Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Monoklonale antistoffer (mAbs) er bioterapeutiske proteiner med økende interesse på grunn av deres evne til å handle mot flere kroniske og degenerative sykdommer 1. Som andre biomolekyler, mAbs er tilbøyelige til å gjennomgå flere fysiske endringer i alle faser av sin livssyklus (dvs. fra biosyntese til det endelige produktet). Slike modifikasjoner innbefatter, men er ikke begrenset til: deamidering, glykosylering, oksidasjon, cyklisering, isomerisering, aggregering og proteolytisk spaltning to. Derfor blir analytiske teknikker som er i stand til å løse iboende isoformer nødvendig for å overvåke mAb'ene heterogenitet og stabilitet for å kunne etablere kvalitetsspesifikasjoner.
Kapillær elektroforese (CE) er en høy ytelse separasjonsteknologi gjennomført outinside av en smal smeltet Silica tube (mikrometer utvalg) fylt med bakgrunn elektrolytt (BGE). Ved påføring av et elektrisk felt (opp til 30 000 V), ladet molekyls migrerer mot elektroden med motsatt ladning (dvs. elektro-drevet separasjon). Bruken av høye spenninger i CE tillater raske analyser og økt effektivitet, som er bedre enn klassisk gel elektroforese. Kapillær sone elektroforese (CZE) er et CE-basert teknikk rutinemessig brukt i biofarmasøytiske industrien for produktet kvalitetsvurdering 3-9. I motsetning til andre former for CE (f.eks kapillær gelelektroforese, kapillar isoelektrisk fokusering) eller kromatografi-baserte metoder, kan CZE bli utført uten bruk av denatureringsmidler eller fastfase-grensesnitt, slik at analysen av den iboende heterogenitet av mAb nær deres opprinnelige tilstand 10 . CZE separasjon av mAb isoformer forekommer inne i et smeltet silika kapillær dekket med en hydrofil polymer (nøytral kapillar), og er basert på deres ulike elektroforetisk mobilitet, som er styrt av ladning, masse, størrelse og form (eller hydrodynamisk volum) 11. mAb delene blir oppdaget nårde er mobilisert og passerer gjennom deteksjonsvinduet, som avføles ved hjelp av en ultrafiolett (UV) absorbans-detektor ved 214 nm 4.
En vellykket gjennomføring av denne analytisk teknikk vil avhenge av riktig hensyn til detaljer før og under forsøket. Fungerende ellers vil øke kostnadene og tid til å gjennomføre analysen, til slutt fører til konstant svikt og frustrasjon.
Her presenterer vi en steg-for-steg guide til å gjennomføre en vellykket analyse av mAb heterogenitet ved CZE gjennom detaljert forklaring av utarbeidelse av løsninger og prøver, utarbeidelse av CE-systemet, instrument metoder satt opp, datainnsamling, og behandlingen. For formålet med denne opplæringen, en rekombinant humant anti-tumor nekrose faktor alfa (anti-TNFa) mAb blir anvendt som protein modell; Men kan denne protokollen enkelt tilpasses for analyse av andre proteiner vurderer korte modifikasjoner. ENdditionally, flere anbefalinger for å redusere potensielle problemer er foreslått. Leseren oppfordres til å strengt følge den foreslåtte protokollen, som sannsynligheten for å lykkes vil øke.
I denne opplæringen, merker vi viktigheten av riktig praksis når gjennomføre CZE analyser av mAbs for å øke sannsynligheten for å lykkes. Men når CZE brukes på rutinemessig basis, problemer oppstår uunngåelig 12.
For best resultat, er det viktig å følge notatene som ble inkludert i hele protokollen, som de vil hjelpe analytikeren å overvinne og feilsøke vanskelige trinn. En viktig faktor for å oppnå en optimal oppløsning ved et gitt sett av betingelser er den korr…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
(Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |