Introduction
Enkel vägg kolnanorör (SWNTs) är atom tunna skikt av kolatomer ihoprullade till långa, tunna cylindrar som uppvisar unika elektroniska och optiska egenskaper. 1 Sådana egenskaper inkluderar en bandgap producerar nära infraröd (NIR) fluorescensemission via exciton rekombination som är mycket känslig för sin omgivning. NIR utsläpp av SWNTs faller inom det nära infraröda fönster där inträngningsdjupet av ljus är maximal för biologisk vävnad. 2,3 Dessutom SWNTs uppvisar flera unika egenskaper atypiska i motsats till organiska fluoroforer: SWNT uppvisar en stor Stokes skift, inte photobleach, och inte blinkar. 4 Nyligen utnyttja dessa egenskaper har lett till utvecklingen av ett sortiment av nya molekylära sensorer med tillämpningar på biologi. 5,6 Oförändrad dock SWNTs är olösliga i vatten, och erhållande av suspensioner av enskilda SWNTs kan vara en utmaning. 7,8 Bundling och aggregering av SWNTs i lösning kan fördunkla deras bandgap fluorescens, 2 gör dem olämpliga för analystillämpningar.
Dispergering enskilda kolnanorör i vattenlösning kräver att ändra sin yta för att förhindra hydrofoba driven aggregering. 9 Även kovalent modifiering kan göra SWNTs vattenlösliga, 10 samt ger specifik bindnings kemi, defekta platser i SWNT gitter minska eller dämpa deras fluorescensemission. Istället kan SWNT-funktionalisering åstadkommas genom användning tensider, lipider, polymerer och DNA 9,11 - 13 som adsorberar till den nanotube ytan genom hydrofoba och pi-pi stapling interaktioner. Den resulterande kemiska miljön som omger ytfunktionaliserade SWNTs refereras till som dess corona fas. Störningar till coronafasen kan ha en stor inverkan på excitoner reser på nanotube ytan, vilket module att SWNT fluorescence emission. Det är denna känsliga förhållande mellan coronafasen och SWNT fluorescens som kan utnyttjas för att utveckla nya molekylära sensorer genom att införliva specifika bindnings modaliteter på den stora ytarean hos SWNT. Störningar till SWNT corona fasen vid bindning analyt kan leda till förändringar i den lokala dielektriska miljön, laddningsöverföring, eller införa gitterdefekter, som alla kan modulera fluorescensemissionen av SWNTs att fungera som en signalöverföringsmekanism. 14 Detta tillvägagångssätt används i utvecklingen av nya fluorescerande sensorer för detektering av många olika klasser av molekyler, inklusive DNA, 15,16 glukos 17 och små molekyler såsom ATP, 18 reaktiva syrespecies 19 och kväveoxid. 20,21 Men dessa metoder begränsade i att de förlitar sig på att det föreligger en känd bindnings modalitet för målanalyten.
Nyligen har en mer allmän appmört att utforma fluorescerande sensorer har utvecklats med SWNTs icke-kovalent funktionaliserade med amfifila heteropolymerer, fosfolipider och polynukleinsyror. Dessa molekyler adsorberas till Nanorör ytor för att producera mycket stabila suspensioner av enskilda SWNTs 22 - 25 med unika corona faser som specifikt kan binda proteiner 26,27 eller små molekyler inklusive signalsubstansen dopamin. 28-30 Engineering corona fasen för att skingra SWNTs och specifikt binder målanalyter kallas korona fas molekylär igenkänning (CoPhMoRe). 28 Den lilla storleken, låg toxicitet, hög stabilitet och unbleaching NIR fluorescens CoPhMoRe SWNT sensorer gör dem till utmärkta kandidater för in vivo avkänning under längre tidsupplösta mätningar. 6 Senaste arbete har visat sina tillämpningar inom växtvävnader för optisk detektering av reaktiva kväve- och syreradikaler. 31En särskilt spännande ansökan om CoPhMoRe SWNT sensorer är potentialen för etikett fri detektering av signalsubstanser som dopamin in vivo, där andra tekniker, såsom elektrokemisk avkänning eller immunohistokemi, lider brist på rumslig upplösning, tidsupplösning, och specificitet.
Designa och upptäcka CoPhMoRe SWNT sensorer hittills hämmats av den storlek och kemiska olikhet dispergeringsmedel biblioteket, vilket begränsar sannolikheten att hitta en sensor för ett särskilt mål. Hittills har forskare bara skrapat på ytan av tillgängliga konjugerade, co-blocket, biologiska och biomimetiska polymerer som skulle kunna fungera som funktionellt aktiva dispergeringsmedel för SWNT sensorer. Här presenterar vi olika metoder för både dispergering SWNTs och karakterisera deras fluorescens för high throughput screening och för enstaka SWNT sensoranalys. Specifikt vi beskriva förfarandet för beläggning SWNTs med polynukleinsyra oligomERS med direktultraljudsbehandling samt hur man funktionalisera SWNT med amfifila polymerer genom utbyte tensid genom dialys. Vi använder (GT) 15-DNA och polyetylenglykol funktionaliseras med rodaminisotiocyanat (RITC-PEG-RITC) som exempel. Vi visar användningen av (GT) 15-DNA SWNTs som en CoPhMoRe sensor för detektering av dopamin. Slutligen vi beskriva förfaranden för att utföra enkla molekyl sensormätningar, som kan användas för karakterisering eller enda molekyl avkänning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDS) före användning. Nanomaterial kan ha ytterligare risker jämfört med deras bulkmaterial motsvarighet. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder inklusive tekniska kontroller (dragskåp, buller kapsling) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, glasögon, labbrock, fullängds byxor, sluten tå skor).
1. Beredning av buffert, ytaktivt medel och polymerlösningar
- Framställning av 100 mM NaCl-lösning
- Lös 584 mg NaCl i 80 ml avjoniserat vatten. Tillsätt avjoniserat vatten för att bringa den totala volymen till 100 ml.
- Framställning av 3% natriumdodecylsulfat (SDS) -lösning
- Lös 3 g SDS i 80 ml avjoniserat vatten. Tillsätt avjoniserat vatten för att bringa den totala volymen till 100 ml.
- Framställning av 2% natriumcholat (SC) lösning
- Lös upp 2 g av sodium cholat hydrat i 80 ml avjoniserat vatten. Tillsätt avjoniserat vatten för att bringa den totala volymen till 100 ml.
- Framställning av avbildningsbuffert (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Lös upp 22,23 g Tris-bas och 58,44 g NaCl i 500 ml avjoniserat vatten med användning av en magnetisk omrörarstav och platta.
- Tillsätt försiktigt koncentrerad HCl tills ett pH av 8,1 uppnås.
- Tillsätt avjoniserat vatten för att nå en slutlig volym på 1 L.
- Syntes av RITC-PEG-RITC polymer
- Upplösa amin difunctionalized polyetylenglykol (PEG) (5 kDa eller 20 kDa, 0,1 mol / L) och rodamin isotiocyanat (RITC, 0,2 mol / L) i 1 ml av en 1: 1 blandning av diklormetan och dimetylformamid (DMF).
- Lägga 0,2 mol / L av N, N-diisopropyletylamin (DIEA).
- Efter 3 h, fäll ut med 10x volym dietyleter, följt av vakuumfiltrering.
- Återupplösning i DMF och upprepa eter nederbörd followed genom vakuumfiltrering.
OBS: Andra isotiocyanat modifierade molekyler (t.ex., fluorescein-isotiocyanat, FITC) kan fästas på PEG eller andra amin modifierade polymerer med användning av en liknande metod.
- Framställning av pegylerat-DNA (PEG-DNA)
- Kombinera 100 mikroliter av Tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP) lösning (0,5 M, pH 7,0) med 44,9 | il av 5'-tiol-modifierade DNA (1 mg / 10 | il i 0,1 M NaCl) och tillsätt till 4,855 ml avjoniserat vatten.
- Rör om under 1 h.
- Lös upp 500 mg av metoxipolyetylenglykol maleimid i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning.
- Kombinera DNA- och PEG lösningar (10 ml totalt) och rör om under 24 timmar.
2. Beredning av Single Walled kolnanorör (SWNTs) Avstängningar
- Tvätt av SWNTs för att avlägsna katalysator och föroreningar.
- Lägga 200-300 mg otvättade SWNTs in i ett centrifugrör av plast containing 45 ml avjoniserat vatten.
- Vortex lösningen under 2 min och sonikeras med användning av en badsonikator under 5 min. Observera att sonikator inställningar varierar från instrument till instrument, så kontrollera att den optiska densiteten av lösningen ökar SWNT (dvs blir svart) för att säkerställa att SWNTs är sprids.
- Centrifugera lösningen under 20 min vid 16100 x g och kasta supernatanten.
- Tillsätt ca 45 ml av färskt avjoniserat vatten.
- Upprepa steg 2.1.2-2.1.4 upp till 8 gånger.
- Ta bort så mycket vatten som möjligt försiktigt så att inte störa pelleterade SWNTs och tillåta SWNT pellets lufttorka.
- Nukleinsyra-suspensioner av SWNTs
- Upplösa nukleinsyror (NA) i 0,1 M NaCl till en koncentration av 100 mg / ml.
- Ta bort statisk elektricitet från engångs spatel, mikrocentrifugrör och SWNT lager med hjälp av en antistatisk pistol. I ett dragskåp, tillsätt 20 | il av den Na-lösning till 980 | il av 00,1 M NaCl följt av tillsats av 1 mg SWNTs.
- Med användning av en ultraljud med 3 mm diameter tip, Sonikera lösningen under 10 min vid 40% amplitud i ett isbad.
- Centrifugera det DNA-SWNT lösningen två gånger under 90 minuter vid 16.100 x g. Om du använder PEG-DNA, rena ut överskott och oreagerad DNA och PEG med hjälp av en 100 kDa spin-filter. Tillsätt tillräckligt PBS för att fylla spinnfilter och snurra vid 9300 xg under 1,5 minuter, Upprepa detta tvättsteg 3 gånger.
- Samla och hålla supernatanten, försiktigt så att inte störa pelleten innehåller CNT buntar och aggregat. Kasta pelleten i enlighet med institutionella avfallsförfaranden farliga lämpliga för nanomaterial.
- Mät lösning absorbansen vid 632 nm med en UV / Vis spektrofotometer för att bestämma ungefärlig koncentration av suspenderade SWNTs använder ε = 0,036 L / cm · mg i enlighet med Lambert-Beers lag och lämplig spädningsfaktorn.
- Amfifila polymersuspensionerav SWNTs
- Ta bort statisk elektricitet från engångs spatel, mikro centrifugrör, och SWNT lager. I ett dragskåp, tillsätt 5 mg SWNTs till 5 ml av 2% SC lösning (alternativt SDS-lösning kan användas).
- Med användning av en ultraljud med 6 mm diameter tip, Sonikera lösningen under 1 h vid 40% amplitud i ett isbad.
- Centrifugera provet vid 150.000 xg under 4 h med hjälp av en ultracentrifug och försiktigt supernatanten.
- Lös 1 vikt% av amfifil polymer (t.ex. RITC-PEG-RITC) i SC-SWNT lösning.
- Dialysera polymer-SC-SWNT lösningen med en 3,5 kDa dialysmembran mot en L avjoniserat vatten eller buffert under 5 dagar. Ändra ut vattnet eller buffert efter timme 2 och timme 4. En större dialysmembran kan användas, så länge som den medger avlägsnande av det ytaktiva medlet av val, men retention av både SWNT och amfifila polymeren.
- Mäta lösningens absorbans vid 632 nm med användning av en UV / Vis-spektrofotometer för att bestämmaungefärlig koncentration av suspenderade SWNTs använder ε = 0,036 L / cm * mg i enlighet med Lambert-Beers lag och lämplig spädningsfaktorn.
3. Beredning av Surface Immobilized SWNT Sensorer
- Framställning av BSA-biotin och neutravidin förrådslösningar
- Lös upp 10 mg lyofiliserat BSA-biotin i 1 ml avjoniserat vatten för att göra en 10 mg / ml stamlösning och förvaras vid 4 ° C.
- Lös upp 10 mg neutravidin protein (NAV, deglykosylerade avidin protein) i 2 ml avjoniserat vatten för att göra en 5 mg / ml stamlösning. Förvara alikvoter vid -20 ° C. Upptinade portioner kan hållas under flera dagar vid 4 ° C.
- Förbereda BSA-Biotin belagda objektglas
- Rengöra ett objektglas och 0,17 mm täckglas (eller vad som är lämpligt för mikroskopobjektivet) med avjoniserat vatten, följt av metanol, aceton och en slutlig sköljning av avjoniserat vatten.
