 연구 반응성 질소와 산소 종의 광학 검출을위한 식물 조직에서 응용 프로그램을 보여 주었다. (31)이러한 전기 화학적 검출 또는 면역 조직 화학 염색과 같은 다른 기술, 공간 해상도, 시간 해상도 및 특이성의 부족으로 고통 곳 CoPhMoRe SWNT 센서 특히 흥미로운 응용 프로그램은 생체 내에서 도파민과 같은 신경 전달 물질의 라벨없는 검출에 대한 가능성이다.
디자인 및 발견 CoPhMoRe SWNT 센서는 지금까지 특정 대상을위한 센서를 찾을 가능성을 제한 분산제 라이브러리의 크기, 화학적 다양성을 억제하고있다. 지금까지 연구에만 사용할 복합, 공동 블록, 생물학적, SWNT 센서에 대한 기능적 활성 분산제를 제공 할 수 생체 모방 고분자의 표면을 긁어있다. 여기, 우리는 모두 단일 벽 탄소 나노 튜브를 분산과 높은 처리량 검사 및 단일 SWNT 센서 분석을 위해 자신의 형광을 특성화하기위한 다른 방법을 제시한다. 구체적으로, 우리는 다핵 산 oligom와 코팅의 SWNT 절차 개요ERS 투석에 의해 계면 활성제 교환을 통해 양친 매성 고분자와 단일 벽 탄소 나노 튜브를 기능화하는 방법뿐만 아니라 직접 초음파를 사용하여. 우리는 예로서 로다 민 이소 티오 시아 네이트 (RITC-PEG-RITC)와 작용 (GT) 15 -DNA 및 폴리에틸렌 글리콜을 사용합니다. 우리는 도파민 검출 용 센서로서 CoPhMoRe (GT) 15 -DNA 벽 탄소 나노 튜브의 사용을 입증한다. 마지막으로, 특성 또는 단일 분자 검출에 사용할 수있는 단일 분자 센서 측정을 수행하는 과정을 설명합니다.
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Protocol
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하십시오. 나노 물질은 벌크 재료 대응에 비해 추가적인 위험이있을 수 있습니다. 공학적 관리 (흄 후드, 소음 인클로저) 및 개인 보호 장비를 포함한 모든 적절한 안전 관행 사용 (안전 안경, 고글, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발).
버퍼, 계면 활성제 및 폴리머 솔루션 1. 준비
- 100 mM의 NaCl 용액의 제조
- 탈 이온수 80 mL에 염화나트륨 584 mg을 녹이고. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다.
- 3 % 나트륨 도데 실 설페이트의 제조 (SDS) 용액
- 탈 이온수 80 mL의 SDS의 3g을 녹인다. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다.
- 2 % 소듐 콜레이트의 제조 (SC) 용액
- 잔디의 2g을 녹여IUM 탈 이온수 80 ml에 수화물 콜레이트. 100 mL의 총 부피를 가지고 탈 이온수를 추가합니다.
- 촬상 완충액의 제조 (1X 트리스 20 mM의 트리스, 100 mM의 NaCl)
- 트리스 염기 22.23 g 및 자기 교반 막대 및 플레이트를 이용하여 탈 이온수 500 ㎖의 염화나트륨 58.44 g을 녹인다.
- 8.1의 pH에 도달 할 때까지 진한 HCl을 조심스럽게 추가한다.
- L. 한 최종 부피에 도달하기 위해, 탈 이온수를 추가
- RITC-PEG-RITC 중합체의 합성
- 디클로로 메탄 및 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 1 : 1 혼합물 1 1 ㎖ 아민 difunctionalized 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (5 kDa의 20 kDa의 0.1 몰 / L) 및 로다 민 이소 티오 시아 네이트 (RITC 0.2 몰 / L)을 녹인다.
- 0.2 몰의 N / L, N의 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA)를 추가합니다.
- 3 시간 후, 감압 여과 한 다음, 디 에틸 에테르의 10 배 부피의 침전.
- DMF에 재용 에테르 침전 FOLLO을 반복진공 여과에 의해 결부.
참고 : 동일한 방법을 사용하여 다른 이소 티오 시아 네이트 개질 된 분자 (예를 들면, 형광 염료, FITC)는 PEG 또는 다른 아민 변성 중합체에 부착 될 수있다.
- 페 길화-DNA의 조제 (PEG-DNA)
- 100 트리스 (2- 카르복시 에틸) 44.9 μL와 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP) 용액 (0.5 M, pH를 7.0)의 μL 5'- 티올 - 개질 된 DNA (1 밀리그램 / 0.1 M NaCl을 10 μL) 및 4.855 mL의 추가 겸용 탈 이온수.
- 1 시간 동안 교반한다.
- 인산염 완충 염수 5 mL에 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이 미드 500 mg을 녹인다.
- DNA와 PEG 용액 (10 ㎖ 총)을 합하여 24 시간 동안 교반한다.
단일 벽 탄소 나노 튜브 (SWNT를) 정학 2. 준비
- 단일 벽 탄소 나노 튜브의 세척은 촉매 및 불순물을 제거합니다.
- 플라스틱 원심 분리기 튜브 접점에 씻지 단일 벽 탄소 나노 튜브의 200 ~ 300 mg을 추가탈 이온수 45 mL의 ining.
- 소용돌이 2 분간 초음파 처리하고 5 분 동안 욕조 초음파 처리기를 사용하는 용액. 설정이 악기 악기에서 변화가 초음파기를 참고하기 때문에 단일 벽 탄소 나노 튜브가 분산되고 있음을 보장하기 위해 단일 벽 탄소 나노 튜브 용액 증가의 광학 밀도 (즉, 검게) 있는지 확인합니다.
- 16,100 XG에서 20 분에 대한 솔루션을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
- 신선한 탈 이온수의 약 45 ML을 추가합니다.
- 단계를 반복 2.1.2-2.1.4 8 배까지.
- 수는 펠렛 단일 벽 탄소 나노 튜브를 방해하고 공기 건조에 SWNT 펠렛을 허용하지 않도록주의만큼 물을 제거합니다.
- 단일 벽 탄소 나노 튜브의 현탁액 핵산
- 100 ㎎ / ㎖의 농도로 0.1 M의 NaCl에서의 핵산 (NA)를 녹인다.
- 정전기 방지 건을 사용 일회용 주걱, 마이크로 원심 튜브 및 SWNT의 재고에서 정전기를 제거합니다. 흄 후드에서 0 980 μL로 NA 용액 20 μL를 추가0.1 M NaCl을 1 mg을 단일 벽 탄소 나노 튜브를 첨가 하였다.
- 3mm 직경의 팁과 함께 초음파를 사용하여, 빙 냉하 40 % 진폭에서 10 분 동안 상기 용액을 초음파 처리.
- g X 16,100에서 90 분 동안 두 번 DNA-SWNT 솔루션을 원심 분리기. PEG-DNA를 사용하는 경우, 100 kDa의 스핀 필터를 사용하여 초과 및 미 반응 DNA와 PEG를 정화. 1.5 분 동안 9,300 XG에 스핀 필터와 스핀을 채우기이 세척 단계를 3 번 반복하기에 충분한 PBS를 추가합니다.
- 수집 및 CNT 번들 집계를 포함하는 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 유지합니다. 나노 물질에 대한 적절한 제도적 유해 폐기물의 절차에 따라 펠렛을 폐기하십시오.
- 램버트 - 비어의 법칙 및 적절한 희석 인자에 따라 ε = 0.036 L / cm · 정제 법 현탁 SWNT를 대략적인 농도를 결정하기 위해 UV / 비스 분광 광도계를 사용하여 632 nm에서의 용액의 흡광도를 측정한다.
- 양친 매성 고분자 현탁액단일 벽 탄소 나노 튜브의
- 일회용 주걱, 마이크로 원심 분리기 튜브 및 SWNT의 재고에서 정전기를 제거합니다. 흄 후드에서 2 % SC 용액 5 ㎖에 5 mg을 단일 벽 탄소 나노 튜브를 추가 (또는, SDS 용액을 사용할 수있다).
- 6mm 직경의 팁과 함께 초음파를 사용하여, 빙 냉하 40 % 진폭에서 1 시간 동안 용액을 초음파 처리.
- 초 원심 분리기를 사용하여 조심스럽게 상층 액을 수집 4 시간 동안 150,000 XG에 원심 분리기 샘플.
- (예를 들어, RITC-PEG-RITC) SC-SWNT 용액 양친 성 고분자의 1 중량 %를 용해.
- 탈 이온수 1 L에 대해 3.5 kDa의 투석막을 이용하여 중합체 - SC-SWNT 용액을 투석 또는 5 일 동안 버퍼. 물을 변경할 정도로 그것이 선택의 계면 활성제의 제거를 허용하는, 시간 2 시간 4 클수록 투석막이 사용될 수 후 버퍼 있지만 SWNT 및 양친 성 중합체 모두 보존.
- 결정하기 위해 UV / 비스 분광 광도계를 사용하여 632 nm에서의 용액의 흡광도를 측정램버트 - 비어의 법칙과 적절한 희석 배수에 따라 ε = 0.036 L / cm * mg의 사용 중단 단일 벽 탄소 나노 튜브의 대략적인 농도.
표면 고정화 SWNT 센서 3. 준비
- BSA - 비오틴과 뉴트라 비딘의 재고 솔루션의 준비
- 4 ° C에서 10 ㎎ / ㎖ 원액 저장을 1 mL의 탈 이온수에 10 mg의 동결 건조 BSA - 비오틴을 녹인다.
- 5 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 탈 이온수 2 ml에 10 mg의 비딘 단백질 (NAV 아비딘 탈글 라이코 실화 된 단백질)을 녹인다. -20 ° C에서 보관 씩. 해동 된 분액을 4 ℃에서 수 일 동안 유지 될 수있다.
- BSA - 비오틴 코팅 현미경 슬라이드를 준비합니다
- 메탄올, 아세톤 및 탈 이온수의 최종 린스 현미경 슬라이드 및 탈 이온수 0.17 mm 용 커버 유리 (또는 현미경 대물 대한 적절한)을 청소한다.
- 1 mg / ml의 최종 농도를 900 μL의 1X 트리스 완충액에 BSA 비오틴 스톡 용액 100 μL를 추가한다.
- 한쪽 끝으로 솔루션을 피펫 팅과 조직을 사용하여 다른에서 솔루션을 멀리 심지하여 채널에 BSA - 비오틴 용액 50 μL 흐름. 0.1 M NaCl을 50 μL로 3-5 플러시 다음 5 분 동안 품어.
- 0.2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 960 μL 1X 트리스 완충액에 5 ㎎ / ㎖ 스톡 NAV 40 μL 희석.
- 일단 부에 상기 용액을 피펫 팅하여 조직을 사용하여 다른에서 용액을 얻어 위킹에 의해 상기 채널에 NAV 용액 50 μL를 흐른다. 2-5분 품어0.1 M NaCl을 50 μL 3-5 플러시 하였다.
- 1-10 ㎎ / ℓ의 농도로 촬상 완충액의 SWNT의 원액을 희석하고, 채널 내로 용액 50 μL를 흐르게하고 5 분 동안 배양한다.
- 부드럽게 이미지 버퍼의 50 μL를 사용하여 여분의 단일 벽 탄소 나노 튜브를 멀리 씻어.
- APTES 실란 현미경 슬라이드의 준비
주 : APTES는 슬라이드 방식이 유리 기판의 표면에 음전하 DNA 감싸 벽 탄소 나노 튜브를 고정 할 수 있도록 실란 화.- 에탄올 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES)의 10 % 용액을 제조 하였다.
- 3.2.2에 설명 된 단계를 사용하여 만든 채널을 사용하여, 100 μL 1 배의 트리스 버퍼에 흐른다.
- APTES 솔루션 채널을 세척하고 5 분 동안 품어. 1X 트리스 버퍼로 씻으십시오.
- 1-10 밀리그램 / 랜드 흐름의 농도 채널 incub로 용액 50 μL로 촬상 완충액 DNA-SWNT로의 원액을 희석5 분 동안 먹었다.
- 부드럽게 이미지 버퍼의 50 μL를 사용하여 여분의 단일 벽 탄소 나노 튜브를 멀리 씻어.
4. 형광 분광학 및 단일 벽 탄소 나노 튜브 센서의 현미경
- NIR 형광 현미경
- 레이저 여기 및 이미징을위한 InGaAs로 센서 어레이와 복을 거꾸로 현미경을 이용하여 표면에 고정 된 단일 벽 탄소 나노 튜브의 이미징을 수행합니다.
