Abstract
Метод наложения мягкого агара первоначально была разработана более 70 лет назад и широко используется в ряде областей микробиологических исследований, включая работу с бактериофагами и бактериоцинов, белковыми антибактериальных агентов. Такой подход является относительно недорогим, с минимальными потребностями в ресурсах. Этот метод состоит из пятнистость супернатант из штамма-донора (потенциально укрывает токсичное соединение (соединения)) на затвердевшей мягкой агара, который засевают бактериальным штаммом (тест потенциально чувствительного к токсичным соединением (ами)). Мы использовали эту технику для скрининга библиотека псевдомонас сиреневый штаммов , используемых для внутривидовой убийства. Комбинируя этот подход с стадии осаждения и целевых делеции гена, множественные токсические соединения, полученные тем же штаммом, могут быть дифференцированы. Два антагонистических агенты, обычно Восстановленные с помощью этой техники являются бактериофаги и бактериоцины. Эти два агента могут быть дифференцированы с помощьюдва простых дополнительных тестов. Выполнение последовательного разбавления на супернатант, содержащий бактериофаг приведет к отдельным бляшек становится все меньше числа с большим разведением, в то время как серийное разведение супернатанта, содержащего бактериоцин приведет очищающего зону, которая становится равномерно более мутной с большим разбавлением. Кроме того, бактериофаг произведет очищающего зону, когда пятнистый на свежую мягкую агара затравку того же штамма, в то время как бактериоцины не будет производить очищающего зону, переносили в свежую мягком агаре газоном, благодаря разбавлению бактерицин.
Introduction
В последнее время наблюдается значительный интерес к углублению нашего понимания экологии микроорганизмов ( в частности microbiomes различных сред), а также новые антибактериальные соединения для использования в борьбе с устойчивых к антибиотикам патогенов 1,2. Толкающей темой между этими интересами является понимание антагонистические взаимодействия между штаммами бактерий в их естественной среде. Есть множество способов , в которых бактерии антагонистами конкурентов 3. Бактериоцинов, разнообразная группа белковыми, антибактериальных соединений, уже давно изучена их роль в опосредовании межбактериальном антагонизм, с двумя из наиболее изученных видов , являющихся синегнойной 4,5 и кишечная палочка 6, важные патогены человека. В дополнение к бактериоцинов, индуцированные профаги могут также выступать в качестве anticompetitor агентов, позволяя штамм вторжение в нишу, которая уже колонизирована 7. Pseudomonas syringae это растение патоген известно, производят множество противомикробных агентов, в том числе один белок бактериоацинов 8, бактериофагов хвостовых происхождения бактериоацинов 9 (называемые tailocins), а также небелковые вторичных метаболитов 10. В последнее время наблюдается интерес к пониманию того, как эти противомикробные влияют на экологию этого организма, а также каким образом они могут быть использованы для борьбы с болезнями растений 11.
Широко используется метод изучения обоих бактериоцинов и бактериофагов является мягкой агара метод наложения. Этот метод был впервые описан в 1936 году Gratia на помощь в перечислении бактериофага 12,13.
Здесь мы описываем применение метода мягкого агара, в сочетании с целенаправленным генетической манипуляции и полиэтиленгликоль (ПЭГ) осаждения, в различении среди трех различных антимикробных агентов (бактериофаг, высокая молекулярная масса Bacteriocin, а вес Бактериоцин низкомолекулярный), полученный от одного штамма бактерий. Преимущество такого подхода заключается в том, что она является относительно простым и дешевым, поэтому, несмотря на его явно "низкотехнологичных", он до сих пор широко используется.
Protocol
1. Получение надосадочной быть проверены на активность
- Готовят 0,5 мг / мл исходного раствора митомицина с растворением соответствующего количества в стерильном 0,1 М MgSO 4 буфера (например , 1 мг митомицин С / 2 мл буфера). Хранить запас при 4 ° С в защищенном от света контейнере (митомицина чувствителен к свету).
- Привить одну колонию P. syringae в 3 мл среды B Кинга (KB) бульоне 14. Инкубируют в течение ночи при встряхивании (200 оборотов в минуту) при комнатной температуре (21-25 ° С).
- На следующее утро, развести бульон культуры 1/100 в 3 мл свежего бульона KB. Выдержите в течение 3-4 ч при встряхивании при комнатной температуре. Добавить митомицин С (0,5 мкг / мл, конечная концентрация). Инкубируйте культуру в течение ночи при встряхивании при комнатной температуре.
Примечание: Митомицин С вызывает двухцепочечные разрывы ДНК, тем самым стимулируя SOS реакцию клетки, что приводит к производству как бактериофаг и бактериоцинов. - Гранула 1-2 мл митомицин С Индуцированные культуры центрифугированием при 20000 х г в течение 5 мин в настольной микроцентрифуге.
- Удалить и стерилизовать культуральных супернатантов либо путем пропускания супернатанта через фильтр с размером пор 0,22 мкм или с помощью обработки надосадочной жидкости хлороформом (100 мкл хлороформа на 1 мл надосадочной жидкости).
- Если с использованием хлороформа, вихревые смесь в течение 15 сек, и пусть инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации смесь центрифугируют при 20000 х г в течение 5 мин.
Примечание: Хлороформ эффективно убивает клетки путем растворения их мембраны. Преимущество использования хлороформа над фильтром стерилизации является то, что это дешевле и проще масштабировать, если обрабатывать много (> 20) образцов одновременно. Там может быть возможность того, что данное убийство активность теряется после обработки хлороформом в результате его перераспределению в органическую фазу. - Удалите верхний, водной фазы с использованием 1 мл пипеткой в свежую, стерильные 1,5 или 2,0 млпробирке. Будьте осторожны, чтобы не передавать какие-либо из нижнего слоя хлороформа (лучше удалить меньше водной фазы, чтобы избежать унос).
- Выдержите переданный супернатант раскрытый в вытяжном шкафу, чтобы остаточный хлороформ испаряться (несколько часов). Хранить надосадочную жидкость при температуре 4 ° С.
- Если с использованием хлороформа, вихревые смесь в течение 15 сек, и пусть инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации смесь центрифугируют при 20000 х г в течение 5 мин.
2. Разделение и концентрация с высокой молекулярной массой бактерицидные соединения с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) Осадки
- К стерильной супернатант, добавить NaCl и ПЭГ 8000 до конечной концентрации 1 М и 10%, соответственно. Многократно инвертировать образец до тех пор, как NaCl и ПЭГ полного растворения. Инкубируйте образцы в бане со льдом в течение 1 ч или в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Центрифуга образцов при 16000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Гранулы должны образовывать в нижней части трубки центрифуги. Слейте супернатант и ресуспендируют осадок в желаемом объеме (например, как 1/10 или 1/100 от исходного надосадочной Volумэ) буфера (10 мМ Трис, 10 мМ MgSO 4, рН 7,0) повторным пипетированием.
- Удаление остатков ПЭГ двумя последовательными извлечений с равным объемом хлороформа.
- Объединить хлороформа с ресуспензированной окатышей и вихревые течение от 10 до 15 сек, а затем центрифугировать смесь при 20000 х г в течение 5 мин. Перенести верхний, водной фазы в свежей пробирке. Повторите этот экстракционный, пока не белый граница раздела между водной и органической фазы не видна (обычно 2 извлечений общего объема). Разрешить остаточный хлороформ испаряться из добытых супернатантов в вытяжном шкафу.
3. Подготовка наложению и тестирования супернатантов для деятельности
- Инокулируйте одну колонию штамма P. syringae быть тестировали на чувствительность в 3 мл КБ, инкубировать в течение ночи при встряхивании при комнатной температуре.
- На следующее утро, снова разбавить культуру 1/100 в свежую КБ. Выдержите 3-4 ч при встряхивании при комнатной temperatuчисло рейнольдса
- Приготовьте стерилизованные агар воды автоклавированием суспензионный 0.35-0.7% (вес / объем) агаре в сверхчистой воде.
Примечание: Запас мягком агаре воды может быть расплавлен в микроволновой печи и повторно несколько раз, свежий наложения не должны быть подготовлены для каждого эксперимента. Если вода агар повторно, очень важно, чтобы убедиться, что он полностью расплавится следующие микромахая. Если нет, то наложение будет иметь зернистую текстуру при твердеть, что сделает толкование трудно. Если это происходит, расплавить агар в течение нескольких минут дольше в микроволновой печи, чем это делалось раньше. - Поддержание расплавленной мягком агаре в C водяной бане при 60 ° до использования. С помощью стерильной пипетки серологические, перенос 3 мл мягком агаре к стерильной культуральную пробирку. Возвратить культуральную пробирку на водяной бане, чтобы поддерживать в расплавленном состоянии.
- Перелить наложения, сначала дайте расплавленный агар остыть (она должна быть теплой, но не жарко трогать), но не позволяют затвердеть.
- В стерильных капот, инокуляции 100 мклкультура тестер деформации в мягком агаре и вихрем перемешать. Поворотом культуру вручную в течение 10-15 сек, затем вылить на дно агар (агар KB). Наклон пластины во всех направлениях, чтобы обеспечить мягкий агар равномерно покрывает дно агар.
Примечание: Нижний агар может быть любой затвердевает (1,5% агар) носитель, на котором тест штамм растет энергично. Для стандартного 100 мм диаметр чашки Петри, использовать ~ 20 мл расплавляют среды. Дно агара можно приготовить за несколько недель до времени (если поддерживается при температуре 4 ° С без сушки) или могут быть получены в тот же день. Если подготовлен в тот же день, как выполнять наложение, то лучше сделать это до этапа 3.4. - Закройте планшет и дать ему 20-30 минут до затвердевания. Будьте осторожны, чтобы не нарушить тарелку во время затвердевания.
- После затвердевания пятно 2-5 мкл супернатанта (генерироваться в разделах 1 и 2, выше) на накладкой. Разрешить планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Наблюдать и записывать результаты на следующее утро.
Обратите вниманиеможет быть полезно для выполнения и пятна от серийного разведения супернатанта. Это позволит исследователям различать бактериофагов и бактериоцинов клиринговой деятельности. В этом случае рекомендуется выполнить 1: 5 или 1:10 разведений.
Representative Results
Сочетание мягкого агара и ПЭГ осаждения могут быть использованы для идентификации и характеристики различных антимикробных агентов, получают тем же самым штаммом. На рисунке 1 показаны два штамма P. syringae (A и B) , которые ингибируются третьего штамма того же вида. Эти два штамма, однако, подавляются различными бактериоцинов. Клиринг зона на штамма А демонстрирует острый край, в то время как очистка зоны от штамма B больше, и обнаруживает, не резкую границу. Генетические манипуляции внутри продуцирующего штамма, который специфически инактивируют либо tailocin (tailocin дефицитных) или низкой молекулярной массой Бактериоцин (Бактериоцин дефицитной) подтверждают, что штаммы А и В чувствительны к различным бактериоцинов. На рисунке 2 показано , что бактериофаг-опосредованному лизису можно отличить от других нерепликативная антимикробных путем сравнения серии разведений. Так как бактериоцинов иПрофаг можно индуцировать путем обработки митомицином С, активность этих двух агентов может очень похожи друг на друга (в частности, если активированный фаг обильна). В случае бактериофаг-опосредованных очистки, разбавление надосадочной жидкости разрешат на отдельные бляшки (клиринговые зоны) в то время как бактериоциноподобные опосредованной очистка не разрешит в таких бляшек.
Рисунок 1: фенотипические различие нескольких антимикробных агентов получают тем же самым штаммом. Штамм А чувствителен к высокой молекулярной массы бактерицин (tailocin), но не альтернатива с низкой молекулярной массой бактериоцины, о чем свидетельствует отсутствие очистки в tailocin дефицитный штамм, но не бактериоцинов дефицитный штамм. С другой стороны, штамм В нечувствительна к tailocin, но чувствителен к весу бактерицин низкой молекулярной массой. Tailocin является efficвлена выделяют следующие PEG осадков, в то время как более низкие бактериоцины молекулярной массой не являются. WT = дикий тип. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Различие между нерепликативная противомикробных и бактериофагов. (А) Разбавление высоким титром бактериофагов приводит отдельных бляшек , которые становятся менее многочисленными (высокий титр сверху, низкий нижний титр). (B) Разбавление бактериоацинов приводит равномерно меньше очистки , что не разрешает в отдельных бляшек. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Метод наложения мягкого агар, описанный здесь широко применяется в течение многих десятилетий исследователями, заинтересованных в бактериофаги или бактериоцины. Основные преимущества такого подхода заключаются в том, что это просто, дешево и относительно легко интерпретировать. Объединив мягкого агара с ПЭГ осаждением и последовательным разбавлением, антимикробные агенты могут быть разделены на высокие по сравнению с агентами с низким молекулярным весом, и репликативному против нерепликативная агентов (т.е. бактериофаг против tailocin, соответственно). И, наконец, введение целевой генетической манипуляции (удаление и комплементарности) предполагаемых бактерицин или профага локусов может надежно установить личность данного антагонистического соединения. Недавно мы использовали этот метод , чтобы описать новый бактериофагом Бактериоцин распространена среди штаммов псевдомонас сиреневый 9.
Среды для выращивания и условия , указанные в данной работе протокола хорошо для Pseudomonas SYringae и, вероятно , достаточно для других грамотрицательных бактерий , которые растут интенсивно в этих условиях. Тем не менее, исследователи, использующие этот метод, нужно будет оптимизировать время, культуральной среды, метод индукции и температуры инкубации для своей системы. Критические параметры включают в себя индукцию продуктивный культуры в то время как в логарифмической фазе роста, а также засева мягкого агара с достаточной логарифмической фазы культуры, чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий, но не чрезмерной культуры, которая будет заслонять потенциальные зоны клиринга. Есть много бактериоцины, которые не индуцируется как часть реакции SOS, а , скорее , индуцируются через пептидные на основе систем Кворум зондирования ( в частности , грамположительных бактериоацинов 15), таким образом, исследователь может хотят экран несколько различных методов индукции (такие , как изменение содержания питательных веществ индукции среды, или позволяя в течение длительного инкубации продуцирующего штамма).
Когда используешьэта техника, мягкая-агара должна быть тщательно расплавляют и выдерживают при температуре 55-60 ° С перед добавлением штамма высева. Мы провели несколько экспериментов, где мягкая-агар не был полностью расплавлен (хотя визуально она оказалась), в результате наложения с зернистость. Результаты зернистой накладкой по-прежнему может быть в целом интерпретируемым, однако, это зависит от силы торможения (более слабого торможения будет труднее заметить). Заключительное, путая переменной следует учитывать при использовании этого метода является то, что температура расплавленного агара дают достаточно времени для охлаждения до инокуляции штаммом высева, с тем, чтобы избежать убийства штамма высева. Чтобы избежать этой проблемы, мы обеспечиваем мягкий агар-тепло, но не жарко, на ощупь. Вдоль этих линий, мы также заметили, что если мы дадим недостаточное время для посева культуры акклиматизироваться к расплавленной агара, перед заливкой наложения, мы возвращаем в целом плохой бактериальный гrowth, что делает интерпретации специфического ингибирования трудно или невозможно интерпретировать. Вот почему мы позволяем 10-15 дополнительных секунд инкубации между встряхиванием и заливке накладку. Компромисс между сохранением агара в полностью расплавленном состоянии (горячее, тем лучше), но не смертельным для штамма высева (горячее не лучше) является тот, который, скорее всего, должны быть определены исследователем путем проб и ошибок.
Если стадию осаждения ПЭГ используется, было бы полезно, чтобы включать в качестве отрицательного контроля, где стерильный бульон среда обрабатывались идентично в культуральный супернатант. Это гарантирует, что убийство активность не является результатом остаточного PEG или хлороформа в образце супернатанта.
Поскольку оба бактериофаги и бактериоцины, как правило, весьма специфичны, это не редкость, не сталкиваться никакого очевидного убийства активности с данной комбинации штаммов. Это может быть результатом множества штаммоспецифический ремеханизмы низкоомными, один из которых, что штамм тестер либо отсутствует, либо имеет непризнанную версию рецептора, необходимого для ориентации на заданную бактерицин или бактериофага.
Альтернативный метод, Бактериоцин метод скрининга был описан Kawai и соавт. , Но страдает от недостатков и не был широко принят 16. В частности, этот метод требует наблюдения пробы бульона с интервалом времени, который может быть обременительным, и не допускает дискриминации между бактериофагом и бактериоциноподобные полученных деятельности убийства.
Основные недостатки этого метода является то, что он не очень хорошо подходит для организмов, которые не растут энергично (и, таким образом, будет не хватать легко различимые клиринговые зоны), или гавани профагов или бактериоцины, которые не производятся робастно в лабораторных условиях. Адаптация этой методики для обнаружения бактериоцины, произведенных в пробах окружающей среды будет и расширить полезностьэтой техники и облегчить более полное представление о роли бактериоцинов в пределах естественных условиях.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from: Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols (2013).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