- Tillsätt 100 mikroliter av BSA-biotin stamlösning till 900 mikroliter av 1x Tris-buffert till en slutkoncentration av 1 mg / ml.
- Flow 50 mikroliter av BSA-biotin lösning in i kanalen genom att pipettera lösningen i ena änden och suga bort lösning på den andra med hjälp av en vävnad. Inkubera i 5 minuter följt av 3-5 spolningar med 50 mikroliter av 0,1 M NaCl.
- Späd 40 | il av 5 mg / ml NAV lager i 960 mikroliter 1x Tris-buffert till en slutlig koncentration av 0,2 mg / ml.
- Flöde 50 mikroliter av NAV lösning in i kanalen genom att pipettera lösningen i ena änden och suga bort lösning på den andra med hjälp av en vävnad. Inkubera under 2-5 minuterföljt av 3-5 spolningar med 50 mikroliter av 0,1 M NaCl.
- Utspädda stamlösningar av suspenderade SWNTs vid avbildning buffert till en koncentration av 1-10 mg / L och flöde 50 mikroliter av lösningen in i kanalen och inkubera i 5 min.
- Skölj försiktigt bort överflödigt SWNTs använder 50 mikroliter av avbildning buffert.
- Framställning av APTES silaniserad objektglas
OBS: APTES silaniserad diabilder möjliggöra ett sätt att immobilisera negativt laddade DNA-inslaget SWNTs till ytan av ett glassubstrat.- Bered en 10% lösning av (3-aminopropyl) trietoxisilan (APTES) i etanol.
- Använda kanaler som gjorts med hjälp av stegen i 3.2.2, flöde i 100 mikroliter av 1x Tris-buffert.
- Spola kanalen med APTES-lösning och inkubera under 5 min. Tvätta med 1x Tris-buffert.
- Utspädda stamlösningar av suspenderade DNA-SWNTs i avbildning buffert till en koncentration av 1-10 mg / Mark flöde 50 mikroliter av lösningen in i kanalen och incubåt under 5 min.
- Skölj försiktigt bort överflödigt SWNTs använder 50 mikroliter av avbildning buffert.
4. Fluorescence Spectroscopy och mikroskopi av SWNT sensorer
- Nir fluorescensmikroskopi
- Utför avbildning av ytan immobiliserade SWNTs använder laser excitation och ett inverterat mikroskop utrustat med en InGaAs sensor array för avbildning.
- Rikta laserstrålen att gå in i baksidan belysnings porten på ett inverterat mikroskop med användning av speglar på justerbara kinematiska fästen och ett par eftermonterade irisar fastställts till porten höjd. Se till att strålen är plant och rakt genom att bekräfta den passerar genom båda iris när de placeras mellan efterföljande speglar och innan den kommer in i belysnings porten. Vid behov, justera strålen höjden med ett periskop enhet. Ta bort alla kort-pass värme filter på belysnings port som skulle dämpa strålen.
- Sätt ett lämpligt filter kub i mikroskopetför att reflektera exciteringsljuset in i målet och samla emissionsljus. Denna består typiskt av ett dikroiskt långpassfilter med en cutoff ovanför excitationsvåglängden, (t.ex., 750 LP) och en emissionslångpassfilter (t.ex., 850 LP) för att ytterligare minimera strö excitationsljuset från att träffa sensorn. Dessutom kan emissionsfiltret väljas att vara selektiv för utsläpp av SWNTs av en viss kiralitet.
- Utför finjusteringar till ljushöjden genom att sätta in en lämplig inriktning kub ersätter målet med två förskjutna, frostat skivor som innehåller 1 mm hål. Rikta in strålen till mitten av både de nedre och övre inriktningsskivor.
- Bifoga en 2D InGaAs sensor array åt sidan imaging-porten på mikroskop med hjälp av en lämplig adapter och en 0,5X lins om nödvändigt för att tillgodose sensorstorleken.
- Med hjälp av en 100X oljeimmersionsobjektiv (1,4 NA), tillämpa fluorescens fritt immersionsolja och placera immobiseras SWNT provet på mikroskop scenen.
- Höja målet tills oljan når botten på täckglas (# 1,5, 170 | im tjocklek). Gör justeringar målet kragen vid behov för bildförhållanden, t.ex. temperatur, glastjocklek, etc.
