Introduction
Single-walled carbon nanorør (SWNT) er atomisk tynde lag af kulstofatomer rullet ind i lange, tynde cylindre, der udviser unikke elektroniske og optiske egenskaber. 1 Sådanne egenskaber indbefatter en båndgab producerende nær infrarød (NIR) fluorescensemission via exciton rekombination, der er meget følsom over for det lokale miljø. NIR emission af SWNTs falder inden det nærinfrarøde vindue, hvor indtrængningsdybde lys er maksimal for biologisk væv. 2,3 Derudover SWNTs udviser flere unikke funktioner atypiske i modsætning til organiske fluoroforer: SWNT udviser en stor Stokes skift, ikke photobleach, og ikke blinke. 4 For nylig er at udnytte disse egenskaber har ført til udviklingen af et sortiment af hidtil ukendte molekylære sensorer med ansøgninger til biologi. 5,6 Ikke-modificeret, dog SWNTs er uopløselige i vand, og opnå suspensioner af individuelle SWNT kan være en udfordring. 7,8 Bundling og sammenlægning af SWNTs i opløsning kan obfuscate deres band-kløften fluorescens, 2 gør dem uegnede til sensing applikationer.
Dispergere enkelte kulstof-nanorør i vandig opløsning kræver ændre deres overflade for at forhindre hydrofobicitet-drevet aggregering. 9 Mens covalent modifikation kan gøre SWNTs vandopløselig, 10 samt bibringe specifik binding kemi, defektsteder i SWNT gitter reducere eller aftager deres fluorescensemission. I stedet kan SWNT funktionalisering opnås ved at anvende overfladeaktive midler, lipider, polymerer og DNA 9,11 - 13, der adsorberer til nanorør overfladen gennem hydrofobe og pi-pi stabling interaktioner. Den resulterende kemiske miljø omkring overfladeaktive funktionaliserede SWNTs omtales som dens corona fase. Forstyrrelser til corona fase kan have en stor indflydelse på excitoner rejser på nanorør overflade, forårsager modulationer at SWNT fluorescence emission. Det er dette følsomme forhold mellem corona fase og SWNT fluorescens, som kan udnyttes til at udvikle nye molekylære sensorer ved at inkorporere specifikke bindende modaliteter på den store overfladeareal af SWNT. Perturbationer til SWNT corona fase efter binding analyt kan føre til ændringer i det lokale dielektriske miljø, charge transfer, eller indføre gitterdefekter, som alle kan modulere fluorescensemissionen af SWNT til at tjene som et signal transduktion mekanisme. 14 Denne fremgangsmåde anvendes til udvikling af hidtil ukendte fluorescerende sensorer til påvisning af mange forskellige klasser af molekyler, herunder DNA, 15,16 glucose 17 og små molekyler, såsom ATP, 18 reaktive oxygenarter 19 og nitrogenoxid. 20,21 Men disse tilgange begrænset, at de er afhængige af, at der findes en kendt bindende modalitet for målanalysanden.
For nylig har en mere generisk appskalle til at designe fluorescerende sensorer blev udviklet ved anvendelse SWNTs ikke-kovalent funktionaliseret med amfifile heteropolymerer, phospholipider og polynucleinsyrer. Disse molekyler adsorbere til kulstof nanorør overflader for at producere meget stabile suspensioner af individuelle SWNT 22 - 25 med unikke corona faser, der specifikt kan binde proteiner 26,27 eller små molekyler, herunder neurotransmitteren dopamin. 28-30 Engineering corona fase at sprede SWNTs og specifikt binder målanalytter kaldes molekylær anerkendelse som corona fase (CoPhMoRe). 28 Den lille størrelse, lav toksicitet, høj stabilitet og unbleaching NIR fluorescens af CoPhMoRe SWNT sensorer gør dem fremragende kandidater til in vivo-sensing i længere tid-løst målinger. 6 Nyligt arbejde har vist deres ansøgninger i plantevæv til optisk detektion af reaktive kvælstof og ilt arter. 31En særlig spændende ansøgning om CoPhMoRe SWNT sensorer er potentialet for etiketten gratis påvisning af neurotransmittere såsom dopamin in vivo, hvor andre teknikker, såsom elektrokemisk sensing eller immunhistokemi, lider af en mangel på rumlig opløsning, tidsmæssig opløsning, og specificitet.
Design og opdager CoPhMoRe SWNT sensorer har hidtil været begrænset af størrelsen og kemiske diversitet af dispergeringsmiddel bibliotek, begrænser sandsynligheden for at finde en sensor til et bestemt mål. Til dato har forskerne kun kradset i overfladen af tilgængelige konjugerede, co-blok, biologiske og biomimetiske polymerer, der kunne tjene som funktionelt aktive dispergeringsmidler til SWNT sensorer. Her præsenterer vi forskellige metoder til både at sprede SWNTs og karakterisere deres fluorescens til high throughput screening og til enkelt SWNT sensor analyse. Konkret har vi skitsere proceduren for belægning SWNTs med Polynukleinsyre oligomERS bruge direkte lydbehandling, samt hvordan man funktionalisere SWNT med amfifile polymerer gennem tensid udveksling ved dialyse. Vi bruger (GT) 15-DNA og polyethylenglycol funktionaliseret med rhodamin-isothiocyanat (RITC-PEG-RITC) som eksempler. Vi demonstrerer anvendelsen af (GT) 15-DNA SWNTs som CoPhMoRe sensor til påvisning af dopamin. Endelig skitseres procedurerne til udførelse af enkelt molekyle sensormålinger, som kan anvendes til karakterisering eller enkelt molekyle sensing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Se venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (SDS) før brug. Nanomaterialer kan have yderligere risici i forhold til deres bulkmateriale modstykke. Brug alle passende sikkerhedsforanstaltninger, herunder tekniske kontroller (stinkskab, støj kabinet) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, beskyttelsesbriller, kittel, fuld længde bukser, lukket-tå sko).