- 조정기구 학적 마운트에 거울 포트 높이로 설정 후 장착 홍채의 쌍을 이용하여 역 현미경의 후면 조명 포트에 입력되는 레이저 빔을 지향. 빔이 수준 확인 및 후속 거울 사이가 조명 포트에 들어가기 전에 둘 때 바로 확인하여 두 붓꽃을 통과한다. 필요한 경우, 잠망경 조립체를 사용하여 빔의 높이를 조정한다. 빔을 감쇠 것이다 조명 포트에 어떤 짧은 패스 열 필터를 제거합니다.
- 현미경으로 적절한 필터 큐브를 삽입목적에 여기 광을 반사 및 방출 빛을 수집합니다. 이것은 일반적으로 여기 파장 상기 절단 (예, 750 LP) 및 상기 센서 타격로부터 산란 된 여기 광을 최소화하기 위해 배출 긴 통과 필터 (예를 들어, 850 LP)와 이색 긴 통과 필터로 구성된다. 또한, 배출 필터는 특정 키랄성의 SWNT의 발광을위한 선택적으로 선택 될 수있다.
- 1mm의 작은 구멍을 포함하는 두 개의 오프셋 젖 디스크 대물 교체 적절한 정렬 큐브를 삽입하여 광 배향 미세 조정을 수행한다. 두 하부 및 상부 배향막의 디스크의 중심으로 빔을 맞추고.
- 센서의 크기를 수용하기 위해 필요하면 적절한 어댑터 및 0.5X 렌즈를 사용 현미경 측 촬상 포트 차원의 InGaAs 센서 어레이를 부착.
- 100X 오일 침지 대물 (NA 1.4)를 사용하여 형광이없는 침지 오일을 적용하고 immobi 배치현미경 단계에 진입하게 안정적 SWNT 샘플.
- 오일에 접촉 할 때까지 상기 커버 유리의 바닥 (# 1.5, 170 ㎛의 두께)를 목적으로 상향한다. 촬상 조건, 예를 들면, 온도, 유리 두께 등 대물 칼라 조정 필요합니다
- 천천히에 여진 원과 목적을 올리고 InGaAs로 카메라의 형광 신호를 모니터링한다. 초점면이 표면에 접근하고 고정 된 센서는 초점이 같은 형광 강도가 점차 증가 할 전망이다.
- NIR 형광 분광학
참고 : 형광 분광법은 같은 현미경 설정을 사용하여 수행하지만, 현미경 몸 밖으로와 분광계와의 InGaAs 선형 배열 검출기로 수집 된 빛을 연출하여 할 수 있습니다.- NIR 정격 학적 마운트와 거울을 사용하여, 분광기의 입구 슬릿쪽으로 광로를 지시. 관심 장소에 빛을 초점입구는 집광 렌즈를 이용하여 NT 슬릿 상 (예를 들면, 평 볼록, F = 150mm). 이 배향은 <1 mW의 레이저 파워를 감쇠 및 1 "거울 현미경 대물 렌즈를 교체하고, 50/50 빔 분할 필터 큐브를 사용하여 달성된다. 여기 광은 출구 포트를 통해 현미경 본체 떠날 수 것 입구 슬릿에 상기 빔을 포커스하는 거울 및 렌즈를 조절하기 위해 사용되는.
- 현미경 대물 긴 통과 필터를 교체 한 후, 스테이지 상에 웰 플레이트를 배치하고, 분광기 및 InGaAs로 어레이를 이용한 합초 샘플의 스펙트럼을 기록한다.
- 도파민에 (GT) 15 DNA-단일 벽 탄소 나노 튜브의 가역 반응을 측정
- 마운트 센서 현미경 스테이지로 채널을 코팅 및 100X 대물 오일 및 InGaAs로 카메라를 이용하여 초점 가져온다. 유동 채널 레코드로 포스페이트 완충 염수 100 μM 도파민 용액 (PBS)의 50 μL를 추가형광 강도의 변화.
- 인산염 완충 생리 식염수를 사용하여 도파민 솔루션을 씻어 내고 개별 SWNT 센서의 형광의 변화를 관찰한다.
- 단일 벽 탄소 나노 튜브 센서의 분석 응답을 잘 플레이트 심사
주의 : 다른 분석 물질의 스크리닝이 전동 스테이지를 사용하여 제어 투명 웰 플레이트를 사용하여 수행 될 수있다. 이상적인 잘 판 표시 및 IR에 투명하고 우물 사이의 크로스 토크를 최소화하기 위해 검은 측벽이 있습니다.- 일시 중단 된 SWNT 센서 (예를 들어, 5 ㎎ / ℓ 농도) 각 웰, 충분한으로는 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에 대해 잘 균일하게, 일반적으로> 100 μL의 바닥> 30 μL 다루의 피펫 동일한 볼륨 .
