Abstract
La técnica de superposición de agar blando se desarrolló originalmente hace más de 70 años y ha sido ampliamente utilizado en varios campos de investigación microbiológica, incluyendo el trabajo con los bacteriófagos y bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicos. Este enfoque es relativamente barato, con requisitos mínimos de recursos. Esta técnica consiste en la detección de sobrenadante de una cepa donante (potencialmente albergar un compuesto (s) tóxico) sobre una capa de agar blando solidificada que se siembra con una cepa de prueba bacteriana (potencialmente sensible al compuesto tóxico (s)). Hemos utilizado esta técnica para seleccionar una biblioteca de cepas de Pseudomonas syringae para matar intraespecífica. Mediante la combinación de este método con una etapa de precipitación y deleciones de genes específicos, múltiples compuestos tóxicos producidos por la misma cepa se pueden diferenciar. Los dos agentes antagónicos comúnmente recuperados usando esta técnica son bacteriófagos y bacteriocinas. Estos dos agentes se pueden distinguir empleandodos pruebas adicionales simples. Realización de una dilución en serie en un sobrenadante que contenía bacteriófago se traducirá en placas individuales haciéndose menos en número con mayor dilución, mientras que la dilución en serie de un sobrenadante que contiene bacteriocina resultará una zona de compensación que se hace uniforme más turbia con mayor dilución. Además, un bacteriófago producirá una zona de compensación cuando manchado sobre una capa de agar blando fresco sembrado con la misma cepa, mientras que una bacteriocina no producirá una zona de compensación cuando se transfiere a un césped de agar blando fresco, debido a la dilución de la bacteriocina.
Introduction
Recientemente, ha habido un interés significativo en la profundización de nuestra comprensión de la ecología microbiana (en particular las microbiomas de varios ambientes), así como nuevos compuestos antibacterianos para utilizar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos 1,2. Un tema de la interconexión entre estos intereses es la comprensión de las interacciones antagónicas entre las cepas bacterianas en su ambiente natural. Existen numerosas formas en que las bacterias antagonizan competidores 3. Las bacteriocinas, un grupo diverso de compuestos proteicos, antibacterianos, durante mucho tiempo han sido estudiados por su papel en la mediación de antagonismo interbacterial, con dos de las especies más estudiadas son Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 4,5 6, importantes patógenos humanos. Además de bacteriocinas, prophages inducidos también pueden actuar como agentes anticompetitor, lo que permite una cepa de invadir en un nicho que ya está colonizada 7. Pseudomonas syringae es un patógeno de la planta conocida para producir una gran variedad de agentes antimicrobianos, incluyendo bacteriocinas sola proteína 8, bacteriocinas de la cola de bacteriófagos derivados de 9 (denominados tailocins), así como metabolitos secundarios no proteínicos 10. Recientemente ha habido interés en la comprensión de cómo estos antimicrobianos influyen en la ecología de este organismo, así como la forma en que se pueden aprovechar para el control de enfermedades de las plantas 11.
Un método ampliamente utilizado para el estudio de ambas bacteriocinas y bacteriófago es la técnica de superposición en agar blando. Este método fue descrito por primera vez por Gratia en 1936 para ayudar en la enumeración de bacteriófago 12,13.
Aquí se describe la aplicación del método de superposición en agar blando, en combinación con la manipulación genética dirigida y precipitación con polietilenglicol (PEG), para distinguir entre los tres agentes antimicrobianos diferentes (un bacteriófago, un bact de alto peso moleculareriocin, y una bacteriocina de bajo peso molecular) producida por una única cepa bacteriana. El beneficio de este enfoque es que es relativamente simple y barato, por lo que, a pesar de ser decididamente 'baja tecnología', todavía se utiliza ampliamente.
Protocol
1. Preparación del sobrenadante someterse a ensayo de Actividad
- Preparar una solución madre de 0,5 mg / ml de mitomicina C por disolución de la cantidad apropiada en estéril M MgSO 4 tampón 0.1 (por ejemplo, / 2 ml de tampón de 1 mg de mitomicina C). Stock de almacén a 4 ° C en un recipiente protegido de la luz (mitomicina C es sensible a la luz).
- Inocular una sola colonia de P. syringae en 3 ml de medio B de King (KB) de caldo de 14. Incubar durante la noche con agitación (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C).