- Sakta höja målet med exciteringskällan och övervaka fluorescenssignalen av InGaAs kamera. Fluorescensintensiteten bör successivt öka fokalplanet närmar sig ytan och de immobiliserade sensorer kommit i fokus.
- Nir Fluorescens-spektroskopi
OBS: Fluorescensspektroskopi kan utföras med användning av samma mikroskopinstallationsprogrammet men genom att rikta det uppsamlade ljuset ut ur mikroskopkroppen och in i en spektrometer och InGaAs linjär arraydetektor.- Med hjälp av kinematiska fästen och speglar klassade för NIR, rikta ljusstrålen mot ingången slits spektrometern. Fokusera ljuset ned till en point på ingångsspalten med hjälp av en fokuseringslins (t.ex., plankonvex, f = 150 mm). Denna anpassning sker genom att dämpa den lasereffekt <1 mW och ersätter mikroskop målet med en 1 "spegel och använder en 50/50 stråldelande filter kub. Kommer excitation ljus sedan lämna mikroskopkroppen genom utloppsöppningen och kan användas för att justera speglarna och lins för att fokusera strålen på ingångsspalten.
- Efter byte av mikroskopobjektivet och långpassfilter, placera en brunnar på scenen och registrera spektra av en i fokus provet med hjälp av spektrometer och InGaAs array.
- Mätning av reversibla svar (GT) 15-DNA-SWNTs till dopamin
- Mount sensor belagda kanalerna på mikroskop scenen och sätta i fokus med en 100X olja mål och InGaAs kamera. Tillsätt 50 | il av 100 | iM dopamin lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till flödeskanalen och spela införändringen i fluorescensintensitet.
- Tvätta ur dopaminlösning med användning av fosfatbuffrad saltlösning och observera förändringen i fluorescens av de individuella SWNT sensorer.
- Väl platta screening för analyt respons SWNTs sensorer
OBS: Screening av olika analyter kan utföras med användning av en transparent brunnsplatta kontrollerad med användning av en motoriserad skede. En idealisk brunnar är transparent för synligt och IR och har svarta sidoväggar för att minimera överhörning mellan brunnarna.- Pipett lika volymer av suspenderat SWNT sensor (t ex, 5 mg / L koncentration) i varje brunn, tillräckligt för att täcka botten av brunnen likformigt, typiskt> 100 | il för en 96-brunnars platta och> 30 mikroliter för en 384-brunnars platta .
- Pipett analyter (t.ex. 2 mikroliter, 100 ^ M slutlig volym) från screening bibliotek i brunnsplattor. Förbered varje analyt i tre exemplar till svars för eventuella väl till brunnar variation, Fluctuatjoner av exciteringsintensitet, eller temperatur.
- Höj målet (t.ex. 20X achroplan, 0,45 NA) medan du övervakar emissionsspektra med hjälp av spektrometer och InGaAs array. Optimal position av målet kommer att sätta fokalplanet ungefär i mitten av provvolymen i brunnen, vilket bör motsvara ett maximum i uppmätt intensitet.
- För varje provbrunn, spela in en 1-10 s exponering för att samla ett brett spektrum.
- Jämför emissionsspektra för varje brunn med en kontroll som innehåller bara SWNTs utan ytterligare analyt att kvantifiera fluorescenssvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SWNTs suspenderades i vattenlösning med användning både tensider och amfifila polymerer genom direkt ultraljudsbehandling och efter dialys utbyte. Figur 1 visar SWNTs, odlas med hjälp av järnkarbonyl katalyserade metoden (HiPCO) upphävde hjälp av SC, RITC-PEF20-RITC, och (GT) 15-DNA. Den optiska densiteten av en SWNTs med SDS (eller polymer) ökar dramatiskt efter ultraljudsbehandling och minskar vid avlägsnande av aggregat och föroreningar genom rening genom centrifugering (Figur 1). Mätningar av absorbans vid 632 nm kvantifierade koncentrationen av suspenderat SWNT. 28
De fotofysikaliska egenskaperna hos SWNT suspension karaktäriseras med hjälp av absorbans och fluorescens spektroskopi. Figur 2 visar den absorbans och fluorescensemissionsspektra för SWNTs suspenderade med användning av (GT) 15-DNA och RITC-PEG20-RITC. the absorbansspektra är en superponering av de individuella absorbanstoppar för varje distinkt kiralitet av nanorör som finns i provet. På liknande sätt uppvisar varje kiralitet dess unika toppfluorescensemission. Skillnader i relativ emissionstopp intensitet är en följd av skillnader i befolkningsfördelningen chiralities samt skillnader i exciteringseffektivitet med hjälp av 721 nm laser.
Fluorescenssvaret av (GT) 15-DNA-SWNTs (där jag 0 är den initiala SWNT fluorescensintensitet och I är SWNT intensitet efter dopamin tillsats) i närvaro av olika koncentrationer av dopamin mäts genom att övervaka fluorescensen hos ett prov med användning av en spektrofotometer och InGaAs linjär array (Figur 3). Den totala fluorescensen av (GT) 15-DNA-SWNTs ökade med ökande dopaminkoncentration (figur 3a). Fluorescensen response är en funktion av emissionstoppen (figur 3b), vilket indikerar att svaret kan vara kiralitet specifika. Fluorescensen för den 1044 nm och 1078 nm toppar ökning i intensitet 2-faldigt som dopaminkoncentrationen närmar 2 pM. Figur 3e visar intensiteten av hela emissionsspektra för PEG- (GT) 15-DNA-SWNT-ökning som svar på tillsatsen av dopamin.
Individuella SWNTs belagda med användning av en alternativ DNA-sekvens, är C 26-DNA (framställt med användning av samma metoder på (GT) 15), förankrade på ytan av ett objektglas mätt under laserbelysning med användning av en InGaAs kamera och 100X oljeimmersionsobjektiv (Figur 4). Övervakning enskilda utsläpps bundna till en yta kan användas för att kontrollera reversibilitet sensorsvar genom att tvätta målmolekyler bort med hjälp av buffertlösning. Total inre reflektion fluorescens (TIRF) microskopia kan också användas för att avbilda färgämne-konjugerad DNA som adsorberats på SWNTs att kvantifiera antalet DNA-molekyler fästa till varje rör genom fotoblekning experiment. Figur 4 visar 3 olika bleknings händelserna i Cy3-märkt DNA härledas från kvantiserade stegen i fluorescensintensiteten spår av en enda sändare. Dessa resultat indikerar att tre DNA-molekyler är bundna till SWNT.
Figur 1: Polymer och Surfactant Avstängd SWNTs. (A) Fotografi av RITC-PEG20-RITC SWNTs suspenderade användning av 2% SC vid olika punkter av förberedelser. Vänster: SWNTs sätts direkt till SC lösning före ultraljudsbehandling. Center: Efter 10 minuter av bad sonikering följt av 10 min sondspetsen ultraljudsbehandling vid 90% amplitud följt av centrifugering. Den optiska densiteten hos lösningen ökar när SWNTs buntar ärdispergerad (~ 100 mg / L SWNT koncentration). Höger: Efter dialys med RITC-PEG20-RITC polymeren, den slutliga koncentrationen av RITC-PEG-RITC suspenderades SWNTs är ~ 20 mg / L. (B) SWNT fjädring avkastning kan variera beroende på den polymer som används för att avbryta SWNT. Den optiska densiteten av lösningen ger en god uppskattning av lösningsfas SWNT koncentration. På bilden är olika koncentrationer av (GT) 15-DNA suspenderade rören vid olika koncentrationer. Från vänster till höger: 100 mg / L, 10 mg / L, 1 mg / L, 0 mg / L. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Absorption och fluorescensemissionsspektra av tensid och polymer svävande SWNTs. (A) representant absorbans spECTRA av SWNTs suspenderade med hjälp av (GT) 15-DNA genom direkt ultraljudsbehandling. Koncentrationen av SWNT är 10 mg / L. Infällt: UV regionen av absorbansspektra visar den karakteristiska DNA-absorbans topp vid 260 nm. (B) Absorbans spektrum av RITC-PEG20-RITC SWNTs efter utbyte av SC genom dialys. Infällt: Absorbans av en 10x utspätt prov av RITC-PEG-RITC SWNTs visar den karakteristiska absorptionen av rodamin. (C) Företrädare Nir emissionsspektra av SWNTs suspenderade med hjälp av (GT) 15-DNA genom direkt ultraljudsbehandling (785 nm excitation). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescensdetektion av dopamin med hjälp av (GT) 15-DNA inslagna SWNTs. (a strong>) Fluorescence svar (GT) 15-DNA inslagna SWNTs tillsatsen av dopamin. Prover av sensorer vid en koncentration av 5 mg / L var glada med användning av en 500 mW, 721 nm CW-laser. Den integrerade fluorescens emissionssensor från 900-1,350 nm ökar med ökad dopaminkoncentration 1 um till 250 um. (B) Fluorescensemissionsspektra av PEG- (GT) 15-DNA inslagna SWNTs före och efter tillsats av dopamin. Koncentrationen av sensorn är 10 mg / mL, till vilken dopamin tillsattes till en slutlig koncentration av 100 ^ M. Proverna var glada med hjälp av en 500 mW, 721 nm CW-laser. Den två högsta intensiteten når en topp ca dubbelt i intensitet efter tillsats av dopamin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