- 피펫 분석 (예를 들어, 2 μL, 100 μM 최종 부피)를 웰 플레이트에 라이브러리를 스크리닝에서. 잠재적 잘 - 투 - 잘 변화, fluctuat을 고려하여 세중의 각 분석 준비여기 강도, 또는 온도의 이온.
- 대물 상향 (예를 들어, 20X achroplan 0.45 NA) 분광계 및 InGaAs로 어레이를 이용한 방출 스펙트럼을 보면서. 대물 최적 위치 측정 강도의 최대 값과 일치해야 웰에서 샘플 볼륨의 중앙에 대략 초점 평면을 둘 것이다.
- 각 샘플 웰의 경우, 스펙트럼을 수집 1-10의 노출을 기록한다.
- 형광 반응을 정량화하기 위해 추가 분석 물없이 단지 단일 벽 탄소 나노 튜브를 함유하는 제어를 각 웰에 대한 발광 스펙트럼을 비교한다.
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Representative Results
단일 벽 탄소 나노 튜브는 계면 활성제 및 직접 초음파에 의해 투석 교환에 의한 양친 성 고분자를 모두 사용하는 수용액에 현탁시켰다. 도 1은 SC, RITC-PEF20-RITC를 사용하여 현탁 철 카르 보닐 촉매 법 (HiPCO)를 이용하여 성장하고, 단일 벽 탄소 나노 튜브를 도시한다 (GT) 15 -DNA. SDS (또는 폴리머)와 단일 벽 탄소 나노 튜브의 광학 밀도는 초음파 처리 후에 급격히 증가하고, 원심 분리로 정제를 통해 집계 및 오염물을 제거 (도 1)에 따라 감소한다. 현탁 SWNT의 농도를 정량 632 nm의 흡광도를 측정. (28)
단일 벽 탄소 나노 튜브 현탁액의 광 물리 특성은 흡수 및 형광 분광법을 사용하여 특징이다. 그림 2 (GT) 15 -DNA와 RITC-PEG20-RITC를 사용 중지 단일 벽 탄소 나노 튜브의 흡수 및 형광 방출 스펙트럼을 보여줍니다. 일전자 흡수 스펙트럼은 샘플에서 본 나노 튜브의 각각의 별개의 키랄성은 개별 흡광도 피크의 중첩이다. 유사하게, 각각 키랄성는 독특한 형광 발광 피크를 나타낸다. 상대 발광 피크 강도의 차이는 721 nm의 레이저를 사용하여 여기 효율의 인구 랄리의 분포뿐만 아니라, 차의 차이의 결과이다.
(I 0은 초기 SWNT 형광 강도이며, I는 도파민을 첨가 한 후, SWNT 강도 임)을 이용하여 샘플의 형광을 모니터링함으로써 측정된다 도파민의 다양한 농도의 존재 (GT) (15) DNA-의 SWNT의 형광 반응 분광 광도계와의 InGaAs 선형 배열 (그림 3). (GT) 15 -DNA-SWNT를 증가 도파민 농도 증가 (도 3a)의 합계 형광. 형광 R응답이 키랄성 특정 될 수 있음을 나타내는 저 응답의 발광 피크의 함수를이다 (도 3b). 도파민 농도가 2 μM에 접근 강도 2 배 증가 봉우리 나노 다음은 1044 나노 미터의 형광 및 1078. 도 3e는 도파민의 첨가에 응답하여 PEG- (GT) (15) DNA-SWNT 증가 전체 방출 스펙트럼의 세기를 나타낸다.
다른 DNA 서열을 사용하여 코팅 개별 단일 벽 탄소 나노 튜브는 C 26 -DNA 현미경 슬라이드의 표면에 닿는 ((GT) (15)에서와 동일한 방법을 이용하여 제조)의 InGaAs로 카메라와 100X 오일 침지 목적을 이용한 레이저 조사에서 측정된다 (도 4). 표면에 닿는 단일 이미 터를 모니터링하는 거리 완충 용액을 사용하여 세정 대상 분자 센서 응답의 가역성을 확인하는데 사용될 수있다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 마이크로복사는 photobleaching에 실험을 통해 각각의 튜브에 부착 된 DNA 분자의 수를 정량화하기 위해 단일 벽 탄소 나노 튜브에 흡착 화상 염료 공액 DNA로 사용할 수있다. 도 4는 Cy3가 표지 된 DNA의 3 구분 백화 현상은 단일 이미 터의 형광 강도 파형의 양자화 된 단계에서 유추 나타낸다. 이 결과는 세 개의 DNA 분자가 SWNT에 부착 된 것을 나타낸다.
그림 1 : 폴리머와 계면 활성제는 단일 벽 탄소 나노 튜브를당했습니다. 준비의 여러 지점에서 2 % SC를 사용 중지 RITC-PEG20-RITC의 단일 벽 탄소 나노 튜브의 (a)에 사진. 왼쪽 : 단일 벽 탄소 나노 튜브 전에 초음파로 SC 용액에 직접 첨가. 센터 : 욕조 초음파 10 분간 원심 분리 한 다음 90 % 진폭으로 10 분간 프로브 팁 초음파 처리 하였다 후. 용액의 광학 밀도는 단일 벽 탄소 나노 튜브 번들만큼 증가분산 (~ 100 ㎎ / ℓ SWNT 농도). 오른쪽 : RITC-PEG20-RITC 폴리머와 투석, RITC-PEG-RITC의 최종 농도는 단일 벽 탄소 나노 튜브를 중단 한 후 20 ㎎ / ℓ ~입니다. (b)는 SWNT 서스펜션 수율은 SWNT를 일시 중단하는 데 사용되는 고분자에 따라 달라질 수 있습니다. 용액의 광학 밀도는 용액 상 SWNT 농도의 양호한 추정치를 제공한다. 서로 다른 농도의 사진입니다 (GT) 15 가지 농도에서 -DNA 중단 튜브. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 100 ㎎ / ℓ, 10 ㎎ / ℓ, 1 ㎎ / ℓ, 0 ㎎ / ℓ. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 계면 활성제 및 고분자의 흡수 및 형광 방출 스펙트럼은 단일 벽 탄소 나노 튜브를 중단했다. (a) 주제 흡광도 SP(GT) 15 -DNA에 의해 직접 초음파를 사용하여 일시 중단 된 단일 벽 탄소 나노 튜브의 ectra. SWNT의 농도가 10 ㎎ / ℓ이다. 삽입 : 흡광도 스펙트럼의 UV 영역은 260 nm에서의 특징적인 DNA의 흡수 피크를 나타낸다. (b)에 RITC-PEG20-RITC의 흡광도 스펙트럼 단일 벽 탄소 나노 튜브 투석에 의해 SC의 교환 후. 삽입 : RITC-PEG-RITC의 단일 벽 탄소 나노 튜브의 10 배 희석 한 시료의 흡광도는 로다 민의 특성 흡수를 나타낸다. (c) (GT) 15 -DNA 직접 초음파에 의한 (785 nm의 여기)를 이용하여 현탁 SWNT를 대표 근적외선 발광 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 사용 도파민의 형광 검출 (GT) 15 -DNA 포장 단일 벽 탄소 나노 튜브. (A 강한>) 형광 응답 (GT) 15 -DNA 도파민의 추가에 싸여 단일 벽 탄소 나노 튜브를. 5 ㎎ / ℓ의 농도 센서의 샘플을 500 mW의 721 nm의 CW 레이저를 사용하여 흥분했다. 250 μM 첨가 도파민 농도를 1 μM로 증가 나노 900-1,350 센서로부터 방출의 통합 형광. PEG-의 (b) 형광 발광 스펙트럼 (GT) 15 -DNA의 SWNT 전에 도파민을 첨가 한 후, 랩. 센서의 농도가 10 ㎎ / ㎖가되는 도파민 100 μM의 최종 농도로 첨가한다. 샘플은 500 mW의 721 nm의 CW 레이저를 사용하여 여기시켰다. 두 최고 강도는 도파민을 첨가 한 후 강도의 약 두 봉우리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
g "/>