1. Fremstilling af puffer, overfladeaktivt middel og Polymer Solutions
- Fremstilling af 100 mM NaCl-opløsning
- Opløs 584 mg af NaCl i 80 ml deioniseret vand. Føj deioniseret vand for at bringe den samlede volumen til 100 ml.
- Fremstilling af 3% natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning
- Opløses 3 g SDS i 80 ml deioniseret vand. Føj deioniseret vand for at bringe den samlede volumen til 100 ml.
- Fremstilling af 2% natriumcholat (SC) opløsning
- Opløs 2 g sodium cholat-hydrat i 80 ml deioniseret vand. Føj deioniseret vand for at bringe den samlede volumen til 100 ml.
- Fremstilling af billeddannelse puffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl)
- Opløs 22.23 g Tris-base og 58,44 g NaCI i 500 ml deioniseret vand under anvendelse af en magnetisk omrørerstav og plade.
- Derefter tilsættes forsigtigt koncentreret HCI indtil en pH på 8,1 er nået.
- Føj deioniseret vand for at nå et endeligt volumen på 1 L.
- Syntese af RITC-PEG-RITC polymer
- Opløs amin difunctionalized polyethylenglycol (PEG) (5 kDa eller 20 kDa, 0,1 mol / liter) og rhodamin isothiocyanat (RITC, 0,2 mol / l) i 1 ml af en 1: 1 blanding af dichlormethan og dimethylformamid (DMF).
- Tilsæt 0,2 mol / l N, N-diisopropylethylamin (DIEA).
- Efter 3 timer udfældes med 10x volumen af diethylether efterfulgt af vakuumfiltrering.
- Genopløses i DMF og gentag ether nedbør Followed ved vakuumfiltrering.
BEMÆRK: Andre isothiocyanat modificerede molekyler (fx fluoresceinisothiocyanat, FITC) kan knyttes til PEG eller andre amin-modificerede polymerer under anvendelse af en lignende metode.
- Fremstilling af pegyleret-DNA (PEG-DNA)
- Kombiner 100 pi Tris (2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP) opløsning (0,5 M, pH 7,0) med 44,9 pi 5'-thiol-modificerede DNA (1 mg / 10 pi i 0,1 M NaCl) og tilsæt til 4,855 ml deioniseret vand.
- Der omrøres i 1 time.
- Opløs 500 mg methoxypolyethylenglycol-maleimid i 5 ml phosphatbufret saltvand.
- Kombiner DNA- og PEG-opløsninger (10 ml i alt) og omrør i 24 timer.
2. Udarbejdelse af Single Walled Carbon nanorør (SWNT) Karantæner
- Vask af SWNT til fjernelse af katalysator og urenheder.
- Tilføj 200-300 mg uvaskede SWNT i en plastik centrifugerør contalingen 45 ml deioniseret vand.
- Vortex opløsningen i 2 min og sonikeres ved anvendelse af en badlydbehandlingsapparat i 5 min. Bemærk, at sonikator indstillinger varierer fra instrument til instrument, så tjek, at den optiske tæthed af SWNT løsning stiger (dvs. bliver sort) for at sikre, at de SWNTs bliver spredt.
- Centrifugeres opløsningen i 20 minutter ved 16.100 x g og kassér supernatanten.
- Der tilsættes ca. 45 ml frisk deioniseret vand.
- Gentag trin 2.1.2-2.1.4 op til 8 gange.
- Fjern så meget vand som muligt og pas på ikke at forstyrre pelleteret SWNT og tillade SWNT pellet lufttørre.
- Nucleinsyre-suspensioner af SWNTs
- Opløs nukleinsyrer (NA) i 0,1 M NaCl til en koncentration på 100 mg / ml.
- Fjern statisk elektricitet fra disponible spatel, mikrocentrifugerør og SWNT stock anvendelse af et anti-statiske pistol. I et stinkskab, tilsættes 20 pi af NA opløsning til 980 pi 0.1 M NaCl efterfulgt af tilsætning af 1 mg SWNTs.
- Ved anvendelse af en ultrasonikator med spids diameter 3 mm, sonikeres opløsningen i 10 minutter ved 40% amplitude i et isbad.
- Centrifugeres DNA-SWNT opløsning to gange i 90 minutter ved 16.100 x g. Hvis der anvendes PEG-DNA, oprense overskydende og uomsat DNA og PEG under anvendelse af en 100 kDa spin-filter. Tilsæt så PBS til at fylde spin-filter og centrifugering ved 9300 xg i 1,5 min, Gentag dette vasketrin 3 gange.