g "/>
Figur 4: fluorescens avbildning av enstaka utanpå immobiliserade SWNTs. (A) fluorescens emission av individuell C 26-DNA-SWNT (röda pilar) immobiliserade på en kiseltäckglas (# 1.5) med hjälp av ett förfarande APTES silanisering och avbildas med en 2D InGaAs sensor array, inverterat mikroskop med en 100X oljeimmersions mål ( planen Apochromat, 1,4 NA), och en 500 mW, 721 nm CW-laser. (B) Fluorescence blekningsexperiment av C 26 -Cy3 DNA-SWNTs bundna till en yta med hjälp av APTES. DNA-strängarna är 3 'terminalt märkt med Cy3 innan röret suspension. Spåra den inkrementella stegvis fotoblekning (röd monterad spår) av individuella sensorer används för att bestämma antalet DNA-molekyler adsorberade på ytan av de SWNTs. Bilder förvärvades med ett inverterat mikroskop i TIRF läge med en 100X oljeimmersions mål (plan Apochromat, 1,4 NA), och 561 nm laser excitation. Skala bar: 10 pm.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SWNTs lätt suspenderas i vattenlösning via direkt sonikering med SDS eller ssDNA, såsom indikeras av en ökning i optisk densitet som tillhandahålls av kolloidal dispersion av den resulterande SWNT-polymer-hybrid. SDS och ssDNA sprider och solubiliserar buntar med SWNTs genom adsorption på SWNT ytan genom hydrofoba eller pi-pi interaktioner. Dessutom kan andra polymerer, såsom genomiskt DNA, amfifila polymerer, konjugerade polymerer och lipider, kan adsorberas på ytan av SWNTs genom dialys av prover upphängda med hjälp av SC eller SDS. Hydrofila polymerer, såsom PEG, kan avsluta modifierade med hydrofoba "ankare" som RITC eller FITC att möjliggöra ytadsorption av segmentsampolymeren. För polymerer som är känsliga för skjuvning eller nedbrytning vid exponering för höga krafter mätkulans ultraljudsbehandling, eller för polymerer med låga bindningsaffiniteter till SWNT, är dialys den bästa metoden för att producera en stabil SWNT-polymer suspension. Följande polymer encapslering, avlägsnar centrifugering stora SWNT buntar, amorft kol, restmetallkatalysator, och andra olösliga föroreningar att lämna en jämnt spridda prov. Typiska slutkoncentrationer av dispergerade SWNTs efter centrifugering område mellan 10-100 mg / L.
Sonication kraft och varaktighet kan justeras och optimeras för den speciella valet av dispergeringsmedel. Detta är ett kritiskt steg i förfarandet för beläggning SWNTs eftersom för lite eller svag sonikering kan leda till dålig spridning, medan för mycket eller för stark sonikering kan leda till dålig fluorescens. Vanligtvis lägre befogenheter är nödvändiga för att minimera skador vid användning av polymerer som är känsliga för skjuvning såsom DNA. Längre sonication varaktigheter eller högre intensiteter kan leda till minskning av längden på SWNTs, där SWNTs under ~ 100 nm exciton rekombination längd blir icke-fluorescerande. Storleken på sonikator sondspetsen bör också matcha prowolymen för att undvika stänk och skumning för optimalresultat (vanligtvis tillhandahålls av tillverkaren). Undvik att vidröra sondspetsen till sidorna av behållaren och placera lösningen på ett isblock att minimera upphettning av lösningen. En gång dispergerad, lösningar av SWNTs är stabila vid rumstemperatur under obegränsad tid.
