Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
モノクローナル抗体(mAb)は原因でいくつかの慢性および変性疾患1に対して作用する能力に関心の増加に伴ってバイオ治療タンパク質です。他の生体分子と同様に、mAbは(生合成から最終製品まで、 すなわち )そのライフサイクルのすべての段階でいくつかの物理化学的修飾を受けるする傾向があります。このような修飾としては、限定されるものではないが:脱アミド化、グリコシル化、酸化、環化、異性化、凝集およびタンパク質分解性切断2。したがって、内因性のイソ型を解決することが可能な分析技術は、品質規格を確立するために、モノクローナル抗体の不均一性と安定性を監視するために必要とされます。
キャピラリー電気泳動(CE)は、バックグラウンド電解液(BGE)を充填した狭い溶融シリカチューブ(μmの範囲)の高性能分離技術行っoutinsideあります。電界を印加すると、荷電分子(3万Vまで)sが反対の電荷( すなわち 、電気駆動の分離)を有する電極に向かって移動します。 CEでの高電圧の使用は、古典的なゲル電気泳動に優れており、高速分析と効率の向上を可能にします。キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)は、定期的に製品の品質評価3-9ためにバイオ医薬品産業で使用されるCEベースの技術です。 CE( 例えば 、キャピラリーゲル電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動)またはクロマトグラフィーをベースとする方法の他のモードとは異なり、CZEは、その天然の状態10に近いmAbの固有の不均一性の解析を可能にする、変性剤または固相界面を用いることなく実施することができます。モノクローナル抗体アイソフォームのCZE分離は、親水性ポリマー(中性毛細血管)で覆われた溶融シリカキャピラリーの内部で発生した電荷、質量、大きさや形状(または流体力学的体積)11によって支配されているそれらの異なる電気泳動移動度に基づいています。モノクローナル抗体部分は、ときに検出されますそれらは、動員および214 nmの4の紫外線(UV)吸光度検出器によって検出される検出窓を通過しています。
この分析技術の実装を成功させるには、前と実験中に詳細に適切な配慮に依存することになります。そうでなければ作用し、最終的に一定の障害や不満につながる、分析を行うためのコストと時間を増加します。
ここでは、ソリューションやサンプル、CEシステム、設定機器方法、データ収集の準備の準備の詳細な説明を通じてCZEによりモノクローナル抗体の異質性の成功した分析を行うためにステップバイステップのガイドを提示し、処理。このチュートリアルの目的のために、組換え完全ヒト抗腫瘍壊死因子アルファ(抗TNFα)モノクローナル抗体は、タンパク質モデルとして使用されます。しかしながら、このプロトコルは、簡単に短時間の変更を考慮し、他のタンパク質の分析のためにカスタマイズすることができます。 Additionally、潜在的な問題を軽減するためのいくつかの推奨事項が提案されています。読者が成功する確率が増加するように厳密に、提案されたプロトコルに従うことが奨励されています。
CZEが成功する確率を高めるために、mAbの分析を行う際に、このチュートリアルでは、適切な実践の重要性を強調しています。 CZEが日常的に使用されている場合しかし、問題は必然的に12生じます。
最良の結果を得るために、彼らが困難なステップを克服し、トラブルシューティングするためのアナリストを助けるように、プロトコル全体に含まれていたノート?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
(Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |