Introduction
nanotubi a parete singola di carbonio (SWNT) sono atomicamente sottili strati di atomi di carbonio arrotolati in lunghe, sottili cilindri che esibiscono uniche proprietà elettroniche e ottiche. 1 Tali proprietà includono una band-gap produzione vicino (NIR) emissione di fluorescenza a raggi infrarossi tramite ricombinazione eccitone che è molto sensibile al suo ambiente locale. L'emissione NIR di SWNTs rientra nella finestra del vicino infrarosso in cui la profondità di penetrazione della luce è massima per tessuto biologico. 2,3 Inoltre, SWNTs esibiscono diverse caratteristiche uniche atipiche in contrasto con fluorofori organici: SWNT mostra un grande spostamento di Stokes, non photobleach, e non lampeggiano. 4 Recentemente, sfruttando queste caratteristiche ha portato allo sviluppo di un assortimento di sensori molecolari con applicazioni alla biologia. 5,6 non modificato, tuttavia, SWNTs sono insolubili in acqua, e ottenendo sospensioni di singole SWNTs può essere una sfida. 7,8 Bundling e aggregazione di SWNTs in soluzione possono offuscare la loro fluorescenza band-gap, 2 rendendoli adatti per applicazioni di rilevamento.
Disperdendo i singoli nanotubi di carbonio in soluzione acquosa richiede di modificare la loro superficie per impedire l'aggregazione idrofobicità-driven. 9 Mentre modificazione covalente può rendere SWNTs idrosolubile, 10 nonché impartire specifica chimica di legame, siti di difetti nel reticolo SWNT ridurre o abate loro emissione di fluorescenza. Invece, SWNT funzionalizzazione può essere realizzato utilizzando tensioattivi, lipidi, polimeri e DNA 9,11 - 13 che adsorbono alla superficie nanotubo attraverso interazioni idrofobiche e impilamento pi-pi. L'ambiente chimico risultante circostante SWNTs superficie funzionalizzato viene indicato come sua fase corona. Perturbazioni alla fase corona possono avere un grande impatto sul eccitoni che viaggiano sulla superficie di nanotubi, causando modulazioni di SWNT Fluorescence emissioni. E 'questo rapporto sensibile tra la fase della corona e la fluorescenza SWNT che può essere sfruttato per sviluppare nuovi sensori molecolari incorporando modalità specifiche vincolanti sulla grande superficie di SWNT. Perturbazioni alla fase corona SWNT upon analita legame può portare a cambiamenti nell'ambiente dielettrico locale, caricare trasferimento, o introdurre difetti reticolari, ognuno dei quali può modulare l'emissione di fluorescenza dei SWNTs per servire come meccanismo di trasduzione del segnale. 14 Questo approccio viene utilizzato nello sviluppo di sensori fluorescenti innovative per la rilevazione di diverse classi di molecole compreso DNA, 15,16 glucosio 17 e piccole molecole come ATP, 18 specie reattive dell'ossigeno 19 e di ossido nitrico. 20,21 Tuttavia, questi approcci sono limitate dal fatto che essi si basano sull'esistenza di una modalità di legame noto per l'analita bersaglio.
Recentemente, una applicazione più genericoRoach per la progettazione di sensori fluorescenti è stato sviluppato utilizzando SWNTs non covalente funzionalizzati con eteropolimeri anfifilici, fosfolipidi e acidi polynucleic. Queste molecole aderire a superfici di nanotubi di carbonio per la produzione di sospensioni altamente stabili di singoli SWNTs 22 - 25 con fasi corona uniche che possono specificamente legano le proteine 26,27 o piccole molecole, tra cui il neurotrasmettitore dopamina. 28 - 30 Ingegneria fase corona per disperdere SWNTs e specificamente analiti target si legano si riferisce al riconoscimento molecolare fase come corona (CoPhMoRe). 28 Le piccole dimensioni, bassa tossicità, elevata stabilità e unbleaching Nir fluorescenza dei sensori CoPhMoRe SWNT li rendono ottimi candidati per il rilevamento in vivo per misure risolte nel tempo prolungati. 6 Studi recenti hanno dimostrato le loro applicazioni nei tessuti vegetali per la rilevazione ottica di specie reattive di ossigeno e azoto. 31Un'applicazione particolarmente interessante per i sensori CoPhMoRe SWNT è il potenziale per l'etichetta Free Detection di neurotrasmettitori come la dopamina in vivo, dove altre tecniche, come ad esempio il rilevamento elettrochimico o immunoistochimica, soffrono di una mancanza di risoluzione spaziale, risoluzione temporale, e la specificità.
Progettazione e scoprendo sensori CoPhMoRe SWNT è stato finora trattenuto dalle dimensioni e chimica diversità della biblioteca disperdente, limitando la probabilità di trovare un sensore per un particolare bersaglio. Fino ad oggi, i ricercatori hanno solo scalfito la superficie di coniugato disponibile, co-block, biologiche e polimeri biomimetici che potrebbero servire come disperdenti funzionalmente attivi per sensori SWNT. Qui, vi presentiamo diversi metodi sia per disperdere SWNTs e caratterizzare la loro fluorescenza per lo screening ad alto rendimento e per singola analisi sensore SWNT. In particolare, si delineano la procedura per SWNTs vernicanti oligom acido polynucleicERS utilizzando sonicazione diretta così come il modo di funzionalizzare SWNT con polimeri anfifilici attraverso lo scambio tensioattivo con la dialisi. Usiamo (GT) 15 -DNA e polietilene glicole funzionalizzata con rodamina isotiocianato (RITC-PEG-RITC) come esempi. Dimostriamo l'uso di (GT) 15 -DNA SWNTs come un sensore CoPhMoRe per il rilevamento della dopamina. Infine, si delineano procedure per eseguire misure dei sensori molecola singoli, che possono essere utilizzate per la caratterizzazione o singola rilevamento molecola.
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Protocol
Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (SDS) prima dell'uso. I nanomateriali possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte materiale sfuso. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate, tra cui i controlli tecnici (cappa aspirante, custodia rumore) e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, occhiali di protezione, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe).
1. Preparazione del tampone, tensioattivo, e Polymer Solutions
- Preparazione della soluzione 100 mM NaCl
- Sciogliere 584 mg di NaCl in 80 mL di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL.
- Preparazione di 3% dodecil solfato di sodio soluzione (SDS)
- Sciogliere 3 g di SDS in 80 ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL.
- Preparazione di colato di sodio 2% di soluzione (SC)
- Sciogliere 2 g di SODIUM cholate idrato in 80 ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 100 mL.
- Preparazione di tampone di immagini (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Sciogliere 22.23 g di Tris base e 58,44 g di NaCl in 500 ml di acqua deionizzata utilizzando un ancoretta magnetica e piatto.
- Aggiungere con cautela HCl concentrato fino a raggiungere un pH di 8,1.
- Aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume finale di 1 L.
- Sintesi di polimero RITC-PEG-RITC
- Sciogliere ammina difunctionalized polietilene glicole (PEG) (5 kDa o 20 kDa, 0,1 mol / L) e rodamina isotiocianato (RITC, 0,2 mol / L) in 1 mL di una miscela 1: 1 di diclorometano e dimetilformammide (DMF).
- Aggiungere 0,2 mol / L di N, N -diisopropylethylamine (DIEA).
- Dopo 3 h, precipitato con 10x volume di etere etilico seguita da filtrazione sotto vuoto.
- Riprendere in DMF e ripetere l'etere Follo precipitazionisposare per filtrazione a vuoto.
NOTA: Altre molecole modificate isotiocianato (ad esempio, isotiocianato di fluorescina, FITC) possono essere collegati a PEG o altri polimeri ammine modificata utilizzando un metodo simile.
- Preparazione di pegilato-DNA (PEG-DNA)
- Combinate 100 ml di Tris (2-carbossietil) soluzione di fosfina cloridrato (TCEP) (0,5 M, pH 7,0) con 44,9 ml di 5'-tiolo-modificato il DNA (1 mg / 10 ml in 0,1 M NaCl) e aggiungere a 4.855 ml di acqua deionizzata.
- Mescolare per 1 h.
- Sciogliere 500 mg di metossipolietilen glicole maleimmide in 5 mL di tampone fosfato.
- Combinare soluzioni di DNA e PEG (10 ml totale) e mescolare per 24 h.
2. Preparazione di Single Walled Nanotubi di carbonio (SWNT) Sospensioni
- Wash di SWNTs per rimuovere catalizzatore e le impurità.
- Aggiungere 200-300 mg di SWNTs non lavati in un Conta provetta di plasticaining 45 ml di acqua deionizzata.
- Vortex la soluzione per 2 minuti e sonicare utilizzando un bagno sonicatore per 5 min. Notare che sonicatore impostazioni variano da uno strumento all'altro, in modo da verificare che la densità ottica dei SWNT aumenti soluzione (cioè, diventa nero) per assicurare che i SWNTs vengono dispersi.
- Centrifugare la soluzione per 20 minuti a 16.100 xg e scartare il surnatante.
- Aggiungere circa 45 ml di acqua fresca deionizzata.
- Ripetere i punti 2.1.2-2.1.4 fino a 8 volte.
- Rimuovere l'acqua il più possibile facendo attenzione a non disturbare SWNTs pellettato e consentire SWNT pellet asciugare all'aria.
- Sospensioni degli acidi nucleici di SWNTs
- Sciogliere acidi nucleici (NA) in 0,1 M NaCl ad una concentrazione di 100 mg / mL.
- Rimuovere l'elettricità statica spatola monouso, provette da microcentrifuga e SWNT magazzino utilizzando una pistola antistatico. In una cappa aspirante, aggiungere 20 ml di soluzione di NA di 980 ml di 0.1 M NaCl seguita dalla aggiunta di 1 mg SWNTs.
- Utilizzando un ultrasonicatore con punta 3 mm di diametro, sonicare la soluzione per 10 min a 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio.
- Centrifugare la soluzione di DNA-SWNT DUE VOLTE per 90 min a 16.100 x g. Se si utilizza PEG-DNA, purificare in eccesso e il DNA non reagito e PEG utilizzando uno spin-filtro di 100 kDa. Aggiungere abbastanza PBS per riempire lo spin-filtro e far girare a 9.300 g per 1,5 min, ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte.
- Raccogliere e conservare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet contenente fasci CNT e aggregati. Eliminare il pellet in conformità con le procedure di rifiuti pericolosi istituzionali appropriate per i nanomateriali.
- Misurare l'assorbanza soluzione a 632 nm usando un UV / Vis spettrofotometro per determinare la concentrazione approssimativa di SWNTs sospesi con ε = 0.036 L / cm · mg in accordo con la legge di Lambert-Beer e il fattore di diluizione appropriata.
- Sospensioni polimeri anfifilicidi SWNTs
- Rimuovere l'elettricità statica spatola monouso, provette da centrifuga micro e SWNT magazzino. In una cappa aspirante, aggiungere 5 mg SWNTs a 5 ml di soluzione SC 2% (in alternativa, soluzione di SDS può essere utilizzato).
- Utilizzando un ultrasonicatore con punta di diametro 6 mm, sonicare la soluzione per 1 ora a 40% di ampiezza in un bagno di ghiaccio.
- campione centrifugare a 150.000 xg per 4 h utilizzando un'ultracentrifuga e raccogliere accuratamente surnatante.
- Sciogliere 1% in peso di polimero amfifilico (ad esempio, RITC-PEG-RITC) in soluzione SC-SWNT.
- Dializzare soluzione polimerica-SC-SWNT utilizzando una membrana di dialisi 3,5 kDa contro 1 L di acqua deionizzata o tampone per 5 giorni. Cambiare l'acqua o buffer dopo un'ora e 2 ore 4. Una membrana di dialisi più grande può essere utilizzato, purché permette la rimozione del tensioattivo di scelta, ma di mantenimento sia della SWNT e polimero amfifilico.
- Misurare l'assorbanza soluzione a 632 nm usando un UV / Vis spettrofotometro per determinareconcentrazione approssimativa di SWNTs sospesi con ε = 0.036 L / cm * mg in accordo con la legge di Lambert-Beer e il fattore di diluizione appropriata.
3. Preparazione della superficie Immobilizzato sensori SWNT
- Preparazione di BSA-biotina e soluzioni di riserva neutravidina
- Sciogliere 10 mg liofilizzato BSA-biotina in 1 ml di acqua deionizzata per fare un / ml soluzione madre di 10 mg e conservare a 4 ° C.
- Sciogliere 10 mg neutravidina proteine (NAV, deglicosilata proteina avidina) in 2 ml di acqua deionizzata per fare un / magazzino soluzione 5 mg ml. aliquote conservare a -20 ° C. aliquote scongelati possono essere conservati per diversi giorni a 4 ° C.
- Preparare BSA-biotina vetrini da microscopio rivestito
- Pulire un vetrino da microscopio ed allo 0,17 millimetri di vetro di copertura (o come appropriato per l'obiettivo microscopio) con acqua deionizzata, seguito da metanolo, acetone e un risciacquo finale di acqua deionizzata.
- Aggiungere 100 ml di soluzione BSA-biotina a 900 microlitri di buffer di 1x Tris ad una concentrazione finale di 1 mg / mL.
- Flusso 50 ml della soluzione di BSA-biotina nel canale pipettando la soluzione in una estremità e che la migrazione di distanza soluzione all'altro usando un tessuto. Incubare per 5 minuti seguita da 3-5 vampate con 50 ml di 0,1 M NaCl.
- Diluire 40 ml di 5 mg / ml NAV magazzino in 960 microlitri di buffer 1x Tris ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml.
- Flusso 50 microlitri della soluzione VPN nel canale pipettando la soluzione in una estremità e che la migrazione di distanza soluzione all'altro usando un tessuto. Incubare per 2-5 minutiseguiti da 3-5 vampate con 50 ml di 0,1 M NaCl.
- Diluire le soluzioni stock di SWNTs sospese in tampone di imaging ad una concentrazione di 1-10 mg / L e di flusso 50 microlitri della soluzione nel canale e incubare per 5 min.
- Delicatamente lavare via SWNTs eccesso con 50 ml di tampone di imaging.
- Preparazione di APTES silanizzata vetrini da microscopio
NOTA: APTES silanizzazione diapositive permettono un modo per immobilizzare SWNTs DNA avvolto carica negativa sulla superficie di un substrato di vetro.- Preparare una soluzione al 10% di (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) in etanolo.
- Utilizzando i canali realizzati con la procedura descritta in 3.2.2, il flusso in 100 microlitri di buffer di 1x Tris.
- Lavare il canale con soluzione APTES e incubare per 5 min. Lavare con tampone 1x Tris.
- Diluire le soluzioni madre delle sospesi DNA SWNTs nel buffer di imaging per una concentrazione di flusso / Terra 1-10 mg 50 ml di soluzione nel canale e incubmangiato per 5 min.
- Delicatamente lavare via SWNTs eccesso con 50 ml di tampone di imaging.
4. spettroscopia di fluorescenza e microscopia di SWNT Sensori
- Nir microscopia a fluorescenza
- Eseguire l'imaging di SWNTs immobilizzati superficie con eccitazione laser e un microscopio invertito dotato di una matrice di sensori InGaAs per l'imaging.
- Dirigere il raggio laser ad entrare nel porto di illuminazione posteriore di un microscopio invertito utilizzando specchi su supporti regolabili cinematiche e un paio di iridi post-montato impostati per l'altezza della porta. Assicurarsi che il fascio sia in piano e rettilineo confermando che passa attraverso entrambi iridi quando posto tra gli specchi successivi e prima che entri porta illuminazione. Se necessario, regolare l'altezza del fascio con un gruppo di periscopio. Rimuovere eventuali filtri di calore passa-corto sulla porta di illuminazione che attenuare il fascio.
- Inserire un cubetto di filtro appropriato nel microscopioper riflettere la luce di eccitazione nell'obiettivo e raccogliere la luce di emissione. Questo tipicamente costituito da un filtro dicroico passaggio lungo con un cutoff sopra la lunghezza d'onda di eccitazione, (ad esempio, 750 LP) ed un filtro lungo in emissione (ad esempio, 850 LP) per minimizzare ulteriormente luce di eccitazione diffusa da colpire il sensore. Inoltre, il filtro per le emissioni può essere scelto per essere selettivo per l'emissione di SWNTs di un particolare chiralità.
- Eseguire regolazioni di precisione per l'allineamento del fascio con l'inserimento di un cubetto di allineamento adeguato sostituire l'obiettivo con due offset, dischi smerigliato contenenti 1 mm fori di spillo. Allineare il fascio al centro di entrambi i dischi di allineamento inferiore e superiore.
- Attaccare una serie di sensori 2D InGaAs al porto di imaging laterale del microscopio utilizzando un apposito adattatore e una lente 0,5X se necessario, per adattarsi alle dimensioni del sensore.
- Utilizzando un obiettivo ad immersione 100X (1.4 NA), applicare l'olio di immersione senza fluorescenza e posizionare il immobicampione SWNT zato sul palco microscopio.
- Sollevare l'obiettivo finché la petrolifere inferiore del vetro di copertura (# 1.5, 170 spessore micron). Effettuare le regolazioni al collare obiettivo, se necessario, per le condizioni di imaging, ad esempio, temperatura, spessore del vetro, etc.
- Lentamente sollevare l'obiettivo con la sorgente di eccitazione e tenere sotto controllo il segnale di fluorescenza della telecamera InGaAs. L'intensità della fluorescenza deve aumentare gradualmente il piano focale avvicina alla superficie ed i sensori immobilizzati venire a fuoco.