- Indsamle og holde supernatanten, og pas på ikke at forstyrre pellet indeholder CNT bundter og aggregater. Kassér pillen i overensstemmelse med de institutionelle farligt affald procedurer, der svarer til nanomaterialer.
- Mål opløsningens absorbans ved 632 nm ved anvendelse af et UV / Vis-spektrofotometer til bestemmelse omtrentlige koncentration af suspenderede SWNTs vha ε = 0,036 L / cm · mg i overensstemmelse med Lambert-Beers lov og den passende fortyndingsfaktor.
- Amfifile polymer suspensioneraf SWNTs
- Fjern statisk elektricitet fra disponible spatel, mikro centrifugerør, og SWNT lager. I et stinkskab, tilsættes 5 mg SWNTs til 5 ml 2% SC-opløsning (alternativt SDS-opløsning kan anvendes).
- Ved anvendelse af en ultrasonikator med spids diameter 6 mm, sonikeres opløsningen i 1 time ved 40% amplitude i et isbad.
- Centrifuge prøven ved 150.000 xg i 4 timer under anvendelse af en ultracentrifuge og omhyggeligt samle bundfald.
- Opløs 1 vægt% af amfifil polymer (f.eks RITC-PEG-RITC) i SC-SWNT opløsning.
- Dialysere polymer-SC-SWNT løsning med en 3,5 kDa dialysemembran mod 1 l deioniseret vand eller puffer i 5 dage. Skift vandet ud eller puffer efter time 2 og time 4. En større dialysemembran kan anvendes, så længe den tillader fjernelse af det overfladeaktive middel af valg, men fastholdelse af både SWNT og amfifile polymer.
- Mål opløsningens absorbans ved 632 nm ved anvendelse af et UV / Vis-spektrofotometer til bestemmelseomtrentlige koncentration af suspenderede SWNTs hjælp ε = 0,036 L / cm * mg i overensstemmelse med Lambert-Beers lov og den passende fortyndingsfaktor.
3. Udarbejdelse af Surface immobiliseret SWNT Sensorer
- Fremstilling af BSA-biotin og NEUTRAVIDIN stamopløsninger
- Opløs 10 mg frysetørret BSA-biotin i 1 ml deioniseret vand for at lave en 10 mg / ml stamopløsning og opbevares ved 4 ° C.
- Opløs 10 mg NeutrAvidin protein (NAV, deglycosyleret avidin protein) i 2 ml deioniseret vand til fremstilling af en 5 mg / ml stamopløsning. Opbevar portioner ved -20 ° C. Optøede alikvoter kan opbevares i adskillige dage ved 4 ° C.
- Forbered BSA-biotin mikroskopobjektglas
- Rens et objektglas og 0,17 mm dækglas (eller som passende til mikroskopobjektivet) med deioniseret vand, efterfulgt af methanol, acetone og en endelig skylning af deioniseret vand.
- Tilsæt 100 pi BSA-biotin stamopløsning til 900 pi 1x Tris-buffer til en slutkoncentration på 1 mg / ml.
- Flow 50 pi af BSA-biotin-opløsning ind i kanalen ved pipettering af opløsningen i den ene ende og fugtspredende væk opløsning ved den anden ved hjælp af et væv. Der inkuberes i 5 minutter efterfulgt af 3-5 tømninger med 50 pi 0,1 M NaCl.
- Fortynd 40 pi af 5 mg / ml NAV stamopløsning i 960 pi 1x Tris-buffer til en slutkoncentration på 0,2 mg / ml.
- Flow 50 pi af NAV opløsning ind i kanalen ved pipettering af opløsningen i den ene ende og fugtspredende væk opløsning ved den anden ved hjælp af et væv. Inkuber i 2-5 minutterefterfulgt af 3-5 tømninger med 50 pi 0,1 M NaCl.
- Fortynd stamopløsninger af suspenderede SWNTs i billeddannelse puffer til en koncentration på 1-10 mg / l og flow 50 pi af opløsningen ind i kanalen og inkuber i 5 minutter.
- Forsigtigt skylles væk overskydende SWNT under anvendelse af 50 pi af billeddannelse puffer.
- Fremstilling af APTES silaniseret objektglas
BEMÆRK: APTES silaniseret objektglas tillade en måde at immobilisere negativt ladede DNA-indpakkede SWNTs til overfladen af et glasunderlag.- Der fremstilles en 10% opløsning af (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES) i ethanol.
- Brug kanaler fremstillet ved hjælp af trinene i 3.2.2, flow i 100 pi 1x Tris buffer.
- Skyl kanal med APTES-opløsning og inkuberes i 5 min. Vask med 1x Tris-buffer.
- Fortynd stamopløsninger af suspenderede DNA-SWNTs i billedbehandling buffer til en koncentration på 1-10 mg / Land flow 50 pi af opløsningen i kanalen og incubspiste i 5 minutter.
- Forsigtigt skylles væk overskydende SWNT under anvendelse af 50 pi af billeddannelse puffer.
4. fluorescensspektroskopi og mikroskopi af SWNT Sensorer
- Nir Fluorescens mikroskopi
- Udfør billeddannelse af overfladen immobiliserede SWNTs bruger laser excitation og et omvendt mikroskop udstyret med en InGaAs sensor array til billeddannelse.
- Laserstrålen direkte at indtaste bagsiden belysning port af et omvendt mikroskop ved anvendelse af spejle på justerbare kinematiske mounts og et par eftermonteres iris sat til porten højde. Sørg strålen er plan og lige ved at bekræfte den passerer gennem begge iris, når de placeres mellem efterfølgende spejle og før den kommer ind i belysningen port. Hvis det er nødvendigt, justeres strålen højde ved hjælp et periskop forsamling. Fjern eventuelle korte pass varme filtre på belysningen port, der ville svække strålen.
- Indsætte et passende filter terning i mikroskopetat reflektere ekscitationslyset ind i målet og indsamle emissionslyset. Dette består typisk af en dikroisk lang pass filter med en cutoff ovenfor excitationsbølgelængden, (f.eks 750 LP) og en emissionsbølgelængde lang pasning filter (f.eks 850 LP) for yderligere at minimere spredt excitationslys fra at ramme sensoren. Derudover kan emissionsfilter vælges til at være selektive for emissionen af SWNT af en bestemt chiralitet.
- Udfør fine justeringer af lyshøjden ved at indsætte en passende tilpasning terning erstatter målet med to offset, matteret diske med 1 mm små huller. Juster strålen til centrum af både den nedre og øvre alignment diske.
- Vedhæft en 2D InGaAs sensor array til den side imaging port mikroskopet med en passende adapter og en 0,5X linse hvis det er nødvendigt for at imødekomme sensoren størrelse.
- Ved hjælp af en 100X nedsænkning olie mål (1,4 NA), gælder fluorescens-fri fordybelse olie og placere immobilized SWNT prøve på mikroskopet scenen.
- Hæv mål indtil olien i kontakt med bunden af dækslet glas (# 1,5, 170 um tykkelse). Foretag justeringer af objektive krave om nødvendigt for imaging forhold, fx temperatur, glas tykkelse mv
- Langsomt hæve målet med excitationskilden på og overvåge fluorescenssignalet af InGaAs kamera. Fluorescensintensitet bør gradvist øge som brændplanet nærmer sig overfladen og de immobiliserede sensorer kommer i fokus.
- Nir fluorescensspektroskopi
BEMÆRK: Fluorescensspektroskopi kan udføres under anvendelse af samme mikroskop setup men ved at rette det opsamlede lys ud af mikroskopet legeme og ind i et spektrometer og InGaAs lineære array detektor.- Brug kinematiske mounts og spejle normeret til NIR, rette lyset vej mod indgangen slids af spektrometer. Fokuser lyset ned til en point onto indgangen slids anvendelse af en fokuseringslinse (f.eks plankonveks, f = 150 mm). Denne tilpasning opnås ved at dæmpe laser magt til <1 mW og udskiftning af mikroskop mål med en 1 "spejl og bruge en 50/50 stråle-splitting filter terning. Vil Ekscitationslyset derefter forlade mikroskopstativet gennem exit port og kan anvendes til at justere spejlene og linsen for at fokusere strålen på indgangen slids.
- Efter udskiftning af mikroskop mål og lang pass filter, placere en plade ind på scenen og optage spektre af en prøve i fokus ved hjælp af spektrometer og InGaAs array.
- Måling af reversible reaktion af (GT) 15 DNA-SWNTs til dopamin
- Mount sensor belagt kanaler på mikroskopet scenen og sætte fokus ved hjælp af en 100X olie objektiv og InGaAs kamera. Der tilsættes 50 pi af 100 pM dopamin-opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS) til strømningskanalen og optageændringen i fluorescens-intensitet.
- Skyl dopamin opløsning under anvendelse phosphatbufret saltvand og observere ændringen i fluorescens af de individuelle SWNT sensorer.
- Well-plade screening for analyt reaktion af SWNT sensorer
BEMÆRK: Screening af forskellige analytter kan udføres under anvendelse af en transparent plade med styret anvendelse af en motoriseret trin. En ideel brønds plade er transparent for synligt og IR og har sorte sidevægge for at minimere krydstale mellem brøndene.- Pipette lige volumener af suspenderede SWNT sensor (f.eks 5 mg / l koncentration) til i hver brønd, nok dække bunden af brønden ensartet, typisk> 100 pi for en plade med 96 brønde og> 30 pi til 384-brønds plade .
- Pipette analytter (f.eks 2 pi, 100 uM slutvolumen) fra screening bibliotek ind i brøndplader. Forbered hver analyt i tre eksemplarer til at redegøre for mulighederne velhavende godt variation, fluctuationer af excitation intensitet eller temperatur.
- Hæv mål (f.eks 20X achroplan, 0,45 NA), mens overvågning af emission spektre ved hjælp af spektrometer og InGaAs array. Optimale position af målet vil sætte brændplanet omtrent i midten af prøven volumen i brønden, hvilket skulle svare til et maksimum i målte intensitet.
- For hver prøve godt, optage en 1-10 s eksponering til at indsamle et spektrum.
- Sammenlign emissionsspektrene for hver brønd til en kontrol indeholdende kun SWNTs uden yderligere analyt at kvantificere fluorescens respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SWNTs blev suspenderet i vandig opløsning ved hjælp af både overfladeaktive midler og amfifile polymerer ved direkte lydbehandling og efter dialyse udveksling. Figur 1 viser SWNTs, dyrket ved hjælp af jern carbonyl katalyseret metode (HiPCO), suspenderet ved hjælp SC, RITC-PEF20-RITC, og (GT) 15-DNA. Den optiske densitet af en SWNTs med SDS (eller polymer) forøger dramatisk efter lydbehandling og falder efter fjernelse af aggregater og kontaminanter gennem oprensning ved centrifugering (figur 1). Målinger af absorbans ved 632 nm kvantificerede koncentrationen af suspenderet SWNT. 28
De fotofysiske egenskaber af SWNT suspensioner er kendetegnet ved anvendelse af absorbans og fluorescens spektroskopi. Figur 2 viser absorbansen og fluorescensemissionsspektrer af SWNT suspenderede anvendelse af (GT) 15-DNA og RITC-PEG20-RITC. the absorbansspektre er en overlejring af de enkelte absorbanstoppe for hver distinkt chiralitet af nanorør til stede i prøven. Tilsvarende hver chiralitet udviser sin unikke peak fluorescensemission. Forskelle i relativ peak emission intensitet er et resultat af forskelle i befolkningens fordeling af chiraliteter samt forskelle i excitation effektivitet ved hjælp af 721 nm laser.
Fluorescensresponset af (GT) 15 DNA-SWNTs (hvor I 0 er den indledende SWNT fluorescensintensitet og jeg er SWNT intensitet efter dopamin tilsætning) i nærvær af forskellige koncentrationer af dopamin måles ved at overvåge fluorescensen af en prøve ved hjælp spektrofotometer og InGaAs lineære array (figur 3). Den samlede fluorescens af (GT) 15-DNA-SWNTs steg med stigende dopamin-koncentration (figur 3a). Fluorescensen response er en funktion af spidsværdien for udsendelse (figur 3b), hvilket viser, at responset kan være chiralitet specifikke. Fluorescensen af 1.044 nm og 1.078 nm toppe stigning i intensitet 2-fold som dopamin koncentration nærmer 2 uM. Figur 3e viser intensiteten af hele emissionsspektre af PEG- (GT) 15 DNA-SWNT stigning som reaktion på tilsætningen af dopamin.
Individuelle SWNT overtrukne hjælp af en alternativ DNA-sekvens, er C 26-DNA (fremstillet ved anvendelse af de samme metoder på (GT) 15), bundet til overfladen af et objektglas målt under laserbelysning ved anvendelse af en InGaAs kamera og 100X oliebestandighedsobjektets (figur 4). Overvågning enkelt emittere bundet til en overflade kan anvendes til at verificere reversibiliteten af føler respons ved vask målmolekyler væk ved hjælp pufferopløsning. Samlet indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroereksemplar kan også anvendes til at afbilde dye-konjugeret DNA adsorberet på SWNT at kvantificere antallet af DNA-molekyler, der er knyttet til hvert rør gennem fotoblegning eksperimenter. Figur 4 viser 3 forskellige blegning begivenheder af Cy3-mærket DNA udledes af de kvantiserede trin i fluorescensintensitet spor af en enkelt emitter. Disse resultater indikerer, at tre DNA-molekyler er bundet til SWNT.
Figur 1: Polymer og Surfactant Suspended SWNTs. (A) Fotografi af RITC-PEG20-RITC SWNTs suspenderet anvendelse af 2% SC på forskellige punkter af forberedelse. Venstre: SWNTs tilsættes direkte til SC opløsning før sonikering. Center: Efter 10 minutter af badsonikering efterfulgt af 10 min probespidsen lydbehandling ved 90% amplitude efterfulgt af centrifugering. Den optiske densitet af opløsningen stiger som SWNT bundter erdispergeret (~ 100 mg / l SWNT koncentration). Højre: Efter dialyse med RITC-PEG20-RITC polymer, slutkoncentrationen af RITC-PEG-RITC suspenderet SWNTs er ~ 20 mg / l. (B) udbytte SWNT suspension kan variere afhængigt af den anvendte polymer til at suspendere SWNT. Den optiske densitet af opløsningen giver et godt estimat af opløsning-fase SWNT koncentration. På billedet er forskellige koncentrationer af (GT) 15-DNA suspenderede rør ved forskellige koncentrationer. Fra venstre til højre: 100 mg / l, 10 mg / l, 1 mg / l, 0 mg / l. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Absorption og fluorescensemissionsspektrer af overfladeaktivt middel og polymer suspenderet SWNTs. (A) Repræsentant absorbans spECTRA af SWNTs suspenderede hjælp (GT) 15-DNA ved direkte lydbehandling. Koncentrationen af SWNT er 10 mg / l. Indsat: UV-området af absorbansen spektrene viser den karakteristiske DNA absorbanstop ved 260 nm. (B) Absorbans spektre af RITC-PEG20-RITC SWNT efter udveksling af SC ved dialyse. Indsat: Absorbans af en 10x fortyndet prøve af RITC-PEG-RITC SWNTs viser den karakteristiske absorbans rhodamin. (C) repræsentant NIR emissionsspektre af SWNT suspenderede anvendelse af (GT) 15-DNA ved direkte lydbehandling (785 nm excitation). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescens påvisning af dopamin hjælp (GT) 15-DNA indpakket SWNTs. (a strong>) Fluorescence reaktion (GT) 15-DNA indpakket SWNTs af tilsætning af dopamin. Prøver af sensorer ved en koncentration på 5 mg / l var begejstrede ved hjælp af en 500 mW, 721 nm CW laser. Den integrerede fluorescens af føler emission fra 900-1,350 nm stiger med tilsat dopamin koncentration 1 uM til 250 uM. (B) fluorescensemissionsspektrer af PEG- (GT) 15-DNA indpakket SWNTs før og efter tilsætningen af dopamin. Koncentrationen af sensoren er 10 mg / ml, som dopamin blev tilsat til en slutkoncentration på 100 uM. Prøverne blev exciteret ved anvendelse af en 500 mW, 721 nm CW-laser. De to højeste intensitet maksimum cirka dobbelt i intensitet efter tilsætning af dopamin. Klik her for at se en større version af dette tal.
