We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Den bløde agar overlay teknik blev oprindeligt udviklet over 70 år siden og har været meget anvendt i flere områder af mikrobiologisk forskning, herunder arbejdet med bakteriofager og bakteriociner, proteinholdige antibakterielle midler. Denne fremgangsmåde er relativt billig, med minimale ressourcekrav. Denne teknik består i spotting supernatant fra en donor stamme (potentielt huser en toksisk forbindelse (r)) på en størknet blød agar overlay, der podes med en bakteriel test stamme (potentielt følsomme overfor den toksiske forbindelse (r)). Vi udnyttede denne teknik til at screene et bibliotek af Pseudomonas syringae-stammer for intraspecifikke drab. Ved at kombinere denne tilgang med præcipitationstrin og målrettede gendeletioner, kan flere toksiske forbindelser, fremstillet ved den samme stamme differentieres. De to antagonistiske midler, der almindeligvis inddrives ved hjælp af denne teknik er bakteriofager og bakteriociner. Disse to midler kan differentieres ved anvendelse afto simple yderligere tests. Udførelse af en seriel fortynding på en supernatant indeholdende bakteriofag vil resultere i individuelle plaques bliver mindre i antal med større fortynding, hvorimod seriefortynding af en supernatant indeholdende bacteriocin vil resultere en clearing zone, der bliver ensartet mere uklar med større fortynding. Derudover vil en bakteriofag producere en klaringszone når spottet på en frisk blød agar overlay podet med den samme stamme, hvorimod en bakteriocin ikke vil producere en klaringszone når den overføres til en frisk blød agar græsplæne, som følge af fortyndingen af bakteriocin.
For nylig har der været en betydelig interesse i at uddybe vores forståelse af mikrobiel økologi (især microbiomes af forskellige miljøer), samt nye antibakterielle forbindelser til brug i bekæmpelsen af antibiotika-resistente patogener 1,2. En forbindende tema mellem disse interesser er forståelse antagonistiske samspil mellem bakteriestammer i deres naturlige miljø. Der er mange måder, hvorpå bakterier modvirker konkurrenter 3. Bakteriociner, en forskelligartet gruppe af proteinholdige, antibakterielle forbindelser, har længe været undersøgt for deres rolle i at mediere interbacterial antagonisme, med to af de mest undersøgte arter bliver Pseudomonas aeruginosa 4,5 og Escherichia coli 6, vigtige humane patogener. Foruden bakteriociner, kan inducerede profager også fungere som anticompetitor midler, så en stamme at invadere ind i en niche, der allerede koloniseret 7. Pseudomonas syringae er et plantepatogen kendt for at producere et array af antimikrobielle stoffer, herunder enkelt protein bakteriociner 8, bakteriofaghaleproteinerne-afledte bakteriociner 9 (betegnet tailocins), samt ikke-proteinholdige sekundære metabolitter 10. For nylig har der været interesse for at forstå, hvordan disse antimikrobielle stoffer påvirker økologi af denne organisme, samt hvordan de kan udnyttes til at styre plantesygdom 11.
En almindeligt anvendt fremgangsmåde til at undersøge begge bakteriociner og bakteriofag er soft-agar overlay teknik. Denne fremgangsmåde blev først beskrevet af Gratia i 1936 til støtte i optælling bakteriofag 12,13.
Her beskriver vi anvendelsen af den bløde agar overlay metode, i kombination med målrettet genetisk manipulation og polyethylenglycol (PEG) udfældning, at skelne mellem tre forskellige antimikrobielle midler (en bakteriofag, en høj molekylvægt Bacteriocin, og en lavmolekylær bakteriocin) frembragt af en enkelt bakteriestamme. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det er relativt enkel og billig, hvilket er grunden til, selv om den er decideret 'low-tech ", er det stadig almindeligt brugt.
Den bløde agar overlay teknikken beskrevet her har været almindeligt anvendt i mange årtier af forskere interesseret i bakteriofager eller bakteriociner. De vigtigste fordele ved denne tilgang er, at den er enkel, billig og relativt let at fortolke. Ved at kombinere den bløde-agar overlay med PEG nedbør og seriel fortynding, kan antimikrobielle stoffer adskilles i høj vs. lavmolekylære stoffer, og replikative vs. ikke-replikativ midler (dvs. bakteriofager vs. tailocin henholdsvis). Endelig kan inkorporering af målrettet genmanipulation (udgår og komplementering) af formodede bacteriocin eller profag loci fast fastslå identiteten af en given antagonistisk forbindelse. Vi har for nylig brugt denne metode til at beskrive en ny bakteriofag-afledt bakteriocin udbredt blandt Pseudomonas syringae stammer 9.
De vækstmedier og betingelser i denne protokol arbejde godt for Pseudomonas syringae og ville sandsynligvis være tilstrækkeligt for andre gram-negative bakterier, der vokser kraftigt under disse betingelser. forskere ved hjælp af denne metode vil imidlertid ønsker at optimere timingen, dyrkningsmediet, induktionsmetode, og inkubation temperatur i deres system. De kritiske parametre omfatter inducere den producerende kultur, mens i den logaritmiske vækstfase, samt podning af soft-agar overlay med tilstrækkelig logaritmisk kultur for at sikre en ensartet bakteriel fordeling, men ikke overdreven kultur, hvilket skjuler potentielle clearing zoner. Der er mange bakteriociner, der ikke induceret som en del af SOS respons, men snarere induceres gennem peptidbaserede quorum sensing systemer (især grampositive bakteriociner 15), således kan en forsker ønsker at screene flere forskellige induktionsmetoder (såsom modificering næringsindholdet inducere medium, eller giver mulighed for udvidet inkubation af den producerende stamme).
Ved brugdenne teknik, skal den bløde agar overlay grundigt smeltet og holdt ved 55-60 ° C før tilsætningen af seeding stamme. Vi har haft flere eksperimenter, hvor den bløde agar ikke blev grundigt smeltet (selvom visuelt det syntes at være) og resulterede i en overlejring med et kornet udseende. Resultater fra et kornet overlejring kan stadig være generelt fortolkelige, men dette er afhængig af styrken af inhiberingen (svagere inhibering vil være vanskeligere at observere). En endelig, confounding variable skal overvejes ved brug af denne teknik er, at temperaturen af det smeltede agar tillades tilstrækkelig tid til at afkøle før inokulering med seeding stamme, for at undgå at dræbe seeding stamme. For at undgå dette problem, sikrer vi den bløde agar er varm, men ikke varmt, at røre ved. Langs disse linjer, har vi også observeret, at hvis vi giver utilstrækkelig tid til en såning kultur at akklimatisere sig til det smeltede agar, før hælde overlay, vi genvinde generelt dårlig bakteriel gVÆKST, hvilket gør fortolkningen af specifik inhibering vanskeligt eller umuligt at fortolke. Det er derfor, vi tillader 10-15 ekstra sekunder inkubation mellem hvirvelblanding og hælde overlay. Afvejningen mellem opretholde agar i en helt smeltet tilstand (varmere er bedre), men ikke livsfarlige for såning stamme (varmere er ikke bedre) er en, der vil sandsynligvis nødt til at være bestemt af en forsker gennem trial and error.
Hvis der anvendes en PEG-udfældningstrin, vil det være fordelagtigt at indbefatte en negativ kontrol, hvor en steril bouillon medium bearbejdes identisk med kultursupernatanten. Dette vil sikre, at dræbe aktivitet er ikke resultatet af residual PEG eller chloroform i prøven supernatant.
Da begge bakteriofager og bakteriociner tendens til at være meget specifikke, er det ikke ualmindeligt at støde nogen tilsyneladende celledræbende aktivitet med en given kombination af stammer. Dette kan skyldes en række af stamme-specifik resistance mekanismer, det ene er, at testeren stammen enten mangler eller har en ukendt version af receptoren er nødvendig for at målrette med en given bacteriocin eller bakteriofager.
En alternativ metode, har bakteriocin screeningsmetode er beskrevet af Kawai et al. , Men lider ulemper og ikke er blevet udbredt 16. Konkret denne teknik kræver observere bouillon prøver ved tidsintervaller, der kan være belastende, og tillader ikke for forskelsbehandling mellem bakteriofag-afledte og bakteriocin-afledte drab aktiviteter.
De vigtigste begrænsninger ved denne teknik er, at det ikke er velegnet til organismer, som ikke vokser robust (og således vil mangle let skelnelige clearing zoner), eller at harbor profager eller bakteriociner, der ikke robust produceret under laboratorieforhold. Tilpasning af denne teknik til at detektere bakteriociner produceret i miljøprøver ville både udvide anvendelighedenaf denne teknik og lette større indsigt i den rolle, som bakteriociner inden naturlige omgivelser.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |