L'utilisation de la technique de superposition Soft-agar à l'écran pour les composés inhibitrices produites par voie bactérienne

Abstract

La technique d'incrustation-agar mou a été initialement développé il y a plus de 70 ans et a été largement utilisé dans plusieurs domaines de la recherche microbiologique, y compris le travail avec des bactériophages et des bactériocines, des agents antibactériens protéiniques. Cette approche est relativement peu coûteux, avec des besoins en ressources minimales. Cette technique consiste à repérer surnageant à partir d'une souche donneuse (potentiellement héberger un composé (s) toxique) sur une couche de gélose molle solidifié qui est ensemencé avec une souche bactérienne de test (potentiellement sensible au composé toxique (s)). Nous avons utilisé cette technique pour cribler une bibliothèque de Pseudomonas syringae souches pour tuer intraspécifique. En combinant cette approche avec une étape de précipitation et la délétion de gènes ciblés, plusieurs composés toxiques produits par la même souche peuvent être différenciées. Les deux agents antagonistes généralement récupérés en utilisant cette technique sont bactériophages et bactériocines. Ces deux agents peuvent être différenciés en utilisantdeux tests supplémentaires simples. Exécution d'une dilution en série sur un surnageant contenant le bactériophage se traduira par des plaques individuelles deviennent moins nombreux avec une plus grande dilution, alors que la dilution en série d'un surnageant contenant des bactériocines entraînera une zone de compensation qui devient uniformément plus turbide avec une plus grande dilution. En outre, un bactériophage produira une zone de compensation lorsque repéré sur une couche de gélose molle fraîche ensemencé avec la même souche, alors qu'un bactériocine ne produira pas une zone de compensation lorsqu'ils sont transférés sur une pelouse agar mou frais, en raison de la dilution de la bactériocine.

Introduction

Récemment, il y a eu beaucoup d' intérêt à approfondir notre compréhension de l' écologie microbienne ( en particulier les microbiomes de divers environnements), ainsi que de nouveaux composés antibactériens à utiliser dans la lutte contre les agents pathogènes résistants aux antibiotiques ^1,2. Un thème d'interconnexion entre ces intérêts est de comprendre les interactions antagonistes entre les souches bactériennes dans leur milieu naturel. Il existe de nombreuses façons dont les bactéries antagonistes concurrents ^3. Bactériocines, un groupe diversifié de composés antibactériens, protéiniques, ont longtemps été étudiés pour leur rôle dans la médiation de l' antagonisme interbacterial, avec deux des espèces les plus étudiées étant Pseudomonas aeruginosa ^4,5 et Escherichia coli ^6, agents pathogènes humains importants. En plus de bactériocines, prophages induits peuvent également agir en tant qu'agents de anticompetitor, permettant une souche d'envahir dans une niche qui est déjà colonisée ^7. Pseudomonas syringae est un pathogène végétal connu pour produire un éventail d'agents antimicrobiens, y compris des bactériocines simples de protéines ^8, bactériophages bactériocines arrière dérivés ⁹ (tailocins appelés), ainsi que des métabolites secondaires non-protéiniques ^10. Récemment il y a eu intérêt à comprendre comment ces antimicrobiens influencent l'écologie de cet organisme, ainsi que la façon dont ils peuvent être exploitées pour lutter contre les maladies des plantes ^11.

Un procédé largement utilisé pour étudier les deux bactériocines et le bactériophage est la technique de superposition gélose molle. Cette méthode a été décrite par Gratia en 1936 à l' aide de l' énumération bactériophage ^12,13.

Nous décrivons ici l'application de la méthode de superposition de la gélose molle, en association avec la manipulation génétique ciblée et de polyéthylène glycol (PEG), pour distinguer les trois agents antimicrobiens différents (un bactériophage, d'un bact de poids moléculaire élevéeriocin et une bactériocine de bas poids moléculaire), produite par une souche bactérienne unique. L'avantage de cette approche est qu'elle est relativement simple et pas cher, ce qui explique pourquoi, malgré qu'il soit décidément «low-tech», il est encore largement utilisé.

Protocol

1. Préparation du surnageant à tester pour l'activité

1. Préparer un ml de solution 0,5 mg / stock de mitomycine C en dissolvant la quantité appropriée dans stérile 0,1 M MgSO ₄ tampon (par exemple 1 mg de mitomycine C / 2 ml de tampon). Magasin stock à 4 ° C dans une lumière conteneur protégé (mitomycine C est sensible à la lumière).
2. Inoculer une seule colonie de P. syringae dans 3 ml de milieu B de King (KB) de bouillon ^14. Incuber pendant la nuit sous agitation (200 rpm) à température ambiante (21-25 ° C).
3. Le lendemain matin, diluer le bouillon de culture de 1/100 dans 3 ml de bouillon frais KB. Incuber pendant 3-4 heures avec agitation à la température ambiante. Ajouter la mitomycine C (0,5 pg / ml, concentration finale). Incuber la culture pendant la nuit sous agitation à la température ambiante.
   NOTE: mitomycine C provoque des cassures double brin d'ADN, stimulant ainsi la réponse SOS de la cellule, conduisant à la production des deux bactériophage et bactériocines.
4. Pellet 1-2 ml de mitomycine C induite cultures par centrifugation à 20.000 xg pendant 5 min dans une microcentrifugeuse de banc.
5. Enlever et stériliser les surnageants de culture, soit en faisant passer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um de taille des pores ou par traitement du produit surnageant avec du chloroforme (100 pi de chloroforme pour 1 ml de surnageant).
   1. Si vous utilisez le chloroforme, le vortex le mélange pendant 15 secondes et laisser incuber à température ambiante pendant 1 h. Après l'incubation, centrifuger le mélange à 20 000 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Chloroforme tue efficacement les cellules par solubilisation dans leurs membranes. L'avantage d'utiliser du chloroforme sur la stérilisation du filtre est qu'il est moins cher et plus facile à l'échelle supérieure, si le traitement de nombreux (> 20) échantillons à la fois. Il peut y avoir une possibilité qu'une activité de destruction donnée est perdue après un traitement par le chloroforme à la suite de la séparation de la phase organique.
   2. Retirez la phase aqueuse supérieure en utilisant un 1 ml à une pipette fraîche, stérile 1,5 ou 2,0 mlle tube microfuge. Veillez à ne pas transférer de la couche de chloroforme inférieure (il est préférable d'enlever moins de la phase aqueuse pour éviter de report).
   3. Incuber le surnageant a été transféré non plafonnés dans une hotte pour permettre au chloroforme résiduel évaporer (plusieurs heures). surnageants Conserver à 4 ° C.

2. Séparation et concentration des haut poids moléculaire bactéricides composés par le polyéthylène glycol (PEG) Précipitations

1. Au surnageant stérile, ajouter du NaCl et du PEG 8000 à 1 M et 10% des concentrations finales, respectivement. À plusieurs reprises inverser l'échantillon jusqu'à ce que à la fois le NaCl et le PEG sont complètement dissous. Incuber les échantillons dans un bain de glace pendant 1 heure ou une nuit à 4 ° C.
2. Centrifuger les échantillons à 16000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Une pastille doit se former au fond du tube de centrifugation. Décanter le surnageant et remettre le culot dans le volume souhaité (tel que 1/10 ou 1/100 du surnageant vol d'origineUME) du tampon (Tris 10 mM , _MgSO4 10, pH 7,0) par pipetage répété.
3. Éliminer le PEG résiduel par deux extractions successives avec un volume égal de chloroforme.
   1. Combinez le chloroforme avec le culot remis en suspension et vortex pendant 10 à 15 secondes, puis centrifuger le mélange à 20 000 xg pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube de microcentrifugation frais. Répéter cette extraction jusqu'à pas d'interface blanche entre la phase aqueuse et organique est visible (généralement 2 extractions au total). Permettre le chloroforme résiduel à évaporer à partir de surnageants extraits dans une hotte.

3. Préparation de superposition et d'essais surnageants pour l'activité

1. Inoculer une seule colonie d'une souche P. syringae à tester la sensibilité en 3 ml de KB, incuber pendant la nuit sous agitation à la température ambiante.
2. Le lendemain matin, retour diluer la culture 1/100 en KB frais. Incuber 3-4 h avec agitation à la chambre tempéraré.
3. Préparer une gélose eau stérilisée par autoclavage d'une suspension de 0,35 à 0,7% (p / v) d'agar-agar dans de l'eau ultrapure.
   NOTE: Un stock d'agar d'eau douce peut être fondu dans un four micro-ondes et réutilisé à plusieurs reprises, superposition frais n'a pas besoin d'être préparé pour chaque expérience. Si la gélose eau est réutilisée, il est essentiel de veiller à ce qu'il soit complètement fondu suivant microwaving. Sinon, la superposition aura une texture granuleuse sur la solidification qui rendra difficile l'interprétation. Si cela se produit, faire fondre la gélose pendant plusieurs minutes de plus dans le micro-ondes que fait précédemment.
4. Maintenir la gélose molle fondue dans un bain d'eau C 60 ° avant de l'utiliser. À l'aide d'une pipette sérologique stérile, transférer 3 ml d'agar mou à un tube de culture stérile. Remettre le tube de culture à bain d'eau pour maintenir dans un état fondu.
5. Verser la superposition, permet d'abord l'agar fondu pour refroidir (il devrait se sentir chaud mais pas chaud au toucher), mais ne permettent pas de se solidifier.
6. Dans une hotte stérile, ensemencer 100 ul dela culture de la souche d'essai dans l'agar mou et vortex pour mélanger. Tourner la culture à la main pendant 10-15 secondes, puis versez sur une gélose au fond (KB agar). Inclinez la plaque dans toutes les directions pour assurer la gélose molle couvre uniformément la gélose de fond.
   NOTE: L'agar fond peut être l'un quelconque (1,5% de gélose) solidifiée sur lequel la souche d'essai se développe vigoureusement. Pour un diamètre plat standard de 100 mm de Pétri, utilisez ~ 20 ml fondu moyenne. L'agar de fond peut être préparé plusieurs semaines à l'avance (si elle est maintenue à 4 ° C sans séchage) ou peuvent être préparés le jour même. Si préparé le même jour que l'exécution de la superposition, il est préférable de le faire avant l'étape 3.4.
7. Couvrir la plaque et laisser 20-30 min de se solidifier. Veillez à ne pas perturber la plaque tout en solidifiant.
8. Une fois solidifié, repérer 2-5 ul de surnageant (généré dans les sections 1 et 2, ci-dessus) sur la superposition. Laisser les plaques à incuber pendant une nuit à température ambiante. Observer et enregistrer les résultats du lendemain matin.
   NOTE: Ilpeuvent être utiles pour effectuer et repérer à partir d'une dilution en série du surnageant. Cela permettra aux chercheurs de distinguer entre les bactériophage et l'activité de compensation bactériocine. Dans ce cas, il est recommandé d'effectuer 1: 5 ou 1:10 dilutions.

Representative Results

La combinaison de la couche de gélose molle et précipitation au PEG peut être utilisé pour identifier et caractériser les différents agents antimicrobiens produits par la même souche. La figure 1 montre deux souches de P. syringae (A et B) qui sont inhibées par une troisième souche de la même espèce. Les deux souches, cependant, sont inhibés par différentes bactériocines. La zone de compensation de la souche A présente une arête vive, tandis que la zone de compensation de la souche B est plus grande, et présente une frontière non-forte. Les manipulations génétiques au sein de la souche productrice qui inactivent spécifiquement l'une ou l'autre tailocin (tailocin déficiente) ou de faible poids moléculaire bactériocine confirm (bactériocine déficiente) que les souches A et B sont sensibles aux bactériocines distinctes. La figure 2 montre que la mise à mort intermédiaire de bactériophages peut être distingué d'autres agents antimicrobiens non réplicatifs en comparant une série de dilutions. Parce que les deux bactériocines etprophage peut être induite par un traitement à la mitomycine C, les activités de ces deux agents peuvent se rapprocher les uns des autres (en particulier si le phage activé est abondant). Dans le cas de compensation intermédiaire de bactériophages, la dilution du surnageant résoudra en plaques individuelles (zones de compensation), tandis que la compensation bactériocine médiée ne résoudra pas dans ces plaques.

Figure 1: distinction phénotypique de plusieurs agents antimicrobiens produits par la même souche. Une souche est sensible à une bactériocine de haut poids moléculaire (de tailocin), mais pas un faible poids moléculaire alternatif bactériocine, comme en témoigne l'absence de compensation de la souche déficiente en tailocin, mais pas la souche déficiente en bactériocine. A l'inverse, la souche B est insensible à la tailocin, mais est sensible à la bactériocine de faible poids moléculaire. Le tailocin est efficiently récupérée à la suite précipitation au PEG, tandis que les bactériocines de plus bas poids moléculaire ne sont pas. WT = type sauvage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Distinguer entre les antimicrobiens et les bactériophages non réplicatifs. (A) Dilution d'un titre élevé d'bactériophages résultats dans des plaques individuelles qui deviennent moins nombreux ( en haut à titre élevé, en bas de faible titre). (B) Dilution des bactériocines résultats en uniforme moins compensation qui ne résout pas en plaques individuelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La technique d'incrustation-agar mou décrit ici a été largement appliquée depuis de nombreuses décennies par des chercheurs intéressés par bactériophages ou bactériocines. Les principaux avantages de cette approche est qu'il est simple, pas cher et relativement facile à interpréter. En combinant la superposition gélose molle avec précipitation au PEG et la dilution en série, les agents antimicrobiens peuvent être séparés en élevés par rapport à des agents de bas poids moléculaire et réplicatives par rapport aux non-réplicatif agents ( par exemple un bacteriophage contre tailocin, respectivement). Enfin, l'incorporation de manipulation ciblée génétique (délétion et complémentation) de bactériocine putative ou loci prophage peut établir fermement l'identité d'un composé antagoniste donné. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour décrire une nouvelle souches bactériophage dérivé bactériocine répandue chez Pseudomonas syringae ^9.