- NIR spettroscopia di fluorescenza
NOTA: spettroscopia di fluorescenza può essere eseguita utilizzando la stessa configurazione microscopio ma dirigendo la luce raccolta dal corpo microscopio e in uno spettrometro e InGaAs rivelatore lineare.- Utilizzando supporti cinematiche e specchi classificati per NIR, indirizzare il percorso della luce verso la fessura d'ingresso dello spettrometro. Mettere a fuoco la luce verso il basso per un POInt sulla fessura d'ingresso utilizzando una lente di focalizzazione (ad esempio, piano-convessa, f = 150 mm). Questo allineamento si ottiene attenuando la potenza del laser <1 mW e sostituendo l'obiettivo microscopio con uno specchio 1 "e usando un cubo filtro 50/50 beam-splitting. La luce di eccitazione viene poi lasciare il microscopio attraverso l'apertura di uscita e da poter essere essere utilizzato per regolare gli specchi e lenti per focalizzare il fascio sulla fenditura d'ingresso.
- Dopo aver sostituito l'obiettivo microscopio e filtro passa lungo, mettere un piatto ben sul palco e registrare gli spettri di un campione di messa a fuoco utilizzando lo spettrometro e la matrice InGaAs.
- Misurare la risposta reversibile (GT) 15 DNA SWNTs a dopamina
- Montare il sensore canali rivestito sul palco microscopio e mettere a fuoco usando un obiettivo olio 100X e la macchina fotografica InGaAs. Aggiungere 50 ml di soluzione di 100 micron dopamina nel tampone fosfato (PBS) per il canale di flusso e registrarela variazione di intensità di fluorescenza.
- Lavare la soluzione di dopamina con tampone fosfato e osservare il cambiamento di fluorescenza dei singoli sensori SWNT.
- Lo screening Ben-plate per la risposta analiti di sensori SWNT
NOTA: Screening di diversi analiti può essere eseguita utilizzando una piastra ben trasparente controllata mediante uno stadio motorizzato. Una piastra ben ideale è trasparente visibile e IR ed ha pareti laterali nere per minimizzare la diafonia tra i pozzetti.- Pipettare volumi uguali di sensore SWNT sospensione (ad esempio, 5 mg / L concentrazione) in ogni pozzetto, sufficiente a coprire il fondo del pozzo uniformemente, tipicamente> 100 ml per una piastra a 96 pozzetti e> 30 ml per una piastra a 384 pozzetti .
- Analiti pipetta (ad esempio, 2 microlitri, 100 micron volume finale) da screening di librerie nei pozzetti. Preparare ciascun analita in triplice copia per tenere conto di potenziale well-to-ben variazione, Fluctuationi di intensità di eccitazione, o di temperatura.
- Sollevare l'obiettivo (per esempio, 20X Achroplan, 0,45 NA) durante il monitoraggio gli spettri di emissione utilizzando lo spettrometro e la matrice InGaAs. Posizione ottimale dell'obiettivo metterà piano focale circa a metà del volume del campione nel pozzetto, che dovrebbe corrispondere a un massimo di intensità misurata.
- Per ciascun pozzetto, registrare un 1-10 s esposizione a raccogliere uno spettro.
- Confrontare gli spettri di emissione per ciascun pozzetto per un controllo contenente solo SWNTs senza analita aggiuntivo per quantificare la risposta di fluorescenza.
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Representative Results
SWNTs sono state sospese in soluzione acquosa utilizzando sia tensioattivi e polimeri anfifilici per sonicazione diretta e di scambio di dialisi. La figura 1 mostra SWNTs, coltivato secondo il metodo catalizzata ferro carbonile (HiPCO), sospesa con SC, RITC-PEF20-RITC, e (GT) 15 -DNA. La densità ottica di una SWNTs con SDS (o polimero) aumenta drammaticamente dopo sonicazione e diminuisce alla rimozione degli aggregati e contaminanti attraverso la purificazione mediante centrifugazione (Figura 1). Le misure di assorbanza a 632 nm quantificabili la concentrazione di SWNT sospesa. 28
Le proprietà fotofisiche delle sospensioni SWNT sono caratterizzate con assorbanza e spettroscopia di fluorescenza. La figura 2 mostra l'assorbanza e emissione di fluorescenza spettri di SWNTs sospesi usando (GT) 15 -DNA e RITC-PEG20-RITC. the assorbanza spettri sono una sovrapposizione dei singoli picchi di assorbanza per ciascun chiralità distinta di nanotubo presente nel campione. Allo stesso modo, ogni chiralità presenta il suo unico picco di emissione di fluorescenza. Le differenze di intensità relativa picco di emissione sono il risultato di differenze nella distribuzione della popolazione di chiralities così come le differenze in termini di efficienza di eccitazione che utilizzano il laser a 721 nm.
La risposta fluorescenza (GT) 15 DNA SWNTs (dove 0 è l'intensità iniziale SWNT fluorescenza e I è l'intensità SWNT dopo aggiunta dopamina) in presenza di diverse concentrazioni di dopamina è misurato monitorando la fluorescenza del campione mediante una spettrofotometro e InGaAs schiera lineare (Figura 3). La fluorescenza totale (GT) 15 -DNA-SWNTs aumentata con l'aumentare della concentrazione di dopamina (Figura 3a). La fluorescenza response è una funzione del picco di emissione (Figura 3b), indicando che la risposta può essere chiralità specifico. La fluorescenza del 1.044 nm e 1.078 nm picchi aumento dell'intensità di 2 volte la concentrazione di dopamina avvicina 2 mM. Figura 3e illustra l'intensità dell'intero spettri di emissione di PEG (GT) 15 aumento DNA-SWNT in risposta all'aggiunta di dopamina.
SWNTs individuali rivestite utilizzando una sequenza di DNA alternativa, C 26 -DNA (preparato con gli stessi metodi a (GT) 15), legati alla superficie di un vetrino da microscopio sono misurati sotto illuminazione laser utilizzando una telecamera InGaAs e 100X obiettivo ad immersione (Figura 4). Monitoraggio singoli emettitori erano legati ad una superficie può essere utilizzato per verificare la reversibilità di risposta del sensore da molecole bersaglio dilavamento con soluzione tampone. Riflessione interna totale in fluorescenza (TIRF) microscopia può essere utilizzato anche per immagine DNA colorante coniugato adsorbito sulle SWNTs per quantificare il numero di molecole di DNA collegati a ciascun tubo attraverso esperimenti photobleaching. La figura 4 mostra 3 distinti eventi di sbiancamento di DNA Cy3-marcato desunti dai passi quantizzati di traccia intensità di fluorescenza di un singolo emettitore. Questi risultati indicano che tre molecole di DNA sono attaccati al SWNT.
Figura 1: polimeri e tensioattivi sospeso SWNTs. (A) fotografico SWNTs RITC-PEG20-RITC sospeso utilizzando 2% SC in vari punti di preparazione. A sinistra: SWNTs aggiunti direttamente alla soluzione SC prima di sonicazione. Centro: Dopo 10 min di bagno di sonicazione seguita da 10 minuti di punta della sonda sonicazione al 90% di ampiezza seguita da centrifugazione. La densità ottica della soluzione aumenta come SWNT fasci sonodisperso (~ 100 mg / L concentrazione SWNT). A destra: dopo la dialisi con polimero RITC-PEG20-RITC, la concentrazione finale di RITC-PEG-RITC SWNTs sospeso è ~ 20 mg / L. (B) Rendimento sospensione SWNT può variare a seconda del polimero utilizzato per sospendere il SWNT. La densità ottica della soluzione fornisce una buona stima della concentrazione SWNT soluzione fasi. Nella foto sono diverse concentrazioni di (GT) 15 -DNA tubi sospesi a diverse concentrazioni. Da sinistra a destra: 100 mg / L, 10 mg / L, 1 mg / L, 0 mg / L. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: assorbimento e fluorescenza spettri di emissione di tensioattivi e polimeri sospeso SWNTs. (A) rappresentante assorbanza spECTRA di SWNTs sospesi usando (GT) 15 -DNA mediante ultrasuoni diretta. La concentrazione di SWNT è 10 mg / L. Inserto: La regione UV degli spettri di assorbanza mostra la caratteristica picco di assorbanza a 260 nm DNA. (B) assorbanza spettri di RITC-PEG20-RITC SWNTs dopo lo scambio di SC con la dialisi. Nel riquadro: assorbanza di un campione diluito 10 volte di SWNTs RITC-PEG-RITC mostra l'assorbanza caratteristica della rodamina. (C) spettri di emissione Rappresentante NIR di SWNTs sospesi usando (GT) 15 -DNA mediante ultrasuoni diretta (785 nm di eccitazione). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rilevamento fluorescenza di dopamina usando (GT) 15 -DNA SWNTs avvolti. (a strong>) risposta fluorescenza di (GT) 15 -DNA SWNTs avvolti all'aggiunta di dopamina. Campioni di sensori ad una concentrazione di 5 mg / L sono stati eccitati con un 500 mW, 721 nm laser CW. La fluorescenza integrato di emissione di sensore da 900-1,350 nm aumenta con l'aggiunta di concentrazione di dopamina 1 micron a 250 micron. (B) spettri di emissione di fluorescenza di PEG (GT) 15 -DNA avvolto SWNTs prima e dopo l'aggiunta di dopamina. La concentrazione del sensore è di 10 mg / ml cui dopamina stato aggiunto ad una concentrazione finale di 100 mM. I campioni sono stati eccitati con un 500 mW, 721 nm laser CW. I due picchi massima intensità circa il doppio di intensità dopo l'aggiunta di dopamina. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4: imaging di fluorescenza dei singoli SWNTs superficie immobilizzato. (A) emissione di fluorescenza dei singoli C 26 -DNA-SWNT (frecce rosse) immobilizzato su un vetrino di silice (# 1.5) utilizzando una procedura APTES silanizzazione e ripreso con una matrice di sensori 2D InGaAs, microscopio rovesciato con un obiettivo 100X olio di immersione ( plan apochromat, 1.4 NA), e una 500 mW, 721 nm laser CW. (B) esperimento fluorescenza sbiancamento della C 26 -Cy3 DNA SWNTs legato ad una superficie utilizzando APTES. I filamenti di DNA sono 3 'terminale marcato con Cy3 prima della sospensione del tubo. Inseguire il photobleaching graduale incrementale (rosso traccia montato) dei singoli sensori viene utilizzato per determinare il numero di molecole di DNA adsorbiti sulla superficie dei SWNTs. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio invertito in modalità TIRF con un obiettivo 100X immersione in olio (piano apochromat, 1.4 NA), e 561 nm di eccitazione laser. barra della scala: 10 micron.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
SWNTs sono prontamente sospesi in soluzione acquosa tramite sonicazione diretta con SDS o ssDNA, come indicato da un aumento della densità ottica forniti dalla dispersione colloidale della risultante ibrido SWNT-polimero. SDS e ssDNA disperde e solubilizza fasci di SWNT assorbendo sulla superficie SWNT attraverso interazioni idrofobiche o pi-pi. Inoltre, altri polimeri, come DNA genomico, polimeri anfifilici, polimeri coniugati e lipidi, possono essere adsorbiti sulla superficie del SWNTs mediante dialisi di campioni sospesi utilizzando SC o SDS. polimeri idrofili, come PEG, possono essere modificati con finali "ancora" idrofobici quali RITC o FITC per consentire adsorbimento superficie del copolimero a blocchi. Per i polimeri che sono suscettibili di taglio o di degrado in seguito all'esposizione alle alte potenze di sonda-tip sonicazione, o per i polimeri a basso affinità di legame per SWNT, la dialisi è il metodo migliore per produrre una sospensione SWNT-polimero stabile. Dopo Encaps polimericilamento, centrifugazione rimuove grandi fasci SWNT, carbonio amorfo, catalizzatore metallico residuo, e altri contaminanti insolubili a lasciare un campione uniformemente disperso. concentrazioni finali tipici di SWNTs dispersi dopo gamma centrifugazione tra 10-100 mg / l.
potenza sonicazione e la durata possono essere regolati e ottimizzati per la particolare scelta di disperdente. Questo è un passo fondamentale nella procedura di SWNTs rivestimento perché troppo poco o debole sonicazione può portare a scarsa dispersione, mentre troppo o troppo potente sonicazione può portare a scarsa fluorescenza. In genere, sono necessarie per ridurre al minimo i danni quando si utilizza polimeri a rischio di taglio come il DNA potenze inferiori. durate sonicazione più lunghi o le intensità elevate possono portare alla riduzione della lunghezza del SWNTs, dove SWNTs sotto del ~ 100 nm lunghezza ricombinazione eccitone diventano non fluorescente. La dimensione della punta della sonda sonicatore deve anche corrispondere il volume del campione per evitare spruzzi e la formazione di schiuma per ottimaleRisultati (in genere fornito dal produttore). Evitare di toccare la punta della sonda ai lati del contenitore e posizionare la soluzione su un blocco di ghiaccio per minimizzare il riscaldamento della soluzione. Una volta disperso, soluzioni di SWNTs sono stabili a temperatura ambiente indefinitamente.
Assorbanza spettri di emissione e di soluzioni di SWNTs generati disperse contiene picchi multipli, indicando la presenza di una miscela di SWNTs disperse di diversi chiralities. Metodi alternativi di metodi di generazione o di purificazione SWNT può cambiare la distribuzione chiralità, portando a diversi picco di eccitazione e spettri di fluorescenza di emissione. Inoltre, diversi metodi di sintesi in grado di produrre campioni di SWNTs con diverse distribuzioni di popolazione chiralità. Per esempio: CoMoCAT (catalizzatore di cobalto-molibdeno) SWNTs coltivate sono ricchi di (6,5) chiralità, mentre SWNTs HiPCO (alta pressione con catalizzatore di ferro carbonile) coltivate sono ricchi di (7,6) chiralità, con conseguenti differenze nell'assorbimento e photspettri oluminescence.
Alcuni polimeri adsorbiti consentono il rilevamento specifico di analiti modulando l'emissione di fluorescenza del SWNT modificando l'ambiente locale sulla superficie del tubo. Questo approccio offre il vantaggio rispetto attacco covalente di porzioni vincolante da non perturbare permanentemente reticolo SWNT, che può ridurre l'intensità di emissione di fluorescenza. 6,32 - 34 Inoltre, l'approccio CoPhMoRe ha il potenziale per lo sviluppo di sensori senza anticorpi per obiettivi in cui non ci può già esistere una nota frazione vincolante. 28 In particolare, (GT) 15 -DNA ha dimostrato di migliorare selettivamente l'emissione di fluorescenza del SWNTs in presenza di dopamina, consentendo il suo utilizzo come sensore dopamina. misure di fluorescenza di massa mostrano un aumento di ben il 80% delle emissioni di picco per alcune chiralities SWNT. Immobilizzando (GT) 15 -DNA SWNTs su un vetrino consente di fluorescenza respmisurazioni Onse dei singoli (GT) 15 -DNA funzionalizzato SWNT, mostrando che la fluorescenza può aumentare di più di 3 volte per sensori SWNT singoli in presenza di dopamina, senza alcun apprezzabile photobleaching, sotto illuminazione laser continuo. L'interazione tra dopamina e il sensore SWNT è reversibile, come evidente dal recupero del segnale fluorescente originale dopo il lavaggio dopamina dalla camera microfluidica con tampone. Inoltre, le misurazioni singola molecola può essere un potente tecnica di caratterizzazione per quantificare adsorbimento polimero (Figura 4) o la cinetica di eventi di legame. Inoltre, sensing raziometrico può essere ottenuto isolando chimicamente chiralità SWNT singolare con un picco unico eccitazione-emissione, funzionalizzazione con (GT) 15 -DNA, e isolare una seconda chiralità SWNT essere insensibile a dopamina. Monitoraggio entrambi chiralities SWNT fornisce un canale di fluorescenza di controllo costante che può essere confrontato con il m odulating fluorescenza delle (GT) 15 -DNA SWNTs. La combinazione di diversi polimeri (per esempio, glicole polietilene e (GT) 15 -DNA) può aggiungere funzionalità aggiuntive come la modifica diffusività o assorbimento cellulare caratteristiche, proprietà che sono fondamentali durante l'esecuzione di esperimenti in vivo.
Attualmente, una limitazione del metodo CoPhMoRe di sviluppo per sensori includono polimeri di sviluppo biblioteca. Poiché porzioni di legame non sono noti a priori, lo sviluppo di un sensore per una particolare destinazione può richiedere molto tempo e richiedono un gran numero di polimeri varie chimicamente per costruire la libreria sensore per lo screening. Inoltre, la stabilità e la compatibilità dei sensori in ambienti vivo può variare da sensore a sensore. Tuttavia, una volta che un sensore candidato è stato identificato, ulteriori strategie di modifica possono essere impiegati per ottimizzare le proprietà come necessario per applicazioni in vivo.
ve_content "> Qui, abbiamo dimostrato un metodo per disperdere SWNTs in soluzioni acquose applicabili ad un'ampia varietà di agenti disperdenti. Questo approccio può essere utilizzato per creare librerie di SWNTs dispersi per la scoperta di nuovi nuovi sensori NIR per piccole molecole e marcatori biologici . di particolare interesse sono i sensori per la rilevazione di neurotrasmettitori, che potrebbe consentire in tempo reale, spazialmente il rilevamento preciso di queste molecole in ambienti biologici complessi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
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