Introduction
Single-vegger karbon nanorør (SWNTs) er atomically tynne lag av karbonatomer rullet inn i lange, tynne sylindere som viser unike elektroniske og optiske egenskaper. 1 Slike egenskaper inkluderer et band-gap produserer nær infrarød (NIR) fluorescensemisjonsmaksimum via exciton rekombinasjon som er svært følsom for sitt nærmiljø. NIR utslipp av SWNTs faller innenfor det nære infrarøde vindu hvor inntrengningsdybden av lys er maksimal for biologisk vev. 2,3 I tillegg SWNTs inneha flere unike funksjoner atypiske i motsetning til organiske fluorophores: SWNT utstillingen en stor Stokes skift, ikke photobleach, og ikke blinke. 4 Nylig utnytte disse egenskapene har ført til utviklingen av et utvalg av nye molekylære sensorer med anvendelser til biologi. 5,6 Umodifisert imidlertid SWNTs er uløselige i vann, og få suspensjoner av enkelt SWNTs kan være en utfordring. 7,8 Bundling og aggregering av SWNTs i løsningen kan obfuscate deres band-gap fluorescens, 2 gjør dem uegnet for sensing applikasjoner.
Dispergere individuelle karbon nanorør i vandig løsning krever modifisere deres overflate for å hindre hydrofobisitet-drevet aggregering. 9 Mens kovalent modifikasjon kan gjengi SWNTs vannløselig, 10 samt formidle spesifikk binding kjemi, defekt områder i SWNT gitter redusere eller forringe deres fluorescens utslipp. I stedet kan SWNT funksjonalisering oppnås ved hjelp av overflateaktive midler, lipider, polymerer og DNA 9,11 - 13 som adsorberer til det nanorør overflaten gjennom hydrofobe og pi-pi stabling interaksjoner. Den resulterende kjemiske miljøet rundt overflatefunksjonalis SWNTs blir referert til som den korona fase. Forstyrrelser til koronaen fase kan ha en stor innvirkning på excitons reiser på nanorør overflaten, forårsaker modulasjoner til SWNT fluorescence utslipp. Det er dette følsomme forholdet mellom korona-fase og SWNT fluorescens som kan utnyttes for å utvikle nye molekylære sensorer ved inkorporering av spesifikke bindingsformer på det store overflatearealet av SWNT. Perturbasjoner til SWNT korona-fase ved binding analytten kan føre til endringer i den lokale dielektriske omgivelser, ladningsoverføring, eller introdusere gitterfeil, som alle kan modulerer fluorescensemisjonen av SWNTs for å tjene som en signaltransduksjon mekanisme. 14 Denne fremgangsmåten anvendes i utviklingen av nye fluorescerende sensorer for påvisning av mange forskjellige klasser av molekyler, inkludert DNA, 15,16 glukose 17 og små molekyler som ATP, 18 reaktive oksygenforbindelser 19 og nitrogenoksid. 20,21 Imidlertid er disse fremgangsmåter begrenset ved at de er avhengige av at det foreligger en kjent bindende modalitet for målanalytten.
Nylig har en mer generell appmort å designe fluorescerende sensorer er utviklet ved hjelp SWNTs ikke-kovalent functionalized med amfifile heteropolymerer, fosfolipider, og polynucleic syrer. Disse molekylene adsorberes til karbon nanorør overflater for å produsere svært stabile suspensjoner av enkelt SWNTs 22 - 25 med unike korona faser som spesifikt binder proteiner 26,27 eller små molekyler inkludert signalstoffet dopamin. 28. - 30. Engineering korona-fase for å dispergere SWNTs og spesifikt binder målanalytter betegnes som korona-fase molekylær gjenkjennelse (CoPhMoRe). 28 Den lille størrelsen, lav toksisitet, høy stabilitet og unbleaching NIR fluorescens av CoPhMoRe SWNT sensorer gjør dem gode kandidater for in vivo sensing i lengre tids løst målinger. 6 Nyere arbeider har vist sine søknader i plantemateriale for optisk deteksjon av reaktive nitrogen og oksygen arter. 31En spesielt praktisk anvendelse for CoPhMoRe SWNT følere er potensialet for etiketten fri påvisning av neurotransmittere, slik som dopamin in vivo, hvor andre teknikker, for eksempel elektrokjemisk føle eller immunhistokjemi, lider av en mangel på romlig oppløsning, tidsmessig oppløsning, og spesifisitet.
Prosjektering og oppdage CoPhMoRe SWNT sensorer har så langt vært tilbakeholdne med størrelsen og kjemiske mangfold av dispergeringsmiddel biblioteket, noe som begrenser sannsynligheten for å finne en sensor for et bestemt mål. Hittil har forskerne bare riper i overflaten av tilgjengelig konjugert, co-blokk, biologisk og biomimetic polymerer som kan tjene som funksjonelt aktive dispergeringsmidler for SWNT sensorer. Her presenterer vi ulike metoder for både å spre SWNTs og karakterisere deres fluorescens for high throughput screening og for enkelt SWNT sensor analyse. Spesielt vi skissere fremgangsmåten for belegg SWNTs med polynucleic syre oligomers bruke direkte ultralyd samt hvordan å functionalize SWNT med amfifile polymerer gjennom surfaktant utveksling ved dialyse. Vi bruker (GT) 15-DNA og polyetylenglykol funksjonalisert med rhodaminisotiocyanat (RITC-PEG-RITC) som eksempler. Vi viser bruken av (GT) 15-DNA SWNTs som et CoPhMoRe sensor for deteksjon av dopamin. Til slutt, skissere vi rutiner for å utføre enkle molekylet sensormålinger, som kan brukes for å karakterisere eller enkelt molekyl sensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Sjå alle relevante sikkerhetsdatablad (SDS) før bruk. Nanomaterialer kan ha flere farer i forhold til deres bulk materialer motstykke. Bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner inkludert tekniske kontroller (avtrekkshette, støy kabinett) og personlig verneutstyr (vernebriller, vernebriller, frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko).
1. Utarbeidelse av buffer, surfaktant og Polymer Solutions
- Fremstilling av 100 mM NaCl-oppløsning
- Oppløs 584 mg NaCl i 80 ml deionisert vann. Legg avionisert vann til å bringe totalvolumet til 100 ml.
- Fremstilling av 3% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) -løsning
- Oppløs 3 g av SDS i 80 ml deionisert vann. Legg avionisert vann til å bringe totalvolumet til 100 ml.
- Fremstilling av 2% natriumcholat (SC) løsning
- Løs opp 2 g av torvium cholat hydrat i 80 ml avionisert vann. Legg avionisert vann til å bringe totalvolumet til 100 ml.
- Utarbeidelse av bildebuffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Oppløs 22,23 g Tris-base og 58,44 g NaCl i 500 ml deionisert vann under anvendelse av en magnetisk rørestav og plate.
- legge til forsiktig konsentrert HCl inntil en pH på 8,1 er nådd.
- Legg avionisert vann for å oppnå et sluttvolum på 1 L.
- Syntese av RITC-PEG-RITC polymer
- Løs opp aminet difunctionalized polyetylenglykol (PEG) (5 kDa eller 20 kDa, 0,1 mol / l) og rhodaminisotiocyanat (RITC, 0,2 mol / l) i 1 ml av en 1: 1 blanding av diklormetan og dimetylformamid (DMF).
- Legg til 0,2 mol / L av N, N-diisopropyletylamin (DIEA).
- Etter 3 timer utfelles med 10 x volum av dietyleter, etterfulgt av vakuum-filtrering.
- Oppløs i DMF og gjenta eter nedbør Followed ved vakuumfiltrering.
MERK: Andre isothiocyanate modifiserte molekyler (f.eks fluoresceinisotiocyanat, FITC) kan kobles til PEG eller andre amin modifiserte polymerer som bruker en lignende metode.
- Utarbeidelse av pegylert-DNA (PEG-DNA)
- Kombiner 100 ul Tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP) løsning (0,5 M, pH 7,0) med 44,9 ul av 5'-thiol-modifisert DNA (1 mg / 10 pl i 0,1 M NaCl) og tilsett til 4,855 mL deionisert vann.
- Omrør i 1 time.
- Oppløs 500 mg metoksypolyetylenglykol maleimid i 5 ml fosfatbufret saltløsning.
- Kombiner DNA og PEG-løsninger (10 ml totalt) og omrør i 24 timer.
2. Utarbeidelse av enkelt Walled karbon nanorør (SWNTs) utestengelse
- Vask av SWNTs å fjerne katalysator og urenheter.
- Legg 200-300 mg uvaskede SWNTs i en plast sentrifugerør Containing 45 ml deionisert vann.
