Abstract
소프트 한천 오버레이 기술은 원래 70 년 전에 개발되어 널리 박테리오파지 및 박테리오신, 단백질 항균제와 작업을 포함하여 미생물 학적 연구의 여러 분야에서 사용되고있다. 이 방식은 최소 리소스 요구, 비교적 저렴하다. 이 기술은 (독성 화합물 (들)에 민감한) 세균 시험 균주로 접종하는 응고 부드러운 한천 오버레이 상 (잠재적으로 독성 화합물 (들)을 은닉) 도너 균주로부터 상층 액에 얼룩을지게로 구성되어 있습니다. 우리는 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)의 라이브러리가 종내 살인에 대한 균주 화면이 기술을 이용했다. 침전 단계 및 표적 유전자 결실이 방법을 조합하여, 동일한 균주에 의해 생성 된 다수의 화합물은 독성이 구별 될 수있다. 일반적으로이 기술을 사용하여 복구 두 대립 에이전트는 박테리오파지 및 박테리오신 있습니다. 이 두 에이전트를 사용하여 구별 할 수있다이 간단한 추가 시험. 박테리오파지를 포함하는 상층 액에 일련의 희석을 수행하면, 큰 희석 수가 적게되고 개별 플라크 발생하는 반면 더 희석 균일 더 혼탁하게 지우기 영역을 초래할 것이다 박테리오신을 함유하는 상층 액 용액을 희석. 박테리오신의 희석으로 인해, 신선한 부드러운 한천 잔디로 전송하는 경우 박테리오신은 청소 영역을 생산하지 않습니다 반면, 동일한 균주 접종 신선한 부드러운 한천 오버레이에 발견하는 경우 또한, 박테리오파지는 청소 영역을 생성합니다.
Introduction
최근 항생제 내성 병원균 1,2 퇴치에 사용하기 위해 미생물 생태에 대한 이해 (다양한 환경의 특히 microbiomes)뿐만 아니라 새로운 항균 화합물을 심화에 상당한 관심이 있었다. 이러한 이익 사이의 상호 테마는 자연 환경에서 박테리아 균주 간의 대립 상호 작용을 이해하는 것입니다. 박테리아가 경쟁 3 길항하는 여러 가지 방법이 있습니다. 박테리오신, 단백질, 항균 화합물의 다양한 그룹은 긴 녹농균 4,5 및 대장균 (6), 중요한 인간 병원체되는 대부분의 연구 종의 두 가지로, interbacterial 길항 작용을 매개의 역할에 대한 연구되어왔다. 박테리오신 외에도 유도 prophages 또한 변형 이미 7 식민되는 틈새로 침입 할 수 anticompetitor 제로서 작용할 수있다. 슈도모나스 (Pseudomonas)의yringae 단일 단백질 박테리오신 8 테일 박테리오파지 유래 박테리오신 9 (라 tailocins)뿐만 아니라 비 - 단백질 이차 대사 산물 (10)를 포함하여 항균제의 어레이를 생성하는 것으로 알려진 식물 병원균이다. 최근 이러한 항생제들은이 식물 병 (11)를 제어 할 무력화 할 수있는 방법뿐만 아니라,이 생물의 생태에 영향을 미치는 방법을 이해 관심이 있었다.
박테리오신과 박테리오파지 모두 연구를위한 널리 이용 방법은 부드러운 한천 오버레이 기법이다. 이 방법은 첫 번째 박테리오파지 12, 13을 열거 돕기 위해 1936 년 gratia에 의해 설명되었다.
다음은 (세 가지 항균제 중에서 박테리오파지 구별에서 표적 유전자 조작 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전과 함께, 연질 한천 오버레이 방식의 적용을 설명 고분자 BACT하나의 균주에 의해 생산 eriocin 및 저 분자량 박테리오신). 이 방법의 장점은 그것이 확실히되는 '로우 테크에도 불구하고, 그것은 여전히 널리 이용되는 이유이다 비교적 간단하고 저렴한 점이다.
Protocol
뜨는 1. 준비는 활동에 대해 테스트 할
- 멸균 0.1 M 황산 버퍼 (예를 들어 1 mg을 마이 토마 이신 C / 2 ml의 버퍼)에 해당하는 양을 용해하여 마이 토마 이신 C의 0.5 ㎎ / ㎖ 주식 솔루션을 준비합니다. 가벼운 보호 용기에 4 ° C에서 보관 재고 (마이 토마 이신 C 민감한 빛).
- 왕의 매체 B (KB) 국물 (14)의 3 ㎖에 P. syringae의 단일 식민지의 예방. 실온에서 (200 rpm)으로 진탕 밤새 인큐베이션 (21-25 ° C).
- 다음 날 아침, 신선한 KB 국물의 3 ㎖로 국물 문화 1/100 희석. 실온에서 진탕하면서 3-4 시간 동안 인큐베이션. 마이 토마 이신 C (0.5 μg의 / ㎖, 최종 농도)를 추가합니다. 실온에서 진탕 밤새 문화를 품어.
참고 : 미토 마이신 C, 따라서 박테리오파지 및 박테리오신 모두의 생산으로 이어지는, 세포의 SOS 반응을 자극, 이중 가닥 DNA 나누기가 발생합니다. - 펠렛 1-2 ml의 마이 토마 이신 C는 벤치 탑의 microcentrifuge에서 5 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 문화를 유도.
- 제거하고 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 상청액을 통과시킴으로써 또는 클로로포름 상등액 (1 mL의 상층 액 100 μl의 클로로포름)로 처리하여 배양 상청액 중 살균.
- 클로로포름을 사용하는 경우, 15 초 동안 상기 혼합물을 와동 및 실온에서 1 시간 동안 배양한다하자. 배양 후, 5 분 동안 20,000 XG에서 혼합물을 원심 분리.
참고 : 클로로포름이 효율적으로 세포막을 용해하여 세포를 죽인다. 필터를 통해 멸균 클로로포름을 사용하는 장점은 저렴하고 스케일 업하기 쉬운 것이되는 경우 한번에 많은 (> 20)의 샘플을 처리하는 단계를 포함한다. 소정의 살상 능력이 유기 상으로 분할의 결과로서, 클로로포름 처리 다음 손실 될 가능성이있을 수있다. - 신선한, 멸균 1.5 또는 2.0 ml의 1 ML의 피펫을 사용하여 상단, 수성 단계를 제거미세 원심 분리 튜브. 하부 클로로포름 층 중 하나를 전송하지 않도록주의 (는 캐리 오버를 방지 할 수 성상 미만을 제거하는 것이 좋다).
- 잔류 클로로포름 (몇 시간) 증발 할 수 있도록 흄 후드에 상한선이 전송 된 상층 액을 품어. 4 ° C에서 보관 상층 액.
- 클로로포름을 사용하는 경우, 15 초 동안 상기 혼합물을 와동 및 실온에서 1 시간 동안 배양한다하자. 배양 후, 5 분 동안 20,000 XG에서 혼합물을 원심 분리.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의해 고 분자량 화합물의 살균 2, 분리, 농축
- 멸균 상층 액에 각각 1 M 10 % 최종 농도의 NaCl 및 PEG 8000를 추가합니다. 염화나트륨 및 PEG 모두가 완전히 용해 될 때까지 반복적으로 샘플을 반전한다. 1 시간 또는 밤새 4 ℃에서하는 얼음 욕조에 샘플을 품어.
- 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플. 펠릿은 원심 분리 튜브의 하단을 형성한다. 뜨는을 가만히 따르다 (예 : 1/10 또는 원래 상층 권의 1/100로 원하는 볼륨에 펠렛을 재현 탁매화) 반복 피펫으로 버퍼 (10 mM 트리스, 10 mM의 황산, 산도 7.0)의.
- 클로로포름의 동일한 볼륨이 순차적으로 추출하여 잔류 PEG를 제거합니다.
- 10 초 15의 재 부유 펠릿과 소용돌이와 클로로포름을 결합, 다음 5 분 동안 20,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 신선한의 microfuge 튜브에 위 수성 위상을 전송합니다. 수성 및 유기 단계 사이에 흰색 인터페이스가 보이지 않을 때까지이 추출을 반복 (보통 2 추출은 총). 잔류 클로로포름은 흄 후드에서 추출 상층 액에서 증발하도록 허용합니다.
활동에 대한 오버레이 및 테스트 상층 액 3. 준비
- P. syringae 균주의 단일 콜로니 KB 3 ㎖에 감도를 판정하는 접종 실온에서 진탕하면서 하룻밤 동안 배양한다.
- 다음 날 아침, 다시 신선한 KB로 문화 1/100 희석. 객실 temperatu에서 진탕 3 ~ 4 시간을 품어레.
- 초순수에 한천 (/ V 승) 현탁액 0.35-0.7 %를 고온 가압 멸균하여 멸균 한천을 준비합니다.
참고 : 연수 한천의 주식은 전자 레인지에서 용융 반복적으로 재사용 할 수있는, 신선한 오버레이는 각 실험을 준비 할 필요가 없습니다. 물 한천 재사용되는 경우, 완전히 다음은 전자 레인지 용융되도록하는 것이 중요하다. 그렇지 않은 경우, 오버레이는 해석을 어렵게 만들 것입니다 응고시 거친 텍스처를해야합니다. 이 경우, 더 이상 이전 완료보다 마이크로파에서 몇 분 동안 한천을 용해. - 사용하기 전에 60 ° C의 물을 욕조에 녹은 부드러운 한천을 유지한다. 멸균 배양 튜브로 전송 부드러운 한천의 3 ㎖를 멸균 혈청 학적 피펫을 사용하여. 용융 상태로 유지하기 위해 물을 욕조에 문화 튜브를 돌려줍니다.
- 첫 번째 (가 따뜻한하지만 터치 섹시하지 느껴야한다) 용융 한천이 식을 수 있도록, 오버레이를 부어 있지만, 응고하는 것을 허용하지 않습니다.
- 멸균 후드에서 100 μl를 접종부드러운 한천과 소용돌이에 테스터 변형 문화가 혼합합니다. 바닥 한천 (KB 한천)에 부어 후 10 ~ 15 초 동안 손으로 문화를 돌립니다. 부드러운 한천이 균일하게 바닥 한천을 커버하기 위해 모든 방향으로 접시를 기울입니다.
주 : 하부 한천 시험 균주 강하게 성장하는 임의의 고화 (1.5 % 한천) 매체 일 수있다. 표준 100mm 직경 페트리 접시를 들어, ~ 20 ㎖ 매체를 용융 사용합니다. (건조하지 않고 39 ° C로 유지하는 경우) 또는 당일 제조 할 수 하부 한천은 미리 몇 주를 제조 할 수있다. 오버레이를 수행하는 것과 같은 일을 준비하면 3.4 단계 너무 전에 수행하는 것이 가장 좋습니다. - 플레이트를 커버하고 20 ~ 30 분 응고 할 수 있습니다. 응고 동안 접시를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 일단 상층 액의 2-5 μl를 발견, 응고 오버레이 상 (섹션 위의 1과 2에서 발생). 플레이트를 실온에서 밤새 배양 허용. 관찰하고 기록 결과 다음 아침.
참고 : 그것은을수행하고 상층 액의 일련의 희석에서 발견하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이 연구원은 박테리오파지 및 박테리오신 청소 활동을 구별 할 수 있습니다. 1:10 희석 5 :이 경우, 하나를 수행하도록 권장한다.
Representative Results
연질 한천 오버레이 PEG 침전의 조합은 동일한 균주에 의해 생성 된 다른 항균제를 확인하고 특성화 할 수있다. 도 1은 동일한 종의 세번째 변형에 의해 억제된다 P. syringae (A 및 B)의 두 가지 변종을 도시한다. 두 균주는, 그러나, 상이한 박테리오신에 의해 억제된다. 균주 A의 클리어 존 변형 B의 클리어 존 큰 반면, 날카로운 모서리를 나타내는 한 비 선명한 경계를 나타낸다. 특히 A와 B가 서로 다른 박테리오신에 민감한 균주 (박테리오신 부족) 확인 박테리오신 제 (부족 tailocin) tailocin 또는 저 분자량를 비활성화 생산중인 균주 내에서 유전자 조작. 도 2는 박테리오파지 매개 살상 희석 계열을 비교하여 다른 비 - 복제 성 항생제 구별 될 수 있음을 보여준다. 모두 박테리오신 때문에파지은 마이 토마 이신 C 처리에 의해 유도 될 수 있으며, 이들 두 제제의 활동들은 면밀히 (활성화 파지 풍부한 경우 특히)이 서로 유사 할 수있다. 박테리오신 매개 삭제가 이러한 플라크로 해결되지 않습니다 동안 박테리오파지 매개 청산의 경우, 상층 액의 희석 개별 플라크 (클리어 존)으로 해결됩니다.
그림 1 : 동일한 균주에 의해 생성 된 여러 항균제의 표현형 차이. tailocin 결핍 균주에서 삭제 부족 아닌 박테리오신 결핍 균주에 의해 입증 균주 A는 다른 저 분자량 박테리오신 고분자 박테리오신 (tailocin) 아니라 민감하다. 반대로, 변형 B는 tailocin 둔감하지만, 저 분자량 박테리오신 민감하다. tailocin는 effic입니다저 분자량 박테리오신이없는 동안 iently, PEG 침전 다음 회복되었다. WT는 야생형을 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 비 복제 성 항균제 및 박테리오파지 사이에 구별. 적은 수많은 될 개별 플라크에서 박테리오파지 결과 (높은 역가 탑, 낮은 역가의 바닥)의 높은 역가의 (A) 희석. 각각의 플라크로 해결되지 않는 균일 이하 청산에 박테리오신 결과 (B) 희석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 소프트 한천 오버레이 기법은 널리 박테리오파지 또는 박테리오신에 관심있는 연구자들에 의해 수십 년 동안 적용되었습니다. 이 방법의 주요 이점은, 저렴하고 간단한 해석 비교적 쉽다는 점이다. PEG 침전 시리얼 희석 연질 한천 오버레이를 결합함으로써, 항 미생물제 (예 : 박테리오파지 대 tailocin 각각) 비 - 복제 성 대 저 분자량 대 고 화제 및 복제 성 제제로 분리 될 수있다. 마지막으로, 추정 박테리오신 또는 프로 파지 궤적의 대상으로 유전자 조작 (삭제 및 보완)의 통합 단단히 주어진 대립 화합물의 정체성을 확립 할 수 있습니다. 우리는 최근에 새로운 박테리오파지 유래 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)들 사이에서 유행 박테리오신 9 균주 설명하기 위해이 방법을 사용했다.
슈도모나스 한건데 잘이 프로토콜 작업에 표시된 성장 배지 및 조건ringae과 가능성이 이러한 조건에서 적극적으로 성장을 다른 그람 음성 세균 충분합니다. 그러나,이 방법을 사용하는 연구자들은 시스템의 타이밍 배지 유도있어서, 배양 온도를 최적화 할 것이다. 임계 파라미터는 대수 성장 단계에서 동시에 생산 배양을 유도뿐만 아니라, 균일 한 세균 분포를 보장하기 위해 충분한 대수 위상 문화 연질 한천 오버레이 시드하지만 전위 소거 영역을 불명료하지 않습니다 과도한 배양을 포함한다. 거기 SOS 응답의 일부로서 유도되지 않는 많은 박테리오신은 오히려 같은 펩티드 균체 감지 시스템, 즉, 연구자는 여러 다른 유도 방법을 선별 할 수있다 (15, 특히 그람 양성 박테리오신 ()을 유도 매체를 유도하거나 생산 균주의 배양 확장) 허용의 영양소 함량을 수정하는 단계를 포함한다.
사용하는 경우이 기술은, 연질 한천 오버레이 충분히 전에 시딩 균주의 첨가에 55-60 ℃에서 용융 유지되어야한다. 우리는 (시각적으로는 것처럼 보였다하지만)와 거친 외모와 오버레이 결과 소프트 한천이 완전히 용융되지 않은 몇 가지 실험이 있었다. 거친 오버레이의 결과는 여전히하지만,이 (관찰하는 것이 더 어려울 것이다 약한 억제) 억제의 강도에 따라 달라집니다, 일반적으로 해석 할 수있다. 이 기술을 사용하면, 용융 아가의 온도가 시드 균주를 죽이는 피하기 위해, 종래 시딩 균주 접종으로 냉각 할 수있는 충분한 시간을 허용되는 때 최종 교란 변수를 고려한다. 이 문제를 방지하려면, 우리는 소프트 한천은 터치, 뜨거운 따뜻한,하지만하지 않습니다 확인합니다. 이러한 맥락에서, 우리는 또한 우리가 용융 한천에 적응하기위한 시딩 문화에 대한 부적절한 시간을 줄 경우, 오버레이를 주입하기 전에, 우리는 일반적으로 가난한 세균 g을 복구하는 것이 관찰특정 억제 어렵거나 불가능의 해석이 해석 할 수 rowth. 우리가 텍싱 및 오버레이를 붓는 사이에 배양의 10 ~ 15 추가 초 정도의 이유입니다. 완전히 용융 상태의 한천을 유지 사이의 트레이드 오프 (뜨거운이 아닌 더 나은) 가능성이 시행 착오를 통해 연구자에 의해 결정되어야합니다 하나 인 시드 변형에 있지만 치명적인 (뜨거운 더 낫다).
PEG의 침전 공정이 사용되는 경우에도 무균 브로스 배지가 배양 상등액에 동일 처리 대조군을 포함하는 것이 유익 할 것이다. 이 활동을 죽이는 샘플 상등액 내의 잔류 PEG 또는 클로로포름의 결과가 아닌지 확인합니다.
박테리오파지 및 박테리오신 모두 매우 구체적인 경향으로서,이 균주의 소정 조합으로 명백한 살상 능력 발생하지 것은 드물지 않다. 이 균주 별 재 다양한에서 발생할 수 있습니다sistance 메커니즘은, 하나는 테스터의 변형이 부족하거나 주어진 박테리오신 또는 박테리오파지 타겟팅에 필요한 수용체의 알 수없는 버전이 하나 있다는 것을.
다른 방법은 박테리오신 스크리닝 방법은 가와이 동부 등에 의해 설명되었다. 하지만, 단점을 앓고 널리 (16)을 채택되지 않았습니다. 특히,이 기술은 부담이 될 수 시간 간격으로 국물 샘플을 관찰이 필요하며, 파생-박테리오파지 및 박테리오신 유래 살인 활동 사이의 차별을 허용하지 않습니다.
이 기술의 주요 한계는 잘 견고하게 성장하지 않는 (따라서 쉽게 식별 할 지우기 영역이 부족합니다) 또는 견고 실험실 조건에서 생산되지 않는 항구 prophages 또는 박테리오신을 생물에 적합하지 않은 것입니다. 이 기술의 적응력 유틸리티를 확장 할 것입니다 모두 환경 시료에서 생산 박테리오신을 감지이 기술의 것은 자연 환경 내에서 박테리오신의 역할에 더 큰 통찰력을 용이하게한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
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