Abstract
הטכניקה כיסוי רך אגר פותחה במקור לפני למעלה מ -70 שנה ויש בו נעשה שימוש נרחב מספר תחומי מחקר מיקרוביולוגי, כולל עבודה עם ופאג'ים ו bacteriocins, סוכנים אנטיבקטריאלי חלבוניים. גישה זו היא זולה יחסית, עם דרישות משאבים מינימאליות. טכניקה זו מורכב תצפית supernatant מן זן תורם (מחסה פוטנציאל תרכובת רעילה (ים)) על גבי כיסוי אגר רך הקרושה כי הוא זרע עם זן מבחן בקטריאלי (שעשוי להיות רגיש אל התרכובת הרעילה (ים)). ניצלנו בטכניקה זו כדי להקרין ספריה של Pseudomonas syringae זנים להרג intraspecific. על ידי שילוב גישה זו עם צעד ממטר ומחיקות גן ממוקדות, תרכובות רעילות מרובות המיוצרות על ידי הזן הזהה יכולות להיות מובחנות. שני הסוכנים אנטגוניסטית התאוששו בדרך כלל באמצעות טכניקה זו הם ופאג'ים ו bacteriocins. סוכנים שני אלה יכולים להיות מובחנים באמצעותשתי בדיקות נוספות פשוט. ביצוע דילול סדר על supernatant המכיל בקטריופאג יגרום הפלאק בודד אהיה פחות במספרים עם דילול גדול יותר, ואילו דילול סדרה של supernatant המכיל bacteriocin יגרום אזור קרחת הופך אחיד יותר עכור עם דילול גדול יותר. בנוסף, בקטריופאג יפיק אזור סליקה כאשר הבחין על שכבה אגרה רכה טריה זורעת עם הזן הזהה, ואילו bacteriocin לא יצר אזור סליקה כאשר הועבר מדשאה אגרה רכה טריה, בשל הדילול של bacteriocin.
Introduction
לאחרונה, חלה התעניינות משמעותית להעמקת ההבנה שלנו של אקולוגיה של חיידקים (בעיקר microbiomes של סביבות שונות), כמו גם תרכובות אנטיבקטריאלי חדשות להשתמש במאבק פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. נושא מקשר בין האינטרסים אלה הוא הבנת אינטראקציות אנטגוניסטית בין זני חיידקים בסביבתם הטבעית. ישנן דרכים רבות בהן חיידקים להרגיז המתחרים 3. Bacteriocins, קבוצה מגוונת של תרכובות חלבוניים, אנטיבקטריאלי, נחקרו ארוכות על תפקידם בתיווך אנטגוניזם interbacterial, עם שני המינים הנחקרים ביותר להיות Pseudomonas aeruginosa 4,5 ו Escherichia coli 6, פתוגנים אנושיים חשובים. בנוסף bacteriocins, המושרה prophages יכול גם פועלים כסוכני anticompetitor, המאפשר זן לפלוש לתוך נישה כי כבר יישבו 7. Pseudomonas syringae הוא פתוגן צמח ידוע לייצר מערך סוכני מיקרוביאלית, כולל bacteriocins חלבון היחיד 8, נגזרות זנב בקטריופאג bacteriocins 9 (המכונה tailocins), כמו גם מטבוליטים משניים שאינם חלבוניים 10. לאחרונה חלה התעניינות בהבנה כיצד antimicrobials אלה משפיע על האקולוגיה של האורגניזם הזה, כמו גם איך הם יכולים להיות רתומים לשלוט צמח מחלה 11.
שיטת שימוש נרחבת ללימוד הוא bacteriocins ו בקטריופאג היא טכניקת הכיסוי הרכה-אגר. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Gratia בשנת 1936 על מנת לסייע בתהליך ספירת 12,13 bacteriophage.
כאן אנו מתארים את יישום שיטת הכיסוי הרך-אגר, בשילוב עם מניפולציה גנטית ממוקדת פוליאתילן גליקול (PEG) ממטרים, שחר להבחנה בתוך שלושה סוכנים מיקרוביאלית שונים (א בקטריופאג, bact משקל מולקולרי גבוהeriocin, וכן bacteriocin משקל מולקולרי נמוך) המיוצר על ידי זן חיידקים אחד. היתרון של גישה זו הוא כי זה יחסית פשוט וזול, וזו הסיבה, למרות היותו זה בהחלט "לואו-טק", הוא עדיין שימוש נרחב.
Protocol
1. הכנת Supernatant להיבדק עבור פעילות
- הכן פתרון מניות 0.5 מ"ג / מ"ל של C mitomycin ידי המסת את הכמות המתאימה לתוך 0.1 סטרילי חיץ M MgSO 4 (חיץ למשל 1 מ"ג mitomycin C / 2 מ"ל). חנות המניה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל מוגן האור (C mitomycin רגיש לאור).
- לחסן מושבה אחת של פ syringae לתוך 3 מיליליטר של B הבינוני של המלך (KB) מרק 14. דגירה במשך הלילה עם רועד (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר (21-25 מעלות צלזיוס).
- למחרת בבוקר, לדלל את התרבות מרק 1/100 לתוך 3 מ"ל של מרק KB טריים. דגירה של 3-4 שעות עם רעד בטמפרטורת החדר. להוסיף C mitomycin (0.5 מיקרוגרם / מ"ל, הריכוז הסופי). דגירה התרבות במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר.
הערה: mitomycin C גורמת הפסקות DNA גדילים כפולות, ובכך ממגרת את תגובת ה- SOS של התא, המוביל ליצירה של שני בקטריופאג ו bacteriocins. - גלולה 1-2 מ"ל mitomycin C המושרה תרבויות על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 5 דקות ב microcentrifuge הספסל העליון.
- הסר לעקר supernatants תרבות או על ידי העברת supernatant דרך פילטר גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר או על ידי טיפול supernatant עם כלורופורם (100 כלורופורם μl לכל 1 מ"ל supernatant).
- אם באמצעות כלורופורם, המערבולת התערובת במשך 15 שניות ולתת דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות.
הערה: כלורופורם ביעילות הורג תאים על ידי solubilizing הקרומים שלהם. היתרון של שימוש כלורופורם על עיקור מסנן הוא שזה זול יותר וקל יותר לגמלן אם עיבוד רב (> 20) דגימות בכל פעם. תיתכן אפשרות כי פעילות הרג נתונה אבודה לאחר טיפול כלורופורם כתוצאת מחיצות לשלב האורגני. - הסר את השלב העליון, מימי באמצעות pipet 1 מיליליטר ל 1.5 או 2.0 מיליליטר טרי, סטריליצינור microfuge. היזהר שלא להעביר כל שכבת כלורופורם הנמוכה (עדיף להסיר פחות של השלב המימי כדי למנוע מעל carry).
- דגירה supernatant הועבר ופתחה במנדף לאפשר כלורופורם שיורית להתאדות (כמה שעות). supernatants חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- אם באמצעות כלורופורם, המערבולת התערובת במשך 15 שניות ולתת דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות.
2. ההפרדה וריכוז של תרכובות חיידקים משקל מולקולרי גבוה ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות
- כדי supernatant סטרילי, להוסיף NaCl ו PEG 8000 עד 1 מ 'ו -10% ריכוזיים סופי, בהתאמה. שוב ושוב להפוך את המדגם עד שני NaCl ו PEG מתמוססים לחלוטין. דגירה דגימות באמבט קרח למשך שעה 1 או לילה ב 4 ° C..
- צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.. גלולה צריכה טופס בתחתית הצינור צנטריפוגות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה בנפח הרצוי (כגון 1/10 או 1/100 של vol supernatant המקוריume) של חיץ (10 מ"מ טריס, 10 מ"מ MgSO 4, pH 7.0) על ידי pipetting חזר.
- הסר PEG שיורי על ידי שתי עקירות רציפות עם נפח שווה של כלורופורם.
- שלב כלורופורם עם הגלולה ו המערבולת המושעית למשך 10 עד 15 שניות, ואז צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את השלב העליון, מימית לצינור microfuge טרי. חזור על החילוץ הזה עד אין ממשק לבן בין השלב המימי ואורגני גלוי (בדרך כלל 2 עקירות סכות הכל). אפשר כלורופורם שיורית להתאדות מן supernatants חילוץ במנדף.
3. הכנת השכבה ובדיקת Supernatants עבור פעילות
- לחסן מושבה אחת של זן פ syringae להיבדק עבור רגישות לתוך 3 מ"ל של KB, דגירה במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר.
- למחרת בבוקר, חזרה לדלל את התרבות 1/100 לתוך KB הטרי. דגירה 3-4 שעות עם רועד ב חדר טמפרטורותמִחָדָשׁ.
- כן אגר מים מעוקרים ידי מעוקר% השעית 0.35-0.7 (w / v) אגר במי ultrapure.
הערה: מלאי של אגר מים רכים יכולים להיות נמס במיקרוגל ולעשות בהם שימוש חוזר שוב ושוב, כיסוי טרי לא צריך להיות מוכן עבור כל ניסוי. אם אגר מים לשימוש חוזר, זה קריטי כדי לוודא שהוא נמס לגמרי בא במיקרוגל. אם לא, את שכבת-העל יצטרך מרקם מחוספס על ולהתגבש שיגרום פרשנות קשה. במקרה זה, להמיס את אגר במשך כמה דקות יותר במיקרוגל מאשר לעשות בעבר. - שמירה על אגר רך המותך באמבט מי C ° 60 לפני השימוש. שימוש pipet סרולוגיות סטרילי, העברת 3 מ"ל של אגר רך לצינור תרבות סטרילי. החזר את צינור התרבות באמבט מים כדי לשמור אותן במצב מותך.
- כדי לשפוך את הכיסוי, ראשון לאפשר אגר מותך להתקרר (זה צריך להרגיש חמים אך לא חם למגע), אך אינו מאפשר לחזק.
- במנדף סטרילי, לחסן 100 μl שלתרבות הזן הבוחן לתוך אגר ו המערבולת הרכות לערבב. סובב תרבות ביד במשך 10-15 שניות, ואז לשפוך על גבי (אגר KB) אגר תחתון. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח את אגרתי הרך באופן ברור מכסה את אגר התחתון.
הערה: אגר התחתונה יכול להיות כל הקרושה (1.5% אגר) בינוני שבו זן הבדיקה גדל במרץ. עבור צלחת בקוטר סטנדרטי 100 מ"מ פטרי, השתמש ~ 20 מ"ל נמס בינוני. אגר התחתונה אפשר להכין כמה שבועות לפני הזמן (אם שמרו על 4 מעלות צלזיוס ללא ייבוש) או ניתן להכין באותו יום. אם מוכן באותו היום כמו ביצוע הכיסוי, עדיף לעשות זאת לפני שלב 3.4. - מכסים את הצלחת ולאפשר לו 20-30 דקות כדי לחזק. היזהר שלא להפריע את הצלחת תוך לחיזוק.
- לאחר הקרושה, במקום 2-5 μl של supernatant (שנוצר בסעיפים 1 ו -2 לעיל) על השכבה. אפשר הצלחות כדי לדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. להתבונן תוצאות שיא למחרת בבוקר.
הערה:עשוי להיות שימושי כדי לבצע ספוט מתוך דילול סדרתי של supernatant. זה יאפשר לחוקרים להבחין בין בקטריופאג ואת פעילות הסליקה bacteriocin. במקרה זה, מומלץ לבצע 1: 5 או 1:10 דילולים.
Representative Results
השילוב של הכיסוי אגר הרך ממטרי PEG יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין סוכני מיקרוביאלית שונים המיוצרים על ידי אותו הזן. איור 1 מציג שני זנים של פ syringae (A ו- B) כי מעוכבים על ידי זן שלישי מאותו המין. שני הזנים, לעומת זאת, מעוכבים על ידי bacteriocins השונה. אזור סליקת זן מפגין קצה חד, ואילו אזור סליקת B מתח הוא גדול, והוא מציג גבול הלא חדה. מניפולציות גנטיות בתוך הזן לייצר באופן ספציפי להשבית גם את tailocin (tailocin לקוי) או משקל מולקולרי נמוך bacteriocin (bacteriocin לקוי) לאשר כי זני A ו- B רגישים bacteriocins הברור. איור 2 מראה כי הרג בתיווך בקטריופאג ניתן להבחין בין antimicrobials הלא בשכפול הדנ"א האחר על ידי השוואת סדרת דילול. מכיוון שגם bacteriocins וprophage יכול להיגרם על ידי טיפול C mitomycin, פעילותם של שני חומרים אלה יכולים להידמות הדוק זה לזה (במיוחד אם הפאג מופעל בשפע). במקרה של סליקה בתיווך בקטריופאג, דילול של supernatant יפתור לתוך הפלאק בודד (אזורי סליקה) בעוד סליקת bacteriocin בתיווך לא תפתור לתוך הפלאק כזה.
איור 1: הבחנה פנוטיפי של סוכני מיקרוביאלית מרובים המיוצרים על ידי הזן הזהה. זן הוא רגיש bacteriocin משקל מולקולרי גבוה (tailocin) אך לא משקל מולקולרי נמוך אלטרנטיבה bacteriocin, כפי שמעידים חוסר סליקת זן tailocin הלקוי, אך לא זן bacteriocin הלקוי. לעומת זאת, זן B הוא חסר רגישות tailocin, אבל הוא רגיש bacteriocin המשקל המולקולרי הנמוך. Tailocin הוא efficiently התאושש הבאים ממטרים PEG, בעוד bacteriocins משקל מולקולרי נמוך אינם. WT = סוג בר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הבחנה בין אי-בשכפול הדנ"א antimicrobials ופאג'ים. (א) דילול של כייל גבוה של תוצאות ופאג'ים פלאק הבודד שהופכים פחות רב (למעלה כייל גבוה, בתחתית כייל נמוכה). (ב) דילול של תוצאות bacteriocins בסליקה פחות אחיד כי אינו פותר לתוך הפלאק בודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
טכניקת הכיסוי הרך אגר המתוארת כאן יושמה נרחבת במשך עשרות שנים רבות על ידי חוקרים מעוניינים ופאג'ים או bacteriocins. היתרונות העיקריים של גישה זו הם כי הוא פשוט, זול יחסית קל לפרש. על ידי שילוב של כיסוי רך אגר עם ממטרים PEG ו דילול סדרתי, סוכני מיקרוביאלית ניתן לחלק גבוה לעומת סוכנים משקל מולקולרי נמוך, בשכפול הדנ"א לעומת סוכנים שאינם בשכפול הדנ"א (כלומר בקטריופאג לעומת tailocin, בהתאמה). לבסוף, שילוב של מניפולציה גנטית ממוקדת (מחיקות שלמות) של bacteriocin המשוערת או לוקוסי prophage יכול לקבוע את זהותה בתקיפות של תרכובת נתונה אנטגוניסטית. השתמשנו לאחרונה בשיטה זו כדי לתאר בקטריופאג הנגזרות חדש bacteriocin הרווחת בקרב Pseudomonas syringae זנים 9.
תקשורת הצמיחה ותנאים מצוינים עבודה בפרוטוקול זה גם עבור Pseudomonas סאיםringae ו יספיק סביר עבור חיידקים גראם-שלילי אחרים הגדלים במרץ בתנאים אלה. עם זאת, חוקרים בשיטה זו ירצו לייעל את העיתוי, בינוני התרבות, שיטת אינדוקציה, וטמפרטורת דגירה של המערכת שלהם. הפרמטרים הקריטיים כוללים גרימת התרבות לייצר תוך בשלב צמיחת הלוגריתמים, כמו גם זריעת הכיסוי רך אגר עם תרבות בשלב לוגריתמים מספיק כדי להבטיח חלוקת חיידקים אחידה, אבל לא התרבות יתר, אשר מטשטשת אזורי סליקה פוטנציאליים. ישנם bacteriocins רב שאינם מושרים במסגרת תגובת ה- SOS, אלא הם המושרה באמצעות מערכות חישה קוורום מבוסס פפטיד (במיוחד bacteriocins גראם חיובי 15), ובכך, חוקר אולי כדאי להקרין כמה שיטות אינדוקציה שונות (כגון שינוי תוכן תזונתי של גרימה בינונית, או המאפשרים דגירה ממושכת של זן הייצור).
בעת שימושבטכניקה זו, הכיסוי רך אגר חייב להיות נמס ביסודיות ומתוחזק על 55-60 מעלות צלזיוס לפני התוספת של זן הזריעה. היו לנו כמה בניסויים שבם-אגר הרך לא הותך ביסודיות (אם כי מבחינה ויזואלית זה נראה) וגרם שכבה עם מראה מגורען. תוצאות מ שכבה מגורענת עדיין יכולות להיות וניתנות לפרשנות בדרך כלל, עם זאת, זה תלוי את הכח של העיכוב (עיכוב החלש יהיה קשה יותר כדי לצפות). השתנו סופי, בלבול שיש להביא בחשבון בעת השימוש בטכניקה זו היא שהטמפרטורה של אגר המותך מותרת מספיק זמן להתקרר לפני חיסון עם זן הזריעה, כדי למנוע הרג את מתח הזריעה. כדי למנוע בעיה זו, אנו להבטיח את אגר רך חם, אבל לא חם, לגעת. ברוח דברים אלה, יש לנו גם ציינו כי אם אנחנו נותנים זמן מספיק בשביל תרבות זריעה להסתגל אגרתי המותך, לפני מזיגת הכיסוי, אנחנו מחלצים גרמו חיידקי עניים בדרך כללrowth, מה שהופך פרשנות של עיכוב ספציפי קשה או בלתי אפשרי לפרש. זו הסיבה שאנו מאפשרים 10-15 שניות נוספות של דגירה בין vortexing ושופך השכבה. Trade-off בין השמירה על אגר במצב מותך לחלוטין (חם עדיף) אך לא חשף את מתח הזריעה (חם הוא לא טוב יותר) הוא אחת כי סביר להניח שאתה צריך להיקבע על ידי חוקר באמצעות ניסוי וטעייה.
אם צעד ממטרי PEG משמש, זה יהיה מועיל לכלול שליטה שלילית שבו מדיום מרק סטרילית מעובד זהה supernatant התרבות. פעולה זו תבטיח כי הרג הפעילות אינה תוצאה של PEG שיורית או כלורופורם בתוך supernatant המדגם.
כפי שניהם ופאג'ים ו bacteriocins נוטים להיות מאוד ספציפי, אין זה נדיר להיתקל אין פעילות הרג לכאורה עם שילוב של זנים נתונים. זה יכול לנבוע ממגוון מחדש זן ספציפימנגנוני sistance, אחד להיות כי המתח הבוחן או חסר או יש גרסה לא מוכרת של הקולטן דרושי מיקוד ידי bacteriocin או bacteriophage נתונים.
שיטה חלופית, שיטת הקרנת bacteriocin תוארה על ידי קאוואי et al. , אבל סובל חסרונות ולא אומצה 16 נרחב. באופן ספציפי, טכניקה זו מחייבת התבוננות דגימות מרק במרווחי זמן שיכול להיות מעיק, ואינה מאפשרת לאפליה בין פעילויות הרג בקטריופאג נגזרות bacteriocin הנגזרת.
המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא כי הוא אינו מתאים גם עבור אורגניזמים שאינם גדלים וחסון (ובכך יחסרו אזורי סליקה להבחין בקלות) או כי prophages הנמל או bacteriocins שלא מיוצרים וחסונה בתנאי מעבדה. לאימוצו של הטכניקה הזו כדי לזהות bacteriocins מיוצר דגימות סביבתיות הן ירחיב את תוכנית השירותבטכניקה זו ולהקל להבין טוב יותר את התפקיד של bacteriocins בתוך סביבה טבעית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from: Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols (2013).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