Les médias et les conditions de croissance indiqués dans ce travail de protocole bien pour Pseudomonas syringae et vraisemblablement suffire pour d' autres bactéries à Gram négatif qui croissent vigoureusement dans ces conditions. Cependant, les chercheurs qui utilisent cette méthode veulent optimiser le timing, le milieu de culture, la méthode d'induction, et la température d'incubation de leur système. Les paramètres critiques comprennent l'induction de la culture de production pendant la phase de croissance logarithmique, ainsi que l'ensemencement de la superposition de gélose molle à la culture en phase logarithmique suffisante pour assurer une distribution bactérienne uniforme, mais pas la culture excessive qui obscurcir les zones de compensation potentielles. Il y a beaucoup de bactériocines qui ne sont pas induits dans le cadre de la réponse SOS, mais sont induits par les systèmes de détection de quorum à base de peptides ( en particulier bactériocines Gram-positives ^15), par conséquent, un chercheur peut vouloir filtrer plusieurs méthodes d'induction différents (tels que modifier la teneur en nutriments du milieu inducteur, ou permettant une incubation prolongée de la souche productrice).

lors de l'utilisationcette technique, le recouvrement de gélose molle doit être complètement fondu et maintenu à 55-60 ° C avant l'addition de la souche d'ensemencement. Nous avons eu plusieurs expériences où l'agar mou n'a pas été complètement fondu (bien que visuellement il a semblé être) et a donné lieu à une superposition avec un aspect granuleux. Les résultats d'un revêtement granuleux peuvent encore être généralement interprétable, cependant, cela dépend de la puissance de l'inhibition (inhibition plus faible sera plus difficile à observer). Une variable de confusion finale à considérer lors de l'utilisation de cette technique est que la température de la gélose fondue est autorisé suffisamment de temps pour refroidir avant l'inoculation avec la souche d'ensemencement, de manière à éviter de tuer la souche d'ensemencement. Pour éviter ce problème, nous assurons la-agar mou est chaud, mais pas chaud, au toucher. Le long de ces lignes, nous avons également observé que si l'on donne suffisamment de temps pour une culture d'ensemencement pour acclimater à la gélose fondue, avant de verser la superposition, nous retrouvons généralement pauvres g bactérienneroissance, ce qui rend l'interprétation de l'inhibition spécifique difficile, voire impossible à interpréter. Voilà pourquoi nous permettons à 10-15 secondes supplémentaires d'incubation entre tourbillonnement et en versant le recouvrement. Le compromis entre le maintien de l'agar-agar dans un état complètement fondu (plus chaud est mieux), mais pas létale pour la souche d'ensemencement (plus chaud est pas mieux) est celui qui sera probablement besoin d'être déterminé par un chercheur par essai et erreur.

Si une étape de précipitation, le PEG est utilisé, il serait avantageux d'inclure un contrôle négatif, où un milieu de bouillon stérile est traité de manière identique au surnageant de culture. Ceci garantira que l'activité tuant ne résulte pas du PEG résiduel ou le chloroforme dans l'échantillon surnageant.

Comme les deux bactériophages et bactériocines ont tendance à être très spécifique, il est pas rare de rencontrer aucune activité de mise à mort apparente avec une combinaison donnée de souches. Ceci peut résulter d'une variété de re spécifique de la souchedes mécanismes de sistance, l'une étant que la souche d'essai soit dépourvu ou a une version non reconnue du récepteur nécessaire pour le ciblage par une bactériocine ou un bacteriophage donné.

Une autre méthode est la méthode de criblage de bactériocine a été décrite par Kawai et al. , Mais souffre d'inconvénients et n'a pas été largement adoptée ^16. Plus précisément, cette technique nécessite l'observation des échantillons du bouillon à des intervalles de temps qui peuvent être onéreux et ne permet pas la discrimination entre les activités d'abattage et de bactériophage dérivé bactériocine dérivée.

Les principales limites de cette technique est qu'il ne soit pas bien adapté pour les organismes qui ne poussent pas robuste (et donc va manquer des zones de compensation facilement discernables) ou que prophages portuaires ou bactériocines qui ne sont pas solidement produits dans des conditions de laboratoire. Adaptation de cette technique pour détecter les bactériocines produites dans des échantillons environnementaux permettrait à la fois d'élargir l'utilitéde cette technique et de faciliter une plus grande perspicacité dans le rôle des bactériocines dans les milieux naturels.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.
Polyethylene Glycol (PEG)	Amresco	0159
Bacteriological grade agar	Genesee Scientific	20-274