Absorbans och emissionsspektra för lösningar av dispergerade genererade SWNTs innehålla flera toppar, vilket indikerar närvaron av en blandning av dispergerade SWNTs av olika chiralities. Alternativa metoder för SWNT generation eller reningsmetoder kan ändra kiralitet distribution, vilket leder till olika topp excitation och emissionsfluorescensspektra. Dessutom kan olika syntesmetoder ger prover av SWNTs med olika kiralitet befolkningsfördelningar. Till exempel: CoMoCAT (kobolt-molybdenkatalysator) odlas SWNTs är rika på (6,5) kiralitet, medan HiPCO (högt tryck med järn karbonyl katalysator) odlas SWNTs är rika på (7,6) kiralitet, vilket leder till skillnader i absorption och photoluminescence spektra.
Vissa adsorberade polymerer möjliggöra specifik detektion av analyter genom modulering av fluorescensemissionen av SWNT genom att ändra den lokala miljön vid rörytan. Denna metod ger klar fördel jämfört med kovalent bindning av bindande delar genom att inte permanent störa SWNT gitter, som kan minska fluorescensemissionsintensitet. 6,32 - 34 Dessutom har CoPhMoRe tillvägagångssätt potential att utveckla antikroppsfria sensorer för mål där det inte redan kan finnas en känd bindande del. 28 Specifikt (GT) 15-DNA har visats att selektivt öka fluorescensemissionen från SWNTs i närvaro av dopamin, vilket möjliggör dess användning som en dopaminsensor. Bulkfluorescensmätningar visar en ökning med så mycket som 80% i toppemission för vissa SWNT chiralities. Immobiliserande (GT) 15-DNA SWNTs på ett objektglas möjliggör fluorescens respOnse mätningar av individuella (GT) 15-DNA funktionaliserad SWNT, som visar att fluorescens kan öka med mer än 3-faldig för enkel SWNT sensorer i närvaro av dopamin, utan någon märkbar fotoblekning, under kontinuerlig laserbelysning. Samspelet mellan dopamin och SWNT sensorn är reversibel, vilket framgår av återhämtningen av den ursprungliga fluorescenssignalen efter tvätt dopamin ur mikroflödeskammare med buffert. Dessutom kan en enda molekyl mätningar vara en kraftfull karakterisering teknik för att kvantifiera polymer adsorption (Figur 4) eller kinetik bindande händelser. Dessutom kan ratiometrisk avkänning åstadkommas genom att kemiskt isolera en enda SWNT kiralitet med en unik topp excitation utsläpp, funktion den med (GT) 15-DNA och isolering av en andra SWNT kiralitet att vara okänslig för dopamin. Övervaka båda SWNT chiralities ger en stadig kontroll fluorescens kanal som kan jämföras med den m odulating fluorescens av (GT) 15-DNA SWNTs. Kombinera olika polymerer (t.ex. polyetylenglykol och (GT) 15-DNA) kan lägga till ytterligare funktioner såsom modifierande diffusivitet eller cellulärt upptag egenskaper, egenskaper som är avgörande när du utför in vivo experiment.
För närvarande, en begränsning av CoPhMoRe strategi för utveckling av sensorer inkluderar polymer biblioteksutveckling. Eftersom bindningsdelar inte är kända a priori, att utveckla en sensor för ett särskilt mål kan vara tidskrävande och kräver ett stort antal kemiskt olika polymerer för att konstruera sensorn bibliotek för screening. Dessutom kan stabilitet och kompatibilitet av sensorer i in vivo miljöer variera från sensor till sensor. Men när en kandidat sensor har identifierats, ytterligare modifieringsstrategier kan användas för att optimera egenskaper som är nödvändiga för tillämpningar in vivo.
ve_content "> Häri har vi visat en metod för att dispergera SWNTs i vattenlösningar som tillämpas på en bred variation av dispergeringsmedel. kan användas Detta tillvägagångssätt för att skapa bibliotek av dispergerade SWNTs för upptäckten av nya nya NIR-sensorer för små molekyler och biologiska markörer . av speciellt intresse är sensorer för detektering av signalsubstanser, vilket skulle kunna göra det möjligt för realtid, rumsligt exakt detektion av dessa molekyler i komplexa biologiska miljöer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al.
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