g "/>
Figur 4: Fluorescens billeddannelse af enkelte overfladeaktive immobiliserede SWNTs. (A) Fluorescence emission af individuelle C 26-DNA-SWNT (røde pile) immobiliseret på en silica dækglas (# 1.5) under anvendelse af en APTES silanisering procedure og afbildes under anvendelse af en 2D InGaAs sensor array, omvendt mikroskop med en 100X oliebestandighedsobjektets ( plan Apochromat, 1,4 NA), og en 500 mW, 721 nm CW-laser. (B) Fluorescence blegning eksperiment C 26 -CY3j DNA-SWNTs tøjret til en overflade ved hjælp APTES. DNA-strengene er 3 'terminalt mærket med Cy3 før røret suspension. Sporing den inkrementelle trinvis fotoblegning (rød monteret spor) af individuelle sensorer anvendes til at bestemme antallet af DNA-molekyler absorberet på overfladen af SWNT. Billeder er erhvervet ved hjælp af et omvendt mikroskop i TIRF tilstand med en 100X nedsænkning olie mål (plan Apochromat, 1,4 NA), og 561 nm laser excitation. Målestokken: 10 um.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55030/55030fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SWNTs let suspenderes i vandig opløsning via direkte lydbehandling med SDS eller ssDNA, som indikeret ved en forøgelse i optisk densitet, som den kolloide dispersion af den resulterende SWNT-polymer-hybrid. SDS og ssDNA dispergeres og solubiliserer bundter af SWNT ved adsorption på SWNT overfladen gennem hydrofobe eller pi-pi-interaktioner. Endvidere kan andre polymerer, såsom genomisk DNA, amfifile polymerer, konjugerede polymerer og lipider, kan adsorberes på overfladen af SWNT ved dialyse af prøver suspenderede hjælp SC eller SDS. Hydrofile polymerer, såsom PEG, kan end-modificeret med hydrofobe "ankre" såsom RITC eller FITC at muliggøre overflade adsorption af blokcopolymeren. For polymerer, der er modtagelige for forskydning eller nedbrydning ved udsættelse for de høje kræfter probe-spids lydbehandling, eller for polymerer med lave bindingsaffiniteter til SWNT, dialyse er den bedste metode til at producere en stabil SWNT-polymer suspension. Efter polymer encapsfolkning centrifugering fjerner store SWNT bundter, amorf carbon, restkoncentrationer metalkatalysator og andre uopløselige kontaminanter til at give en ensartet dispergeret prøve. Typiske slutkoncentrationer på dispergerede SWNTs efter centrifugering intervallet mellem 10-100 mg / l.
Sonication effekt og varighed kan justeres og optimeres til den bestemte valg af dispergeringsmiddel. Dette er et afgørende skridt i proceduren for belægning SWNTs fordi for lidt eller svag lydbehandling kan resultere i dårlig spredning, mens for meget eller for kraftig lydbehandling kan føre til dårlig fluorescens. Typisk er nødvendige for at minimere skader ved brug af polymerer er modtagelige for klipning såsom DNA lavere beføjelser. Længere lydbehandling varigheder eller højere intensiteter kan føre til reduktion i længden af SWNT, hvor SWNTs under ~ 100 nm exciton rekombination længde bliver ikke-fluorescerende. Størrelsen af sonikator sondens spids skal også svare til prøvevolumenet for at undgå sprøjt og skumdannelse til optimalresultater (typisk leveres af fabrikanten). Undgå at berøre sondens spids til siderne af beholderen og placer opløsningen på en is blok for at minimere opvarmning af opløsningen. Når dispergeret, opløsninger af SWNT er stabile ved stuetemperatur i det uendelige.
Absorbans og emission spektre af opløsninger af dispergerede genererede SWNTs indeholde multiple toppe, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en blanding af dispergerede SWNTs af forskellige chiraliteter. Alternative metoder til SWNT generation eller oprensningsmetoder kan ændre chiralitet fordeling, hvilket fører til forskellige peak excitation og emission fluorescens spektre. Derudover kan forskellige syntesemetoder give prøver af SWNT med forskellige chiralitet populationsfordelinger. For eksempel: CoMoCAT (cobalt-molybdæn katalysator) dyrkes SWNTs er rige på (6,5) chiralitet, mens HiPCO (højtryks med jerncarbonyl katalysator) dyrkes SWNTs er rige på (7,6) chiralitet, hvilket fører til forskelle i absorptionen og photoluminescence spektre.
