Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Monoklonala antikroppar (mAb) är bioterapeutiska proteiner med ökande intresse på grund av deras förmåga att agera mot flera kroniska och degenerativa sjukdomar 1. Liksom andra biomolekyler, mAbs är benägna att genomgå flera fysikalisk-kemiska modifieringar på alla stadier av deras livscykel (dvs. från biosyntesen till slutprodukten). Sådana modifieringar innefattar, men är inte begränsade till: deamidering, glykosylering, oxidation, cyklisering, isomerisering, aggregering och proteolytisk klyvning 2. Därför är analytiska tekniker kapabla att lösa inneboende isoformer behövs för att övervaka mAbs heterogenitet och stabilitet för att fastställa kvalitetsspecifikationer.
Kapillärelektrofores (CE) är en högpresterande separationsteknik genom outinside av en smal kvartsröret (um intervall) fylld med en bakgrund elektrolyt (BGE). Vid applicering av ett elektriskt fält (upp till 30000 V), laddad molekyls migrerar mot elektroden med motsatt laddning (dvs elektrodrivna separation). Användningen av höga spänningar i CE tillåter snabba analyser och ökad effektivitet, som är överlägsna klassisk gelelektrofores. Kapillärzonelektrofores (CZE) är en CE-baserad teknik som rutinmässigt används inom den biofarmaceutiska industrin för bedömning produktkvalitet 3-9. Till skillnad från andra typer av CE (t.ex. kapillär gelelektrofores, kapillär isoelektrisk fokusering) eller kromatografi baserade metoder kan CZE genomföras utan användning av denatureringsmedel eller fast fas-gränssnitt, vilket möjliggör analys av den inneboende heterogenitet mAbs nära deras naturliga tillstånd 10 . CZE separation av mAb isoformer sker inuti en kvarts kapillär täckt med en hydrofil polymer (neutral kapillär) och är baserad på deras olika elektroforetisk mobilitet, som styrs av kostnad, vikt, storlek och form (eller hydrodynamiska volym) 11. mAb delar upptäcks närde är mobiliserade och passerar genom detekteringsfönstret, vilket avkänns av en ultraviolett (UV) absorbans-detektor vid 214 nm 4.
Ett framgångsrikt genomförande av denna analysteknik kommer att bero på riktig uppmärksamhet på detaljer före och under försöket. Agerar annars kommer att öka kostnaderna och tiden för att genomföra analysen, vilket slutligen leder till konstant misslyckande och frustration.
Här presenterar vi en steg-för-steg-guide för att genomföra en framgångsrik analys av mAb heterogenitet genom CZE genom detaljerad förklaring av beredning av lösningar och prover, framställning av CE-system, instrumentet metoder som inrättats, datainsamling, och bearbetningen. Vid tillämpningen av denna handledning, en rekombinant helt human anti-tumor necrosis factor alfa (anti-TNF) mAb användes som proteinmodell; dock kan detta protokoll enkelt anpassas för analys av andra proteiner överväger korta ändringar. endditionally, flera rekommendationer mildra eventuella problem föreslås. Läsaren uppmanas att strikt följa det föreslagna protokollet, som sannolikheten att lyckas ökar.
I denna handledning, vi betona vikten av lämpliga metoder när de utför CZE analyser av mAb för att öka sannolikheten att lyckas. Men när CZE används rutinmässigt, problem uppstår oundvikligen 12.
För bästa resultat, är det viktigt att följa de anteckningar som ingick i hela protokollet, eftersom de kommer att hjälpa analytiker att övervinna och felsöka svåra steg. En viktig fråga för att få optimal upplösning vid en given uppsättning betingelser är korrekt b…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
(Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |