L'utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

Abstract

La tecnica di sovrapposizione di soft-agar è stato originariamente sviluppato più di 70 anni fa ed è stato ampiamente utilizzato in diverse aree della ricerca microbiologica, compreso il lavoro con i batteriofagi e batteriocine, agenti antibatterici proteici. Questo approccio è relativamente economico, con requisiti di risorse minime. Questa tecnica consiste individuare surnatante da un ceppo donatore (potenzialmente ospitare un composto tossico (s)) in un solidificata agar morbido che viene inseminata con un ceppo batterico di prova (potenzialmente sensibile al composto tossico (s)). Abbiamo utilizzato questa tecnica per lo screening di una libreria di Pseudomonas syringae ceppi per l'uccisione intraspecifica. Combinando questo approccio con una fase di precipitazione e delezioni geniche mirate, composti tossici più prodotte dallo stesso ceppo possono essere differenziati. I due agenti antagonisti comunemente recuperati utilizzando questa tecnica sono batteriofagi e batteriocine. Questi due agenti possono essere differenziati utilizzandodue semplici test aggiuntivi. Esecuzione di una diluizione seriale di un surnatante contenente batteriofago si tradurrà in singole placche diventando meno in numero con una maggiore diluizione, mentre la diluizione seriale di un surnatante contenente batteriocina comporterà una zona di compensazione che diventa uniformemente più torbida con una maggiore diluizione. Inoltre, un batteriofago produrrà una zona di compensazione quando trovato su un fresco morbido agar seminato con lo stesso ceppo, mentre una batteriocina non produrrà una zona di compensazione quando trasferito su un morbido prato fresco agar, a causa della diluizione del batteriocine.

Introduction

Recentemente, vi è stato un notevole interesse ad approfondire la nostra comprensione dell'ecologia microbica (in particolare le microbiomes di vari ambienti), così come i nuovi composti antibatterici da utilizzare nella lotta contro gli agenti patogeni resistenti agli antibiotici ^1,2. Un tema di interconnessione tra questi interessi è la comprensione delle interazioni antagoniste tra i ceppi batterici nel loro ambiente naturale. Ci sono molti modi in cui i batteri antagonizzano concorrenti ^3. Batteriocine, un gruppo eterogeneo di composti antibatterici, proteici, sono stati a lungo studiati per il loro ruolo nel mediare l'antagonismo interbatterica, con due delle specie più studiate essere Pseudomonas aeruginosa ^4,5 e Escherichia coli ^6, importanti agenti patogeni umani. Oltre a batteriocine, profagi indotte possono anche agire come agenti anticompetitor, consentendo un ceppo di invadere in una nicchia che è già colonizzato ^7. Pseudomonas syringae è un patogeno pianta nota per produrre una serie di agenti antimicrobici, compresi singoli batteriocine proteiche ^8, batteriocine coda derivato batteriofago ⁹ (tailocins chiamati), così come metaboliti secondari non proteici ^10. Recentemente vi è stato interesse per capire come questi antimicrobici influenzano l'ecologia di questo organismo, così come il modo in cui possono essere utilizzate per controllare le malattie delle piante ^11.

Un metodo ampiamente utilizzato per studiare sia batteriocine e batteriofago è la tecnica di sovrapposizione soft-agar. Questo metodo è stato descritto da Gratia nel 1936 agli aiuti di enumerazione batteriofago ^12,13.

Qui si descrive l'applicazione del metodo di sovrapposizione soft-agar, in combinazione con mirata manipolazione genetica e polietilenglicole precipitazioni (PEG), nel distinguere fra tre diversi agenti antimicrobici (un batteriofago, un elevato peso molecolare bacteriocin, e un basso peso molecolare batteriocina) prodotto da un singolo ceppo batterico. Il vantaggio di questo approccio è che è relativamente semplice e poco costoso, che è il motivo per cui, nonostante sia decisamente 'low-tech', è ancora ampiamente utilizzato.