Visse adsorberede polymerer muliggøre specifik påvisning af analytter ved modulering fluorescensemissionen af SWNT ved at ændre det lokale miljø på røroverfladen. Denne fremgangsmåde har den klare fordel i forhold kovalent binding af bindingsdele ved ikke permanent forstyrre SWNT gitter, som kan reducere fluorescensemission intensitet. 6,32 - 34 Derudover CoPhMoRe tilgang har potentiale for at udvikle antistof-fri sensorer til mål, hvor der måske ikke allerede findes en kendt bindende del. 28 Specifikt (GT) 15-DNA er blevet vist selektivt at forøge fluorescensemissionen af SWNTs i nærvær af dopamin, hvilket muliggør dets anvendelse som en dopamin sensor. Bulk fluorescens målinger viser en stigning på hele 80% i peak emission for visse SWNT chiraliteter. Immobiliserende (GT) 15-DNA SWNTs på et objektglas muliggør fluorescens hhvonse målinger af individuelle (GT) 15-DNA funktionaliseret SWNT, der viser, at fluorescens kan stige med mere end 3-fold for enkelt SWNT sensorer i nærvær af dopamin, uden væsentlig fotoblegning, under kontinuerlig laser belysning. Samspillet mellem dopamin og SWNT sensoren er reversibel, som tydeligt ved genopretning af den oprindelige fluorescerende signal efter vask dopamin ud af mikrofluid kammer med buffer. Derudover kan enkelt-molekyle målinger være en stærk karakterisering teknik til kvantificering polymer adsorption (figur 4) eller kinetik bindende begivenheder. Desuden kan ratiometrisk sensing opnås ved kemisk at isolere en ental SWNT chiralitet med en unik peak excitation-emission, funktionalisering det med (GT) 15-DNA, og isolering af en anden SWNT chiralitet at være ufølsom over for dopamin. Overvågning begge SWNT chiraliteter giver en stabil styring fluorescens kanal, der kan sammenlignes med m odulating fluorescens af de (GT) 15-DNA SWNTs. Ved at kombinere forskellige polymerer (fx polyethylenglycol og (GT) 15-DNA) kan tilføje yderligere funktionalitet såsom modificerende diffusivitet eller cellulære optagelse egenskaber, egenskaber, der er afgørende, når du udfører in vivo forsøg.
I øjeblikket en begrænsning af CoPhMoRe tilgang til sensor udvikling omfatter polymer biblioteksudvikling. Fordi bindingsdele ikke kendes på forhånd, at udvikle en sensor til et bestemt mål kan være tidskrævende og kræver et stort antal kemisk forskellige polymerer til konstruktion af sensoren bibliotek til screening. Derudover kan stabiliteten og kompatibiliteten af sensorer i in vivo miljøer variere fra sensor til sensor. Men når en kandidat sensor er blevet identificeret, yderligere modifikation strategier kan anvendes til at optimere egenskaber som er nødvendige for in vivo anvendelser.
ve_content "> Heri har vi vist en metode til dispergering SWNTs i vandige opløsninger gælder for en bred vifte af dispergeringsmidler. kan denne fremgangsmåde anvendes til at skabe biblioteker af dispergerede SWNT for opdagelsen af hidtil ukendte nye NIR sensorer til små molekyler og biologiske markører . af særlig interesse er sensorer til detektion af neurotransmittere, som kunne gøre det muligt realtid, rumligt præcis registrering af disse molekyler i komplekse biologiske miljøer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L6026 | |
| sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445 | |
| tris base (Trizma base) | Sigma Aldrich | 93362 | |
| hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2 | Nanocs Inc | PG2-AM-5k | |
| rhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | 283924 | |
| fluorescein isothiocyanate | Sigma Aldrich | F7250 | |
| dichloromethane | Sigma Aldrich | 676853 | |
| dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | |
| diethyl ether | Sigma Aldrich | 673811 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| 5’-thiol-modified DNA | Integrated DNA Technologies | ||
| methoxypolyethylene glycol maleimide | Sigma Aldrich | 63187 | |
| 100 kDa spin filters | Millipore | ||
| HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes | Integris | HiPco SuperPurified | |
| phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5493 | |
| anti static gun | Milty | Milty Zerostat 3 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| ultra sonicator | Cole Parmer | CV18 | |
| dialysis cassettes | Thermo scientific | Slide-A-Lyzer G2 87722 | |
| BSA-biotin | Thermo scientific | 29130 | |
| Neutravidin protein | Thermo scientific | 31000 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) | Sigma Aldrich | 440140 | |
| inverted microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | |
| kinematic mirrors | ThorLabs | KM200-E03 | |
| periscope | ThorLabs | RS99 | |
| immersion oil | Zeiss | Immersol 518f | |
| 100X objective | Zeiss | Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000 | |
| 20X objective | Zeiss | N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000 | |
| cover glass | Healthrow Scientific | HS159879H | |
| dopamine hydrochloride | Sigma Aldrich | H8502 | |
| infrared 2D array camera | Princeton Instruments | NIRvana | |
| infrared 1D sensor array | Princeton Instruments | PyLoN IR | |
| nIR spectrograph | Princeton Instruments | SCT-320 | |
| planoconvex lens | ThorLabs | LA1384 | |
| well plates (glass bottom) | Corning | 4580 |
References
- Dresselhaus, M. S., Dresselhaus, G., Avouris, P. Carbon Nanotubes. 80, Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2001).
- O'Connell, M. J., Bachilo, S. M., et al. Band gap fluorescence from individual single-walled carbon nanotubes. Science. 297 (5581), 593-596 (2002).
- Wang, F., Dukovic, G., Brus, L. E., Heinz, T. F. The Optical Resonances in Carbon Nanotubes Arise from Excitons. Science. 308 (5723), (2005).
- Heller, D. A., Baik, S., Eurell, T. E., Strano, M. S. Single-Walled Carbon Nanotube Spectroscopy in Live Cells: Towards Long-Term Labels and Optical Sensors. Adv Mat. 17 (23), 2793-2799 (2005).
- Boghossian, A. A., et al. Near-Infrared Fluorescent Sensors based on Single-Walled Carbon Nanotubes for Life Sciences Applications. Chem Sus Chem. 4 (7), 848-863 (2011).
- Kruss, S., et al. Carbon nanotubes as optical biomedical sensors. Adv Drug Del Rev. 65 (15), 1933-1950 (2013).
- Girifalco, L. A., Hodak, M., Lee, R. S. Carbon nanotubes, buckyballs, ropes, and a universal graphitic potential. Phys Rev B. 62 (19), 13104-13110 (2000).
- Baughman, R. H., et al.
- Zheng, M., et al. DNA-assisted dispersion and separation of carbon nanotubes. Nature Materials. 2 (5), 338-342 (2003).
- Banerjee, S., Hemraj-Benny, T., Wong, S. S. Covalent Surface Chemistry of Single-Walled Carbon Nanotubes. Adv Mat. 17 (1), 17-29 (2005).
- Moore, V. C., et al. Individually Suspended Single-Walled Carbon Nanotubes in Various Surfactants. Nano Letters. 3 (10), 1379-1382 (2003).
- Tu, X., Zheng, M. A DNA-based approach to the carbon nanotube sorting problem. Nano Research. 1 (3), 185-194 (2008).
- Mangalum, A., Rahman, M., Norton, M. L. Site-Specific Immobilization of Single-Walled Carbon Nanotubes onto Single and One-Dimensional DNA Origami. J Am Chem Soc. 135 (7), 2451-2454 (2013).
- Monopoli, M. P., Åberg, C., Salvati, A., Dawson, K. A. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials. Nature Nano. 7 (12), 779-786 (2012).
- Jeng, E. S., Moll, A. E., Roy, A. C., Gastala, J. B., Strano, M. S. Detection of DNA Hybridization Using the Near-Infrared Band-Gap Fluorescence of Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Letters. 6 (3), 371-375 (2006).
- Yang, R., et al. Carbon Nanotube-Quenched Fluorescent Oligonucleotides: Probes that Fluoresce upon Hybridization. J Am Chem Soc. 130 (26), 8351-8358 (2008).
- Yum, K., Ahn, J., McNicholas, T., Barone, P., Mu, B. Boronic acid library for selective, reversible near-infrared fluorescence quenching of surfactant suspended single-walled carbon nanotubes in response to glucose. Acs Nano. 6 (1), 819-830 (2011).
- Kim, J. H., et al. A Luciferase/Single-Walled Carbon Nanotube Conjugate for Near-Infrared Fluorescent Detection of Cellular ATP. Ange Chem Int Ed. 49 (8), 1456-1459 (2010).
- Jin, H., et al. Detection of single-molecule H2O2 signalling from epidermal growth factor receptor using fluorescent single-walled carbon nanotubes. Nat Nano. 5 (4), 302-309 (2010).
- Kim, J. H., et al. The rational design of nitric oxide selectivity in single-walled carbon nanotube near-infrared fluorescence sensors for biological detection. Nat Chem. 1 (6), 473-481 (2009).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nat Mat. 13 (4), 400-408 (2014).
- Samanta, S. K., et al. Conjugated Polymer-Assisted Dispersion of Single-Wall Carbon Nanotubes: The Power of Polymer Wrapping. Acc Chem Res. 47 (8), 2446-2456 (2014).
- Zou, J., et al. Dispersion of Pristine Carbon Nanotubes Using Conjugated Block Copolymers. Adv Mat. 20 (11), 2055-2060 (2008).
- Zheng, M., et al. Structure-Based Carbon Nanotube Sorting by Sequence-Dependent DNA Assembly. Science. 302 (5650), (2003).
- Strano, M. S., et al. Understanding the Nature of the DNA-Assisted Separation of Single-Walled Carbon Nanotubes Using Fluorescence and Raman Spectroscopy. Nano Lett. 4 (4), 543-550 (2004).
- Bisker, G., et al. Protein-targeted corona phase molecular recognition. Nat Comm. 7, 10241 (2016).
- Nelson, J. T., et al. Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces. Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).
- Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).
- Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).
- Salem, D. P., et al. Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes. Carbon. 97, 147-153 (2016).
- Giraldo, J. P., et al. A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring. Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).
- Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes. Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).
- Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging. J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).
- Cognet, L., et al. Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions. Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).