그림 4 : 단일 표면 고정화 단일 벽 탄소 나노 튜브의 형광 이미징. (a) 형광 APTES의 실란 화 과정을 이용하여 실리카 커버 슬립 (# 150)에 고정 된 각각의 C 26 -DNA-SWNT (적색 화살표)의 발광 및 2D의 InGaAs 센서 어레이를 사용하여 이미지화하는 100X 오일 침지 대물 반전 현미경 ( 계획 고차 색지움, 1.4 NA) 및 500 mW의, 721 nm의 CW 레이저. C-26 -Cy3 DNA의 단일 벽 탄소 나노 튜브 (b) 형광 표백 실험 APTES를 이용하여 표면에 닿는. 한 DNA 가닥 말단 전에 튜브 현탁액에를 Cy3로 표지 '3입니다. 각각의 센서의 증분 단계별 광표백 (적색 트레이스 장착)를 추적하는 SWNT로의 표면에 흡착 된 DNA 분자의 수를 결정하는데 사용된다. 이미지는 100X 오일 침지 목표 (계획 고차 색지움, 1.4 NA), 및 561 nm의 레이저 여기에 TIRF 모드에서 거꾸로 현미경을 사용하여 획득 하였다. 스케일 바 : 10 μm의.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
얻어진 SWNT 폴리머 하이브리드의 콜로이드 분산 물에 의해 제공되는 광학 밀도의 증가에 의해 표시된 바와 같이 단일 벽 탄소 나노 튜브는 용이 SDS 또는 ssDNA를 직접 초음파를 통해 수용액에 현탁된다. SDS와 ssDNA를이 분산 및 소수성 또는 파이 - 파이 상호 작용을 통해 단일 벽 탄소 나노 튜브 표면에 흡착하여 단일 벽 탄소 나노 튜브의 번들을 가용화. 또한, 이러한 게놈 DNA, 양친 성 중합체, 공액 중합체 및 지질과 같은 다른 중합체, 또는 SC SDS를 사용하여 현탁 시료 투석 벽 탄소 나노 튜브의 표면에 흡착 될 수있다. 예컨대 PEG와 같은 친수성 중합체, 블록 공중 합체의 표면 흡착을 가능하게하는 등의 RITC 또는 FITC 소수성 "앵커"와 최종 수정 될 수있다. 또는 SWNT하는 낮은 결합 친 화성을 가진 폴리머에 대한 프로브 팁 초음파의 높은 힘에 노출시 전단 또는 분해에 민감한 폴리머를 들어, 투석 안정적인 SWNT 폴리머 서스펜션을 생산하는 가장 좋은 방법입니다. 폴리머 encaps에 따라위험률은 원심 균일하게 분산 된 샘플을두고 대 SWNT 번들 비정질 탄소 잔류 금속 촉매 및 다른 수용성 오염 물질을 제거한다. 10 ~ 100 ㎎ / ℓ 사이의 원심 범위 후 분산 된 단일 벽 탄소 나노 튜브의 전형적인 최종 농도.
초음파 전력 및 시간을 조정하여 분산제의 특정한 선택을 위해 최적화 될 수있다. 너무 적게 또는 약한 초음파 가난한 분산 될 수 있기 때문에 너무 많이 또는 너무 강력한 초음파 가난한 형광으로 이어질 수 있지만 이것은 코팅 단일 벽 탄소 나노 튜브의 절차에서 중요한 단계입니다. 일반적으로, 더 낮은 전력이 DNA 등의 전단에 민감한 폴리머를 사용할 때의 손상을 최소화하기 위해 필요하다. 긴 초음파 기간 이상 강도는 ~ 100 nm의 여기자 재조합 길이 아래 단일 벽 탄소 나노 튜브는 비 형광가 단일 벽 탄소 나노 튜브의 길이의 감소로 이어질 수 있습니다. 초음파기 탐침 팁의 크기도 튀는 것을 방지하기 위해 샘플 량에 맞는 최적 대한 발포해야결과 (일반적으로 제조업체에서 제공). 상기 용기의 측면에 프로브 선단에 손이 닿지 않도록 용액의 가열을 최소화하기 위해 얼음 블록 용액을 놓는다. 분산되면, 단일 벽 탄소 나노 튜브 용액이 무기한 실온에서 안정하다.