Protocol

1. Preparazione di surnatante in essere testati per l'attività

1. Preparare un 0,5 mg / ml soluzione stock di mitomicina C sciogliendo la giusta quantità in sterile 0,1 M MgSO ₄ Buffer (ad esempio 1 mg mitomicina C / 2 ml buffer). Conservare magazzino a 4 ° C in una luce contenitore protetto (mitomicina C è sensibile alla luce).
2. Inoculare una singola colonia di P. syringae in 3 ml di terreno B King (KB) brodo ^14. Incubare per tutta la notte con agitazione (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C).
3. La mattina seguente, diluire il brodo di coltura 1/100 in 3 ml di brodo KB fresco. Incubare per 3-4 ore con agitazione a temperatura ambiente. Aggiungere mitomicina C (0,5 mg / ml, concentrazione finale). Incubare la cultura per tutta la notte con agitazione a temperatura ambiente.
   NOTA: Mitomicina C provoca doppie rotture del DNA non recuperabili, stimolando così la risposta SOS della cellula, che porta alla produzione di entrambi i batteriofagi e batteriocine.
4. Pellet 1-2 ml mitomicina C culture indotta mediante centrifugazione a 20.000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga da banco.
5. Rimuovere e sterilizzare sovranatanti di coltura sia facendo passare il surnatante attraverso un filtro con pori di 0,22 micron o trattando il surnatante con cloroformio (100 ml di cloroformio per 1 ml surnatante).
   1. Se si utilizza il cloroformio, agitare la miscela per 15 sec e lasciate incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 20.000 xg per 5 min.
      NOTA: Cloroformio uccide le cellule in modo efficiente dai solubilizzazione loro membrane. Il vantaggio di utilizzare cloroformio sopra sterilizzazione filtro è che è più economico e più facile da scale-up qualora da molti (> 20) campioni alla volta. Ci può essere una possibilità che una data attività di uccisione viene persa in seguito al trattamento cloroformio come risultato di partizionamento nella fase organica.
   2. Rimuovere la fase superiore, acquosa utilizzando una pipetta 1 ml di una fresca, sterile 1,5 o 2,0 mlprovetta per microcentrifuga. Attenzione a non trasferire qualsiasi dello strato di cloroformio inferiore (è preferibile rimuovere meno della fase acquosa per evitare riporto).
   3. Incubare il supernatante trasferito uncapped in una cappa aspirante per permettere cloroformio residua evapori (alcune ore). surnatanti Conservare a 4 ° C.

2. La separazione e la concentrazione di alto peso molecolare battericida composti da polietilene glicole (PEG) Precipitazioni

1. Per il surnatante sterile, aggiungere NaCl e PEG 8000 a 1 m e 10% concentrazioni finali rispettivamente. Ripetutamente invertire il campione fino a quando sia il NaCl e PEG sono completamente sciolti. Incubare i campioni in un bagno di ghiaccio per 1 ora o per una notte a 4 ° C.
2. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe formare sul fondo della provetta. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in volume desiderato (ad esempio 1/10 o 1/100 del surnatante vol originaleume) di tampone (10 mM Tris, 10 mM MgSO _4, pH 7,0) pipettando ripetutamente.
3. Rimuovere PEG residua da due estrazioni sequenziali con un uguale volume di cloroformio.
   1. Combinare cloroformio con il pellet risospeso e vortex per 10 a 15 secondi, quindi centrifugare la miscela a 20.000 xg per 5 min. Trasferire la fase superiore, acquosa ad una provetta per microcentrifuga fresca. Ripetere questa estrazione fino a quando non l'interfaccia bianca tra la fase acquosa e organica sia visibile (di solito 2 estrazioni totali). Lasciare che il cloroformio residua di evaporare dal surnatanti estratti in una cappa aspirante.

3. Preparazione di Overlay e Testing surnatanti per attività

1. Inoculare una singola colonia di un ceppo P. syringae da testare per la sensibilità in 3 ml di KB, incubare per tutta la notte con agitazione a temperatura ambiente.
2. La mattina seguente, di nuovo diluire la cultura 1/100 in KB fresco. Incubare 3-4 ore con agitazione a camera temperi.
3. Preparare sterilizzato agar acqua autoclavando una sospensione 0,35-0,7% (w / v) di agar in acqua ultrapura.
   NOTA: Uno stock di morbida agar acqua può essere fuso in un forno a microonde e riutilizzato più volte, sovrapposizione fresco non ha bisogno di essere preparati per ogni esperimento. Se agar acqua viene riutilizzata, è fondamentale per assicurarsi che sia completamente sciolto dopo la cottura a microonde. In caso contrario, la sovrapposizione avrà una consistenza granulosa sulla solidificazione che renderà difficile l'interpretazione. In questo caso, sciogliere l'agar per alcuni minuti in più nel forno a microonde di fatto in precedenza.
4. Mantenere il soft agar fuso in un bagno d'acqua a 60 ° C prima dell'uso. Usando una pipetta sierologica sterile, trasferire 3 ml di agar morbido per una provetta di coltura sterile. Riportare la provetta a bagnomaria per mantenere in uno stato fuso.
5. Versare la sovrapposizione, in primo luogo consentire l'agar fuso raffreddare (si dovrebbe sentire caldo ma non bollente al tatto), ma non lasciare solidificare.
6. In una cappa sterile, inoculare 100 ml dila cultura ceppo tester in agar morbido e vortex per miscelare. Ruotare la cultura a mano per 10-15 secondi, poi versate su un fondo agar (KB agar). Inclinare il piatto in tutte le direzioni per assicurare l'agar morbido copre in modo uniforme l'agar fondo.
   NOTA: L'agar inferiore può essere qualsiasi (1,5% agar) mezzo solidificato in cui il ceppo sperimentale cresce vigorosamente. Per 100 mm di diametro Petri standard utilizzano ~ 20 ml fuso media. L'agar inferiore può essere preparato diverse settimane in anticipo (se mantenuta a 4 ° C senza asciugatura) o può essere preparato il giorno stesso. Se preparate il giorno stesso di eseguire la sovrapposizione, è meglio farlo prima della fase 3.4.
7. Coprire la piastra e lasciare 20-30 minuti a solidificare. Fare attenzione a non disturbare il piatto mentre la solidificazione.
8. Una volta solidificato, individuare 2-5 ml di surnatante (generato nelle sezioni 1 e 2, sopra) sulla sovrapposizione. Lasciare le piastre di incubare durante la notte a temperatura ambiente. Osservare e registrare i risultati la mattina seguente.
   Annotalopuò essere utile eseguire e spot da una diluizione seriale del surnatante. Questo permetterà ai ricercatori di distinguere tra batteriofago e l'attività di compensazione batteriocina. In questo caso, si raccomanda di eseguire 1: 5 o 1:10 diluizioni.

Representative Results

La combinazione della sovrapposizione agar morbido e PEG precipitazione può essere usato per identificare e caratterizzare differenti agenti antimicrobici prodotte dallo stesso ceppo. La figura 1 mostra due ceppi di P. syringae (A e B) che sono inibiti da un terzo ceppo della stessa specie. I due ceppi, tuttavia, sono inibiti da diverse batteriocine. La zona di compensazione sul ceppo A presenta un bordo tagliente, mentre la zona di compensazione sul ceppo B è più grande, e presenta un bordo non tagliente. manipolazioni genetiche all'interno del ceppo produzione di quel particolare inattivano sia il tailocin (tailocin carente) o basso peso molecolare batteriocina conferma (batteriocina carente) che i ceppi A e B sono sensibili alle batteriocine distinti. La figura 2 mostra che l'uccisione batteriofago-mediata può essere distinto da altri antimicrobici non replicativa confrontando una serie di diluizioni. Poiché entrambe le batteriocine eprofago può essere indotta da trattamenti mitomicina C, le attività di questi due agenti possono molto simili tra loro (in particolare se il fago attivato è abbondante). Nel caso di compensazione batteriofago-mediata, diluizione del surnatante risolverà in singoli placche (zone di compensazione) mentre compensazione batteriocine-mediata non risolve in tali placche.

Figura 1: distinzione fenotipica di più agenti antimicrobici prodotte dallo stesso ceppo. Strain A è sensibile ad un alto batteriocina peso molecolare (tailocin) ma non un basso peso molecolare alternativa batteriocine, come evidenziato dalla mancanza di compensazione nel tailocin ceppo carente, ma non il batteriocina ceppo carente. Viceversa, ceppo B è insensibile alla tailocin, ma è sensibile al basso batteriocina peso molecolare. Il tailocin è efficposi- zione ergonomica, recuperati in seguito PEG precipitazioni, mentre inferiori batteriocine peso molecolare non lo sono. WT = wild type. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Distinguere tra antimicrobici e dei batteriofagi non replicativa. (A) La diluizione di un alto titolo di batteriofagi risultati nelle singole placche che diventano meno numerose (in alto alto titolo, basso basso titolo). (B) diluizione di batteriocine risultati in modo uniforme meno compensazione che non si risolve in singoli placche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

La tecnica di sovrapposizione di soft-agar qui descritto è stato ampiamente applicato per molti decenni dai ricercatori interessati a batteriofagi o batteriocine. I principali vantaggi di questo approccio sono che è semplice, economico e relativamente facile da interpretare. Combinando la sovrapposizione soft-agar con PEG precipitazioni e la diluizione di serie, agenti antimicrobici possono essere separati in alto contro gli agenti a basso peso molecolare, e replicative vs non-replicativa agenti (cioè batteriofago vs. tailocin, rispettivamente). Infine, l'incorporazione di manipolazione genetica mirata (soppressione e complementazione) di batteriocine putativo o loci profago può fermamente stabilire l'identità di un dato composto antagonista. Abbiamo recentemente usato questo metodo per descrivere una nuova batteriofago di derivazione batteriocina prevalente tra Pseudomonas syringae ceppi ^9.

I media di crescita e le condizioni indicate in questo lavoro protocollo bene per Pseudomonas syringae e probabilmente sufficiente per altri batteri Gram-negativi che crescono vigorosamente in queste condizioni. Tuttavia, i ricercatori utilizzano questo metodo vorranno ottimizzare i tempi, terreno di coltura, metodo di induzione, e temperatura di incubazione per il loro sistema. I parametri critici includono indurre la cultura produrre mentre nella fase di crescita logaritmica, nonché semina sovrapposizione soft-agar con sufficiente cultura fase logaritmica di garantire una distribuzione batterica uniforme, ma la cultura non eccessivo, che oscurare potenziali zone di compensazione. Ci sono molti batteriocine che non sono indotte come parte della risposta SOS, ma piuttosto sono indotti attraverso sistemi di rilevamento del quorum peptide-based (in particolare batteriocine Gram-positivi ^15), in tal modo, un ricercatore può essere utile per lo screening diversi metodi di induzione diversi (come ad esempio modificando contenuto di nutrienti di indurre medio o consentendo di incubazione del ceppo produzione).

Quando si usaquesta tecnica, la sovrapposizione soft-agar deve essere accuratamente fusa e mantenuta a 55-60 ° C prima dell'aggiunta del ceppo semina. Abbiamo avuto diversi esperimenti in cui il soft-agar non è stato completamente fuso (anche se visivamente sembrava essere) e ha portato a una sovrapposizione con un aspetto granuloso. I risultati di una sovrapposizione granulosa possono ancora essere generalmente interpretabile, tuttavia, questo dipende dalla forza di inibizione (inibizione debole sarà più difficile osservare). Una variabile confondendo finale da considerare quando si utilizza questa tecnica è che la temperatura del agar fuso è consentito raffreddi prima dell'inoculo con il ceppo semina, in modo da evitare di uccidere il ceppo semina. Per evitare questo problema, possiamo garantire il soft-agar è caldo, ma non bollente, al tatto. Su questa linea, abbiamo anche osservato che se diamo il tempo insufficiente per una cultura di semina per ambientarsi al agar fuso, prima di versare la sovrapposizione, recuperiamo generalmente scarsa g battericaRESCITA, il che rende l'interpretazione di inibizione specifica difficili o impossibili da interpretare. Questo è il motivo per cui permettiamo 10-15 ulteriori secondi di incubazione tra vortex e versando la sovrapposizione. Il trade-off tra il mantenimento l'agar in uno stato completamente fuso (più caldo è meglio), ma non letale per il ceppo di semina (più caldo non è migliore) è quello che sarà probabilmente bisogno di essere determinato da un ricercatore attraverso tentativi ed errori.

Se viene utilizzata una fase di precipitazione PEG, sarebbe vantaggioso includere un controllo negativo in cui un mezzo di brodo sterile viene elaborato identico al supernatante della coltura. Questo farà sì che uccidere attività non è il risultato di PEG residua o cloroformio nel supernatante campione.

Poiché entrambe batteriofagi e batteriocine tendono ad essere altamente specifica, non è raro incontrare alcuna attività uccisione evidente con una data combinazione di ceppi. Ciò può derivare da una varietà di specifico ceppo remeccanismi sistance, uno è che il ceppo tester o manca o ha una versione non riconosciuta del recettore necessario per il targeting da un dato batteriocina o batteriofago.

Un metodo alternativo, metodo di screening batteriocine è stata descritta da Kawai et al. , Ma soffre di inconvenienti e non è stato ampiamente adottato ^16. In particolare, questa tecnica richiede osservando campioni brodo a intervalli di tempo che possono essere onerose, e non consente la discriminazione tra attività di uccisione batteriofago-derivato e batteriocine-derivato.

I principali limiti di questa tecnica è che non è adatto per gli organismi che non crescono robusta (e quindi mancheranno zone di compensazione facilmente distinguibili) o che profagi porto o batteriocine che non sono prodotte con fermezza in condizioni di laboratorio. Adattamento di questa tecnica per rilevare batteriocine prodotte in campioni ambientali sarebbero sia espandere l'utilitàdi questa tecnica e facilitare una maggiore comprensione del ruolo di batteriocine all'interno di ambienti naturali.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.
Polyethylene Glycol (PEG)	Amresco	0159
Bacteriological grade agar	Genesee Scientific	20-274