- A la mañana siguiente, diluir el caldo de cultivo 1/100 en 3 ml de caldo de KB fresco. Incubar durante 3-4 horas con agitación a temperatura ambiente. Añadir mitomicina C (0,5 g / ml, concentración final). Incubar el cultivo durante la noche con agitación a temperatura ambiente.
NOTA: La mitomicina C causa roturas de ADN de cadena doble, estimulando así la respuesta SOS de la célula, dando lugar a la producción tanto de bacteriófago y bacteriocinas. - Pellet 1-2 ml de mitomicina C inducida cultivos por centrifugación a 20.000 xg durante 5 min en una microcentrífuga de mesa de trabajo.
- Retirar y esterilizar los sobrenadantes de cultivo, ya sea haciendo pasar el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro 0,22 micras o por tratamiento del sobrenadante con cloroformo (100 cloroformo l por 1 ml de sobrenadante).
- Si se utiliza cloroformo y agitar la mezcla durante 15 segundos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min.
NOTA: cloroformo mata eficazmente células mediante la solubilización de sus membranas. El beneficio del uso de cloroformo durante la esterilización del filtro es que es más barato y más fácil de aumentar la escala de si el procesamiento de muchos (> 20) muestras a la vez. Puede haber una posibilidad de que una actividad de eliminación dada se pierde después del tratamiento cloroformo como resultado de la partición en la fase orgánica. - Retire la fase acuosa superior utilizando una pipeta de 1 ml a un nuevo máximo, estériles 1,5 ó 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la capa inferior de cloroformo (es mejor para eliminar menos de la fase acuosa para evitar arrastre).
- Incubar el sobrenadante se transfirió destapado en una campana de ventilación para permitir que el cloroformo residual se evapore (varias horas). sobrenadantes se almacenan a 4 ° C.
- Si se utiliza cloroformo y agitar la mezcla durante 15 segundos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min.
2. Separación y concentración de alto peso molecular compuestos bactericidas por Polietilenglicol Precipitación (PEG)
- Al sobrenadante estéril, añadir NaCl y PEG 8000 hasta 1 M y 10% concentraciones finales, respectivamente. Repetidamente invertir la muestra hasta que tanto el NaCl y PEG se haya disuelto por completo. Incubar las muestras en un baño de hielo durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C.
- Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Un pellet debe formar en la parte inferior del tubo de centrífuga. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en el volumen deseado (por ejemplo, un décimo o un centésimo del sobrenadante original, volume) de tampón (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) mediante pipeteo repetido.
- Eliminar PEG residual por dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo.
- Combinar con cloroformo precipitado resuspendido y agitar durante 10 segundos y 15 segundos, a continuación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Repetir esta extracción hasta que no interfase blanca entre la fase acuosa y orgánica es visible (por lo general 2 extracciones en total). Permitir cloroformo residual se evapore a partir de sobrenadantes extraídos en una campana de humos.
3. Preparación de superposición y sobrenadantes para la Actividad
- Se inocula una sola colonia de una cepa de P. syringae a ensayar para la sensibilidad en 3 ml de KB, se incuba durante la noche con agitación a temperatura ambiente.
- A la mañana siguiente, volver a diluir la cultura 1/100 en KB fresco. Incubar 3-4 horas con agitación a temperatu de la habitaciónre.
- Preparar agar agua esterilizada en autoclave una suspensión 0,35-0,7% de agar en agua ultrapura (v / w).
NOTA: Un balance de agar agua blanda se puede fundir en el microondas y reutilizarse varias veces, superposición fresca no tiene que estar preparado para cada experimento. Si se vuelve a utilizar agar agua, es fundamental para asegurar que se derrita por completo tras el microondas. Si no, el recubrimiento tendrá una textura granulada en solidificación que hará difícil interpretación. Si esto ocurre, fundir el agar durante varios minutos más largos en el microondas de hecho previamente. - Mantener el agar blando fundido en un baño de agua C 60 ° antes de su uso. Con una pipeta serológica estéril, la transferencia de 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Vuelva a colocar el tubo de cultivo de baño de agua para mantener en un estado fundido.
- Para verter la superposición, deje que el agar fundido se enfríe (que debe sentirse tibia, no caliente al tacto), pero no permita que se solidifique.
- En una campana estéril, inocular 100 l dela cultura cepa de ensayo en el agar suave y agitar para mezclar. Girar la cultura con la mano durante 10-15 segundos, luego se vierte en una parte inferior de agar (agar KB). Inclinar la placa en todas las direcciones para asegurar el agar blando cubre uniformemente el agar inferior.
NOTA: Este medio puede ser cualquier parte inferior (1,5% de agar) medio solidificado en la que la cepa de ensayo crece vigorosamente. Para un diámetro del plato estándar de Petri de 100 mm, use ~ 20 ml fundieron medio. El agar parte inferior se puede preparar varias semanas antes de tiempo (si se mantiene a 4 ° C sin secado) o pueden ser preparados el mismo día. Si se prepara el mismo día de la realización de la superposición, lo mejor es hacerlo antes de la etapa 3.4. - Cubrir la placa y dejar que se solidifique 20-30 min. Tenga cuidado de no molestar a la placa, mientras que la solidificación.
- Una vez solidificado, Colocar 2,5 l de sobrenadante (generada en las secciones 1 y 2, más arriba) sobre la superposición. Permitir a las placas para incuban durante la noche a temperatura ambiente. Observar y registrar los resultados de la mañana siguiente.
NOTA:puede ser útil para realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre el bacteriófago y la actividad de compensación bacteriocina. En este caso, se recomienda llevar a cabo 1: 5 o diluciones 1:10.
Representative Results
La combinación de la capa de agar blando y precipitación con PEG se puede utilizar para identificar y caracterizar los diferentes agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La figura 1 muestra dos cepas de P. syringae (A y B) que se inhibe por tercera cepa de la misma especie. Las dos cepas, sin embargo, son inhibidas por diferentes bacteriocinas. La zona de intercambio de información sobre la cepa A presenta un borde afilado, mientras que la zona de intercambio de información sobre la cepa B es más grande, y presenta un borde no cortante. Las manipulaciones genéticas dentro de la cepa que produce que inactivan específicamente ya sea la tailocin (tailocin deficiente) o de bajo peso molecular bacteriocina de confirmación (bacteriocina deficiente) que las cepas A y B son sensibles a bacteriocinas distintos. La Figura 2 muestra que la matanza bacteriófago mediada se puede distinguir de otros antimicrobianos no replicativos mediante la comparación de una serie de dilución. Debido a que ambas bacteriocinas yprofago puede ser inducida por el tratamiento con mitomicina C, las actividades de estos dos agentes pueden se parecen mucho unos a otros (en particular si el fago activado es abundante). En el caso de la compensación bacteriófago mediada, la dilución del sobrenadante resolverá en placas individuales (zonas de compensación), mientras que de facilitación bacteriocina mediada no resolverá en tales placas.
Figura 1: distinción fenotípica de múltiples agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular (tailocin), pero no un peso molecular bajo alternativa bacteriocina, como se evidencia por la falta de limpieza de la cepa deficiente en tailocin, pero no la cepa deficiente de bacteriocina. Por el contrario, la cepa B es insensible a la tailocin, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. El tailocin es efficiently recuperada tras la precipitación con PEG, mientras que las bacteriocinas de bajo peso molecular no lo son. WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Distinguir entre los antimicrobianos y bacteriófagos no replicativa. (A) La dilución de un título elevado de bacteriófagos resultados en placas individuales que se convierten en menos numerosos (parte superior de alto título, bajo el título de abajo). (B) La dilución de los resultados de bacteriocinas en menos uniformemente claro que no se resuelve en placas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La técnica de superposición de agar blando se describe aquí se ha aplicado ampliamente para muchas décadas por los investigadores interesados en bacteriófagos o bacteriocinas. Los principales beneficios de este enfoque son que es simple, barato y relativamente fácil de interpretar. Mediante la combinación de la superposición en agar blando con precipitación con PEG y de dilución en serie, los agentes antimicrobianos se pueden separar en altas frente a agentes de bajo peso molecular, y replicativas vs. no replicativo agentes (es decir, bacteriófago vs. tailocin, respectivamente). Finalmente, la incorporación de manipulación dirigida genética (supresión y complementación) de bacteriocina putativo o loci profago puede establecer firmemente la identidad de un compuesto antagonista dado. Recientemente, hemos utilizado este método para describir un nuevo derivado del bacteriófago bacteriocina frecuente entre las cepas de Pseudomonas syringae 9.
Los medios de cultivo y condiciones indicados en el presente trabajo protocolo bien para Pseudomonas SYringae y probablemente sería suficiente para otras bacterias Gram-negativas que crecen vigorosamente bajo estas condiciones. Sin embargo, los investigadores que usan este método se desea optimizar el tiempo, medio de cultivo, el método de inducción, y la temperatura de incubación para su sistema. Los parámetros críticos incluyen la inducción de la producción de cultivo, mientras que en la fase de crecimiento logarítmica, así como la siembra de la superposición en agar blando con suficiente cultivo en fase logarítmica para asegurar una distribución uniforme de bacterias, pero no excesiva cultura, que oscurecer posibles zonas de compensación. Hay muchos bacteriocinas que no son inducidas como parte de la respuesta SOS, sino que son inducidos a través de sistemas de detección de quórum basados en péptidos (en particular, las bacteriocinas Gram-positivas 15), por lo tanto, un investigador puede querer evaluar a varios métodos de inducción diferentes (por ejemplo, modificar el contenido de nutrientes del medio inductor, o permitir que para la incubación ampliada de la cepa productora).
Cuando usasesta técnica, la superposición en agar blando debe ser fundido a fondo y se mantiene a 55-60 ° C antes de la adición de la cepa de la siembra. Hemos tenido varios experimentos en los que el agar blando no se funde completamente (aunque visualmente que parecía ser) y dio lugar a una superposición con un aspecto granulado. Los resultados de una superposición de granulado pueden todavía ser generalmente interpretable, sin embargo, esto depende de la fuerza de la inhibición (inhibición más débil será más difícil de observar). A, variable de confusión final a considerar cuando se utiliza esta técnica es que se permite que la temperatura del agar fundido suficiente tiempo para enfriarse antes de la inoculación con la cepa de la siembra, con el fin de evitar la muerte de la cepa de la siembra. Para evitar este problema, nos aseguramos el agar blando es cálido, pero no caliente, para tocar. En esta línea, también hemos observado que si nos damos un tiempo inadecuado para un cultivo de siembra para aclimatarse a la agar fundido, antes de verter la superposición, que se recuperan generalmente pobre g bacterianarecimiento, que hace que la interpretación de la inhibición específica difícil o imposible de interpretar. Esto es por qué permitimos 10-15 segundos adicionales de incubación entre la vórtex y vertiendo la superposición. El equilibrio entre el mantenimiento de la agar en un estado completamente fundido (más caliente es mejor) pero no letal para la cepa de siembra (más caliente no es mejor) es uno que probablemente tendrá que ser determinado por un investigador a través de ensayo y error.
Si se utiliza una etapa de precipitación con PEG, sería beneficioso incluir un control negativo donde un medio de caldo estéril se procesa de forma idéntica al sobrenadante del cultivo. Esto asegurará que la muerte de actividad no es el resultado de PEG residual o cloroformo en el sobrenadante de la muestra.
Como ambos bacteriófagos y bacteriocinas tienden a ser altamente específico, no es raro encontrar ninguna actividad de eliminación aparente con una combinación dada de cepas. Esto puede resultar de una variedad de re-cepa específicasistance mecanismos, uno de ellos que la cepa de ensayo o bien carece o tiene una versión no reconocida de los receptores necesarios para la orientación de una bacteriocina o bacteriófago dado.
Un método alternativo, el método de detección de bacteriocina ha sido descrito por Kawai et al. , Pero adolece de inconvenientes y no ha sido ampliamente adoptado 16. Específicamente, esta técnica requiere la observación de muestras de caldo a intervalos de tiempo que pueden ser una carga, y no permite que para la discriminación entre las actividades de matanza-bacteriófagos derivados y derivados de bacteriocina.
Las principales limitaciones de esta técnica es que no es muy adecuado para los organismos que no crecen robustamente (y por lo tanto se verá privada de zonas de compensación fácilmente discernibles) o que prophages puerto o bacteriocinas que no se producen robusta en condiciones de laboratorio. La adaptación de esta técnica para detectar las bacteriocinas producidas en muestras ambientales que tanto ampliar la utilidadde esta técnica y facilitar una mayor comprensión de la función de las bacteriocinas dentro de un ambiente natural.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
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