분산 생성 된 단일 벽 탄소 나노 튜브 용액의 흡광도 및 방출 스펙트럼은 다른 랄리의 분산 단일 벽 탄소 나노 튜브의 혼합물의 존재를 나타내는 여러 봉우리가 포함되어 있습니다. SWNT 생성 또는 정제 방법의 다른 방법은 다른 피크 여기 및 방출 형광 스펙트럼을 선도, 키랄성 분포를 변경할 수 있습니다. 또한, 다른 합성 방법은 다른 키랄성 인구 분포와 단일 벽 탄소 나노 튜브의 샘플을 얻을 수 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다 HiPCO (철 카르 보닐 촉매와 고압) 성장 단일 벽 탄소 나노 튜브는 (7,6) 키랄성이 풍부하면서 CoMoCAT (코발트 - 몰리브덴 촉매) 성장 단일 벽 탄소 나노 튜브는 흡수의 차이로 이어지는, (6,5) 키랄성이 풍부 및 PHOToluminescence 스펙트럼.
특정 흡착 중합체 튜브 표면에서 로컬 환경을 변경하여 SWNT의 형광 방출을 조절함으로써 분석의 특정 검출을 가능하게한다. 이러한 접근 방식은 완전히 형광 발광 강도를 감소시킬 수 SWNT 격자를 방해하지 않음으로써 부분 결합의 공유 부착에 걸쳐 뚜렷한 장점을 제공한다. 6,32 - 34 또한 CoPhMoRe 방식은 이미 공지의 결합 부위가 존재하지 않을 수도 타겟에 대한 항체가없는 센서에 대한 개발 가능성이있다. (28) 즉, (GT) 15 -DNA 선택적 도파민 센서로서 사용을 가능 도파민의 존재하에 단일 벽 탄소 나노 튜브의 형광 발광을 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 벌크 형광 측정은 특정의 SWNT 랄리위한 발광 피크의 정도 80 %의 증가를 나타낸다. 움직이지 (GT)는 유리 슬라이드에 15 -DNA 단일 벽 탄소 나노 튜브 형광 RESP 수 있습니다연속 레이저 조명 아래, 어떤 감지 광표백하지 않고, 도파민의 존재에 하나의 단일 벽 탄소 나노 튜브 센서의 3 배 이상으로 증가 할 수있는 형광을 나타내는 개별 (GT) 15 -DNA 작용 SWNT의 온세 측정. 도파민 및 SWNT 센서 사이의 상호 작용 완충액으로 미세 유체 챔버로부터 도파민을 세척 후 원래 형광 신호의 복구에 의해 명백한 바와 같이, 가역적이다. 또한, 단일 분자 측정은 중합체 흡착 (도 4) 또는 바인딩 이벤트의 동력학을 정량화하기위한 강력한 특성화 기술 될 수있다. 또한, 비율 적 감지 화학적 고유 여기 발광 피크 단수 SWNT의 키랄 분리 (GT) 15 -DNA로 기능화 및 도파민에 민감 할 제 SWNT의 키랄 분리에 의해 달성 될 수있다. 두 SWNT의 랄리 모니터링은 m과 비교 될 수있는 정상 제어 형광 채널을 제공한다 제 (GT) 15 -DNA 단일 벽 탄소 나노 튜브의 형광을 odulating. 다른 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (GT) 15 -DNA) 등의 수정 확산 또는 세포 흡수 특성, 생체 실험을 수행 할 때 중요한 속성으로 추가 할 수있는 추가 기능을 결합.
현재 개발 센서 할 수있는 CoPhMoRe 접근의 제한은 폴리머 라이브러리 개발을 포함한다. 결합 부분은 시간 집약적 일 스크리닝하는 센서 라이브러리를 구성하는 다양한 화학적 중합체의 다수가 필요할 수있는 특정 목표하는 센서를 개발 선험적으로 알려져 있지 않기 때문에. 또한, 생체 내 환경에서의 안정성과 센서의 호환성은 센서에 센서 다를 수 있습니다. 후보 센서가 식별 된 후에 그러나 상기 변형 전략은 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필요에 따라 특성을 최적화하기 위해 사용될 수있다.
ve_content "> 여기서, 우리는 분산제의 다양한 적용 수용액의 SWNT를 분산시키는 방법을 증명하고있다.이 방식은 작은 분자 생물학적 마커 신규 신규 근적외선 센서의 발견에 분산 된 단일 벽 탄소 나노 튜브의 라이브러리를 생성 할 수있다 . 특히 관심을 실시간으로 복잡한 생물학적 환경에서 이러한 분자의 공간적 정확한 검출을 가능하게 할 수 신경 전달 물질의 검출을위한 센서입니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
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