- Vortex løsningen i 2 minutter og sonikere anvendelse av en bad-sonikator i 5 minutter. Merk at ultralyd innstillingene varierer fra instrument til instrument, så sjekk at den optiske tettheten av løsningen øker SWNT (dvs. blir svart) for å sikre at SWNTs blir spredt.
- Sentrifuger løsningen i 20 minutter ved 16100 xg og kast supernatant.
- Tilsett ca 45 ml friskt deionisert vann.
- Gjenta trinn 2.1.2-2.1.4 opp til 8 ganger.
- Fjern så mye vann som mulig å være forsiktig for ikke å forstyrre pelle SWNTs og la SWNT pellet lufttørke.
- Nukleinsyre suspensjoner av SWNTs
- Oppløs nukleinsyrer (NA) i 0,1 M NaCl til en konsentrasjon på 100 mg / ml.
- Fjern statisk elektrisitet fra disponibel spatel, mikrosentrifugerør og SWNT lager ved å bruke en antistatisk pistol. I en avtrekkshette, tilsett 20 mL av NA løsningen til 980 mL av 00,1 M NaCl, etterfulgt av tilsetning av 1 mg SWNTs.
- Ved hjelp av en ultrasonicator med spiss diameter på 3 mm, sonikere oppløsningen i 10 min ved 40% amplitude i et isbad.
- Sentrifuger DNA-SWNT løsning to ganger i 90 min ved 16 100 x g. Hvis du bruker PEG-DNA, rense ut overflødig og ureagert DNA og PEG ved hjelp av en 100 kDa spin-filter. Legg nok PBS å fylle spin-filter og spinn ved 9300 xg for 1,5 min, Gjenta dette vasketrinn 3 ganger.
- Samle og holde supernatanten, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten inneholder CNT bunter og aggregater. Kast pelleten i henhold til institusjonelle farlig avfall prosedyrer som passer for nanomaterialer.
- Mål oppløsning absorbansen ved 632 nm ved hjelp av et UV / Vis spektrofotometer for å bestemme omtrentlig konsentrasjon av suspenderte SWNTs ved hjelp ε = 0,036 l / cm • Mg i samsvar med Lambert-Beer 's lov og fortynningsfaktoren.
- Amfifile polymersuspensjonerav SWNTs
- Fjern statisk elektrisitet fra disponibel spatel, mikro sentrifugerør, og SWNT lager. I en avtrekkshette, legge til 5 mg SWNTs til 5 ml 2% SC-løsning (alternativt, SDS-løsning kan brukes).
- Ved hjelp av en ultrasonicator med spiss diameter på 6 mm, sonikere løsning i 1 time ved 40% amplitude i et isbad.
- Sentrifuger prøven ved 150 000 x g i 4 timer ved bruk av en ultrasentrifuge og nøye samle supernatanten.
- Løs opp 1 vekt% av amfifile polymer (f.eks RITC-PEG-RITC) i SC-SWNT løsning.
- Dialyser den polymer-SC-SWNT løsning ved hjelp av et 3,5 kDa dialysemembran mot 1 liter deionisert vann eller buffer i 5 dager. Bytte ut vann eller buffer etter time og 2 timer 4. Et større dialysemembran kan anvendes, så lenge som det tillater fjerning av det overflateaktive middel av valget, men retensjon av både SWNT og amfifile polymer.
- Mål oppløsning absorbansen ved 632 nm ved hjelp av et UV / Vis spektrofotometer for å bestemmeomtrentlig konsentrasjon av suspenderte SWNTs bruker ε = 0,036 L / cm * mg i samsvar med Lambert-Beers lov og fortynningsfaktoren.
3. Utarbeidelse av overflateimmobilisert SWNT Sensorer
- Utarbeidelse av BSA-biotin og NeutrAvidin lagerløsninger
- Oppløs 10 mg lyofilisert BSA-biotin i 1 ml deionisert vann for å gi en 10 mg / ml stamløsning og oppbevares ved 4 ° C.
- Oppløs 10 mg NeutrAvidin protein (NAV, deglykosylert protein avidin) i 2 ml avionisert vann for å lage en 5 mg / ml stamløsning. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C. Tinte porsjoner kan oppbevares i flere dager ved 4 ° C.
- Forbered BSA-Biotin belagt objektglass
- Rengjør et objektglass og 0,17 mm cover glass (eller hva som passer for mikroskop objektiv) med avionisert vann, etterfulgt av metanol, aceton og en siste skylling av avsaltet vann.
- Tilsett 100 ul BSA-Biotin stamløsning til 900 ul av 1 x Tris-buffer til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml.
- Strømnings 50 ul av BSA-biotin oppløsning inn i kanalen ved å pipettere løsningen inn i den ene ende og transporterende bort oppløsning ved den andre ved hjelp av et vev. Inkuber i 5 minutter etterfulgt av 3-5 spylinger med 50 ul av 0,1 M NaCl.
- Fortynn 40 ul av 5 mg / ml NAV lager i 960 pl 1 x Tris-buffer til en sluttkonsentrasjon på 0,2 mg / ml.
- Strømnings 50 mL av NAV oppløsningen inn i kanalen ved å pipettere løsningen inn i den ene ende og transporterende bort oppløsning ved den andre ved hjelp av et vev. Inkuber i 2-5 minutterfulgt av 3-5 spylinger med 50 ul av 0,1 M NaCl.
- Fortynne stamløsninger av suspenderte SWNTs i bildebuffer til en konsentrasjon på 1-10 mg / l og strømnings 50 ul av oppløsningen inn i kanalen og inkuberes i 5 min.
- Forsiktig skylle vekk overflødig SWNTs bruker 50 mL av bildebuffer.
- Utarbeidelse av APTES silanert objektglass
MERK: APTES silanisert glir tillate en måte å immobilisere negativt ladet DNA-innpakket SWNTs til overflaten av et glass-substrat.- Forbered en 10% løsning av (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) i etanol.
- Ved hjelp av kanaler laget ved hjelp av fremgangsmåten under 3.2.2, flyt i 100 mL av 1x Tris buffer.
- Spyl kanal med APTES løsning og inkuberes i 5 min. Vask med 1x Tris buffer.
- Fortynne stamløsninger av suspenderte DNA-SWNTs i bildebuffer til en konsentrasjon på 1-10 mg / Land strømnings 50 ul av oppløsningen inn i kanalen og incubspiste i 5 min.
- Forsiktig skylle vekk overflødig SWNTs bruker 50 mL av bildebuffer.
4. flourescensspektroskopi og mikroskopi av SWNT Sensorer
- Nir Fluorescensmikroskopi
- Utfør avbildning av overflate immobilisert SWNTs bruker laser eksitasjon og en invertert mikroskop utstyrt med en InGaAs sensor array for bildebehandling.
- Rett laserstrålen til å gå inn på baksiden belysning porten på en invertert mikroskop ved hjelp av speil på justerbare kinematiske mounts og et par av ettermonterte iris satt til havnen høyde. Sikre at strålen er plan og rett ved å bekrefte den passerer gjennom begge iris når plassert mellom påfølgende speil og før det går inn i porten belysning. Om nødvendig, juster strålen høyde ved hjelp av et periskop montering. Fjern eventuelle kort-pass varme filtre på belysning port som ville dempe strålen.
- Sett et egnet filter kube i mikroskopfor å reflektere den magnetisering lys inn i målet og samle utslippet lys. Denne består vanligvis av en dichroic lang pass filter med en cutoff over eksitasjon bølgelengde, (for eksempel 750 LP) og utslipps lang pass filter (f.eks 850 LP) for ytterligere å minimere spredt eksitasjon lys treffer sensoren. I tillegg kan utslipp filter velges til å være selektiv for utslipp av SWNTs av en spesiell kiralitet.
- Utfør justeringer av strålejustering ved å sette en passende justering kube erstatte objektivet med to offset, frostet plater med 1 mm nålehull. Juster strålen til midten av både de nedre og øvre justerings plater.
- Fest en 2D InGaAs sensor array til siden avbildning porten av mikroskopet med en passende adapter og en 0,5 x objektiv hvis det er nødvendig for å imøtekomme størrelsen på sensoren.
- Ved hjelp av en 100X oljeneddyppingsobjektivet (1,4 NA), gjelder fluorescens-free immersion olje og legg immobilized SWNT prøven på objektbordet.
- Hev målet til oljen i kontakt med undersiden av dekkglasset (# 1,5, 170 um tykkelse). Gjør justeringer målet krage om nødvendig for bildeforhold, for eksempel temperatur, glasstykkelse, etc.
- Sakte heve mål med den magnetisering kilde på og overvåke fluorescens signalet til InGaAs kameraet. Fluorescens intensitet bør gradvis øke etter hvert som fokalplanet nærmer seg overflaten og de immobiliserte sensorene kommer i fokus.
- NIR flourescensspektroskopi
MERK: Fluorescens-spektroskopi kan utføres ved hjelp av samme mikroskop oppsett, men ved å lede den oppsamlede lyset ut av mikroskopet legemet og inn i et spektrometer og InGaAs lineær array detektor.- Ved hjelp av kinematiske mounts og speil vurdert for NIR, rette lyset banen mot inngangen slit av spektrometeret. Fokusere lyset ned til en point på inngangen slisse ved hjelp av en fokuserende linse (f.eks plano-konveks, f = 150 mm). Denne justeringen gjøres ved å dempe laser makt til <1 mW og erstatte mikroskop objektiv med en "speil og bruke en 50/50 strålesplitter filter kube. Den eksitasjon lyset vil deretter forlate mikroskop kroppen gjennom utløpsåpningen og kan bli brukt til å justere speil og linse for å fokusere strålen på inngangen slit.
- Etter utskifting av mikroskop objektiv og lange pass filter, plassere en brønn plate på scenen og ta opp spektra av en fokus prøven ved hjelp av spektrometeret og InGaAs array.
- Måling av reversible responsen (GT) 15 DNA-SWNTs til dopamin
- Mount sensor belagt kanaler på mikroskopet scenen og sette i fokus med en 100X olje objektiv og InGaAs kamera. Tilsett 50 ul av 100 uM dopamin-løsning i fosfatbufret saltvann (PBS) til strømningskanalen og plateendringen i fluorescens-intensitet.
- Vaske ut dopamin-oppløsning ved bruk av fosfatbufret saltvann og observere endringen i fluorescens av de enkelte SWNT sensorene.
- Godt plate screening for analytten responsen SWNTs sensorer
MERK: Screening av forskjellige analytter kan utføres ved hjelp av et gjennomsiktig brønners plate styres ved hjelp av en motorisert trinn. En ideell brønn plate er gjennomsiktig for synlig og IR og har sorte sidevegger for å minimere krysstale mellom brønnene.- Pipettes like volumer av suspendert SWNT sensor (for eksempel 5 mg / l konsentrasjon) til hver brønn, nok til å dekke bunnen av brønnen jevnt, typisk> 100 ul av en 96-brønns plate og> 30 pl av en 384-brønners plate .
- Pipette analytter (f.eks 2 mL, 100 mM sluttvolum) fra screening biblioteket til brønnplatene. Forbered hver analytt i tre eksemplarer til å gjøre rede for potensiell godt å vel variasjon, Fluctuationer av eksitasjon intensitet, eller temperatur.
- Hev objektiv (f.eks 20X achroplan, 0,45 NA) mens overvåking utslipps spektra ved hjelp av spektrometeret og InGaAs array. Optimal plassering av mål vil sette fokalplanet omtrent i midten av prøvevolumet i brønnen, som skal svare til en maksimal i målt intensitet.
- For hver prøve godt, spille inn en 1-10 eksponering for å samle et spektrum.
- Sammenligne den emisjonsspektra for hver brønn med en kontroll inneholdende kun SWNTs uten ytterligere analytten for å kvantifisere fluorescensen respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SWNTs ble suspendert i vandig oppløsning ved hjelp av både overflateaktive og amfifile polymerer ved direkte ultralydbehandling og etter dialyse utveksling. Figur 1 viser SWNTs, dyrket ved hjelp av jern karbonyl katalysert metode (HiPCO), suspendert bruker SC, RITC-PEF20-RITC, og (GT) 15 DNA. Den optiske tetthet av en SWNTs med SDS (eller polymer) øker dramatisk etter sonikering og minker ved fjerning av aggregater og forurensninger gjennom rensing ved sentrifugering (figur 1). Målinger av absorbans ved 632 nm kvantifisert konsentrasjonen av suspendert SWNT. 28
De photophysical egenskapene til SWNT suspensjoner er preget ved hjelp av absorbans og fluorescens spektroskopi. Figur 2 viser absorbans og fluorescens-emisjonsspektra av SWNTs suspendert ved anvendelse av (GT) 15-DNA og RITC-PEG20-RITC. the absorbans-spektrene er en overlagring av de enkelte absorbanstoppene for hver distinkt chiralitet av nanorør til stede i prøven. Tilsvarende viser hver kiralitet sin unike fluorescens emisjonstopp. Forskjeller i forhold emisjonstopp intensitet er et resultat av forskjeller i befolkningen fordelingen chiralities samt forskjeller eksitasjon effektivitet bruker 721 nm laser.
Den fluorescerende reaksjon av (GT) 15 DNA-SWNTs (hvor I 0 er den første SWNT fluorescens-intensitet og I er SWNT intensitet etter dopamin tilsetning) i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av dopamin blir målt ved å måle fluorescensen av en prøve ved anvendelse av en spektrofotometer og InGaAs lineær array (figur 3). Den totale fluorescens av (GT) 15 -DNA-SWNTs økte med økende konsentrasjon av dopamin (figur 3a). Fluorescens response er en funksjon av emisjonstoppen (figur 3b), noe som indikerer at responsen kan være kiralitet spesifikke. Fluorescensen av 1044 nm og 1078 nm topper økning i intensitet 2-fold som dopamin-konsentrasjonen nærmer seg 2 uM. Figur 3e viser intensiteten av hele emisjonsspektra av PEG- (GT) 15 DNA-SWNT økning i respons til tilførsel av dopamin.
Individuelle SWNTs belagt ved hjelp av en alternativ DNA-sekvens, er C-26-DNA (fremstilt ved hjelp av de samme metoder ved (GT) 15), bundet til overflaten av et objektglass målt under laserbelysning ved bruk av en InGaAs-kamera og 100X oljeneddyppingsobjektivet (figur 4). Overvåking enkelt emittere tjoret til en overflate kan brukes til å kontrollere om den er reversibel sensor respons ved å vaske målmolekylene bort ved hjelp av bufferløsning. Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) microskopien kan også brukes til å avbilde fargestoff-konjugert DNA adsorbert på SWNTs til å kvantifisere antallet av DNA-molekyler som er knyttet til hvert rør gjennom fotobleking eksperimenter. Figur 4 viser 3 forskjellige bleking av Cy3-merket DNA utledes fra de kvantiserte trinnene av fluorescensintensiteten spor av en enkelt emitter. Disse resultatene tyder på at tre DNA-molekyler som er festet til SWNT.
Figur 1: Polymer og Surfactant Suspendert SWNTs. (A) Fotografi av RITC-PEG20-RitC SWNTs suspendert bruker 2% SC på ulike steder av forberedelse. Venstre: SWNTs lagt direkte til SC løsning før lydbehandling. Center: Etter 10 min av bad sonication etterfulgt av 10 min probespiss ultralydbehandling på 90% amplitude fulgt av sentrifugering. Den optiske tettheten av oppløsningen øker etter hvert som SWNTs buntene erdispergert (~ 100 mg / l SWNT konsentrasjon). Høyre: Etter dialyse med RITC-PEG20-RITC polymer, den endelige konsentrasjonen av RITC-PEG-RITC suspendert SWNTs er ~ 20 mg / l. (B) SWNT suspensjon utbytte kan variere avhengig av den polymer som benyttes for å suspendere den SWNT. Den optiske tettheten av oppløsningen gir et godt estimat for oppløsning-fase SWNT konsentrasjon. Avbildet er forskjellige konsentrasjoner av (GT) 15 -DNA opphengte rør ved forskjellige konsentrasjoner. Fra venstre til høyre: 100 mg / l, 10 mg / l, 1 mg / l, 0 mg / l. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Absorpsjon og fluorescens-emisjonsspektra av overflateaktivt middel og polymer suspendert SWNTs. (A) representant absorbans spectra av SWNTs suspendert bruker (GT) 15 DNA ved direkte lydbehandling. Konsentrasjonen av SWNT er 10 mg / l. Innfelt: Den UV-område av absorbansen spektra viser det karakteristiske DNA absorbanstoppen ved 260 nm. (B) absorbans spektra av RITC-PEG20-RITC SWNTs etter utveksling av SC ved dialyse. Innfelt: absorbans en 10x fortynnet prøve av RITC-PEG-RitC SWNTs viser karakteristiske absorbans av rhodamine. (C) Representant NIR emisjonsspektra av SWNTs suspendert bruker (GT) 15 DNA ved direkte lydbehandling (785 nm eksitasjon). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fluorescens påvisning av dopamin bruker (GT) 15 -DNA innpakket SWNTs. (a strong>) Fluorescens reaksjon av (GT) 15-DNA pakket SWNTs tillegg av dopamin. Prøver av sensorer til en konsentrasjon på 5 mg / l var spent ved hjelp av en 500 mW, 721 nm CW laser. Den integrerte fluorescens av sensor utslipp fra 900-1,350 nm øker med ekstra dopamin konsentrasjon 1fiM til 250 mikrometer. (B) Fluorescens emisjonsspektra av PEG- (GT) 15-DNA pakket SWNTs før og etter tilsetning av dopamin. Konsentrasjonen av sensoren er 10 mg / ml til hvilken dopamin ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 uM. Prøvene ble eksitert ved hjelp av en 500 mW, 721 nm CW laser. De to høyeste intensitet topper omtrent det dobbelte i intensitet etter tilsetning av dopamin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
g "/>
Figur 4: Fluorescens avbildning av enkle overflate immobilisert SWNTs. (A) Fluorescens utslipp av enkelte C 26 DNA-SWNT (røde piler) immobilisert på en silika dekkglass (# 1.5) ved hjelp av en APTES silanisering prosedyre og avbildes med en 2D InGaAs sensor array, invertert mikroskop med 100X oljeneddyppingsobjektivet ( plan apochromat, 1,4 NA), og en 500 mW, 721 nm CW laser. (B) Fluorescens bleking eksperiment av C 26 -Cy3 DNA-SWNTs bundet til en overflate ved hjelp APTES. DNA-trådene er 3 'terminalt merket med Cy3 før tube suspensjon. Sporing den inkrementelle trinnvis fotobleking (rød montert kurve) av de enkelte sensorer blir brukt til å bestemme antallet av DNA-molekyler adsorbert på overflaten av SWNTs. Bilder ble ervervet ved hjelp av en invertert mikroskop i TIRF modus med en 100X oljeneddyppingsobjektivet (plan apochromat, 1,4 NA), og 561 nm laser eksitasjon. Skala: 10 mikrometer.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SWNTs kan lett suspenderes i vandig oppløsning via direkte sonikering med SDS eller ssDNA, som indikert ved en økning i optisk tetthet gitt av den kolloidale dispersjon av det resulterende SWNT-polymer hybrid. SDS og ssDNA sprer og solubiliserer bunter av SWNTs ved å absorbere på SWNT overflaten gjennom hydrofobe eller pi-pi interaksjoner. I tillegg kan andre polymerer, slik som genomisk DNA, amfifile polymerer, konjugerte polymerer og lipider, kan adsorberes på overflaten av SWNTs ved dialyse av prøvene suspendert ved hjelp av SC eller SDS. Hydrofile polymerer slik som PEG, kan ende-modifisert med hydrofobe "ankere" som RITC eller FITC for å muliggjøre adsorpsjon overflate av blokk-kopolymeren. For polymerer som er følsomme for skjæring eller nedbrytning ved eksponering for høye krefter av sonde-spissen sonikering, eller for polymerer med lav bindingsaffinitet til SWNT, er dialyse den beste metoden for å fremstille en stabil SWNT-polymersuspensjonen. Etter polymer encapsgler, fjerner sentrifuge store SWNT bunter, amorft karbon, resterende metallkatalysator, og andre uoppløselige forurensninger for å forlate en jevnt dispergert prøve. Typiske sluttkonsentrasjoner på dispergerte SWNTs Etter sentrifuge området mellom 10-100 mg / l.
Ultralydbehandling kraft og varighet kan reguleres og optimaliseres for den spesielle valg av dispergeringsmiddel. Dette er et kritisk punkt i prosedyren for belegg SWNTs fordi for lite eller svak ultralydbehandling kan føre til dårlig spredning, mens for mye eller for kraftig lydbehandling kan føre til dårlig fluorescens. Vanligvis, lavere krefter er nødvendig for å minimere skader ved bruk av polymerer som er mottakelige for skjæring slik som DNA. Lengre sonikering varighet eller høyere intensiteter kan føre til reduksjon i lengden av SWNTs, hvor SWNTs under ~ 100 nm exciton rekombinasjon lengde blir ikke-fluorescerende. Størrelsen på sonikator sondespissen må også samsvare med prøvevolumet for å unngå spruting og skumming for optimalresultater (vanligvis gitt av produsenten). Unngå å berøre sondespissen til sidene av beholderen og plassere oppløsningen på en isblokk for å minimere oppvarming av oppløsningen. Når dispergert, oppløsninger av SWNTs er stabile ved romtemperatur på ubestemt tid.
Absorbans og emisjonsspektra av oppløsninger av dispergerte generert SWNTs inneholde flere topper, noe som indikerer nærvær av en blanding av dispergerte SWNTs av forskjellig chiralities. Alternative fremgangsmåter for SWNT generasjon eller rensemetoder kan endre kiraliteten fordeling, noe som fører til forskjellig topp eksitasjon og emisjon fluorescens-spektrene. I tillegg kan forskjellige syntesemetoder gir eksempler på SWNTs med ulik kiralitet befolkningsfordelinger. For eksempel: CoMoCAT (kobolt-molybden-katalysator) dyrket SWNTs er rike på (6,5) kiralitet, mens HiPCO (høytrykk med jern-katalysator) dyrket SWNTs er rike på (7,6) kiralitet, som fører til forskjeller i absorpsjon og photoluminescence spektra.
Visse adsorberte polymerer muliggjøre spesifikk påvisning av analytter ved å modulere fluorescensemisjonen av SWNT ved å endre den lokale miljøet ved rørets overflate. Denne tilnærmingen har den klare fordel i forhold til kovalent binding av bindende grupper av ikke permanent forstyrre den SWNT gitter, noe som kan redusere fluorescensemisjonen intensitet. 6,32 - 34 I tillegg har CoPhMoRe tilnærming potensialet for å utvikle antistoff-free sensorer for mål der det ikke allerede finnes en kjent bindende enhet. 28 Nærmere bestemt, (GT) 15-DNA har vist seg å selektivt øke fluorescensemisjonen av SWNTs i nærvær av dopamin, slik at dets anvendelse som en dopamin-sensor. Bulk fluorescens målinger viser en økning på hele 80% i topp emisjons for visse SWNT chiralities. Immobil (GT) 15 DNA SWNTs på en glassplate gjør at fluorescens hhvonse målinger av individuelle (GT) 15-DNA funksjonalisert SWNT, som viser at fluorescens kan øke med mer enn 3-ganger for enkelt SWNT sensorer i nærvær av dopamin, uten noen nevneverdig fotobleking, under kontinuerlig laserbelysning. Samspillet mellom dopamin og den SWNT sensoren er reversibel, slik det fremgår ved gjenvinning av det opprinnelige fluorescente signalet etter vasking dopamin ut av mikrofluidkammer med buffer. I tillegg kan én-molekyl målinger være en kraftig karakterisering teknikk for kvantifisering av polymer adsorpsjon (figur 4), eller kinetikken til bindingsbegivenheter. Dessuten kan proporsjonal sensing oppnås ved kjemisk å isolere en enestående SWNT kiralitet med en unik eksitasjon-emisjonstopp, funksjonalise den med (GT) 15-DNA, og isolere en andre SWNT kiralitet for å være ufølsom for dopamin. Overvåking begge SWNT chiralities gir en jevn kontroll fluorescens kanal som kan sammenlignes med m odulating fluorescens av (GT) 15 DNA SWNTs. Kombinere ulike polymerer (f.eks, polyetylenglykol og (GT) 15 DNA) kan legge til ekstra funksjonalitet som endrer diffusivitet eller cellulært opptak egenskaper, egenskaper som er avgjørende når du utfører in vivo eksperimenter.
Foreløpig en begrensning av CoPhMoRe tilnærming til sensor utvikling omfatter polymer bibliotekutvikling. Fordi bindingsenhetene ikke er kjent a priori, å utvikle en sensor for et bestemt mål kan være tidskrevende og krever et stort antall kjemisk varierte polymerer for å konstruere sensoren bibliotek for screening. I tillegg kan stabilitet og kompatibilitet av sensorer i in vivo miljø variere fra sensor til sensor. Men når en kandidat sensor har blitt identifisert, ytterligere modifikasjon strategier kan bli anvendt for å optimalisere egenskapene som er nødvendig for in vivo applikasjoner.
ve_content "> Heri har vi vist en metode for dispergering av SWNTs i vandige oppløsninger som gjelder for en rekke forskjellige dispergeringsmidler. Denne fremgangsmåten kan brukes til å lage biblioteker av dispergerte SWNTs for oppdagelsen av nye nye Nir sensorer for små molekyler og biologiske markører . av spesiell interesse er sensorer for deteksjon av nevrotransmittere, noe som kan gjøre det mulig i sanntid, rommessig nøyaktig påvisning av disse molekylene i komplekse biologiske miljøer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al. Carbon nanotubes--the route toward applications. Science. 297 (5582), 787-792 (2002).
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
