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Biochemistry

Elettroforesi capillare Separazione di anticorpo monoclonale Isoforme Utilizzando un capillare Neutral

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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Gli anticorpi monoclonali (MAK, MAB) sono proteine bioterapeutici con crescente interesse a causa della loro capacità di agire contro diverse malattie croniche e degenerative 1. Come altre biomolecole, mAbs sono inclini a subire numerose modifiche fisico in tutte le fasi del ciclo di vita (cioè dal biosintesi al prodotto finale). Tali modifiche includono, ma non sono limitati a: deamidation, glicosilazione, ossidazione, ciclizzazione, isomerizzazione, aggregazione e taglio proteolitico 2. Quindi, sono necessarie tecniche analitiche in grado di risolvere isoforme intrinseche per monitorare mAbs eterogeneità e stabilità per stabilire specifiche di qualità.

Elettroforesi capillare (CE) è una tecnologia di separazione ad elevate prestazioni realizzato OutInside di un tubo di silice fusa stretto (gamma micron) riempita con uno sfondo elettrolita (DTF). In seguito all'applicazione di un campo elettrico (fino a 30.000 V), molecola caricas migrano verso l'elettrodo con carica opposta (cioè la separazione elettro-driven). L'uso di alte tensioni in CE permette analisi veloci e maggiore efficienza, che sono superiori a elettroforesi su gel classica. Zona di elettroforesi capillare (CZE) è una tecnica basata CE-abitualmente utilizzati nel settore biofarmaceutico per la valutazione della qualità del prodotto 3-9. A differenza di altri modi di CE (ad esempio, gel elettroforesi capillare, capillare focalizzazione isoelettrica) o metodi di cromatografia basati, CZE può essere condotta senza utilizzare denaturanti o interfacce fase solida, permettendo l'analisi della eterogeneità dei mAbs vicino al loro stato nativo 10 . CZE separazione delle isoforme mAb verifica all'interno di un capillare in silice fusa coperta con un polimero idrofilo (capillare neutro) e si basa sulla diversa mobilità elettroforetica, che è governato dalla carica, massa, dimensioni e forma (o volume idrodinamico) 11. frazioni mAb vengono rilevati quandosono mobilizzati e passano attraverso la finestra di rilevamento, che è rilevato da un rivelatore ultravioletto (UV) assorbanza a 214 nm 4.

Il successo di questa tecnica analitica dipenderà la giusta attenzione ai dettagli, prima e durante l'esperimento. Agire altrimenti aumenterà il costo e il tempo per condurre l'analisi, in ultima analisi, che porta al fallimento costante e frustrazione.

Qui vi presentiamo una guida passo-passo per condurre un'analisi di successo di mAb eterogeneità CZE attraverso la spiegazione dettagliata della preparazione di soluzioni e campioni, la preparazione del sistema CE, i metodi dello strumento istituito, l'acquisizione dei dati, e l'elaborazione. Ai fini di questa esercitazione, un anti-fattore di necrosi tumorale alfa ricombinante completamente umano (anti-TNF) mAb è usato come proteina modello; Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'analisi di altre proteine ​​considerando brevi modifiche. UNdditionally, diverse raccomandazioni per mitigare sono proposti potenziali problemi. Il lettore è incoraggiato a seguire rigorosamente il protocollo proposto, come la probabilità di successo aumenteranno.

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Protocol

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1. preparazione di soluzioni

  1. Preparare la soluzione BGE.
    1. Preparare 100 ml di una soluzione costituita da 0,05% (m / v) di cellulosa idrossi propil metil (HPMC), 200 mM ε-ammino n-caproico (EACA) e 30 mM acetato di litio.
      NOTA: Come HPMC è un polimero viscoelastico, versare la polvere in un bicchiere di vetro, aggiungere 80 ml di acqua ed infine aggiungere la barra di agitazione. Continuare ad aggiungere i restanti reagenti come normalmente. Indossare occhiali di sicurezza durante la manipolazione di acetato di litio in quanto può causare irritazione agli occhi.
    2. Regolare pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) di acido acetico. Lasciare che la soluzione si stabilizzi per 5 minuti e regolare, se necessario.
    3. Aggiungere acqua fino ad un volume finale di 100 ml in pallone tarato.
    4. Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron.
    5. Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 7 giorni.
  2. Preparare lo standard interno.
    1. Preparare 1 mLdi una soluzione composta da 1% (m / v) di istamina.
    2. Filtrare attraverso una membrana idrofila con dimensione dei pori 0,2 micron.
    3. Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno.

Preparazione 2. campione

  1. Preparare 180 microlitri di campione mAb diluito con tampone Tris (50 mM tris (idrossimetil) amminometano, pH 8,0) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml.
  2. Aggiungere 20 ml di 1% (m / v) di istamina.
  3. Mescolare e centrifugare a 1000 xg per 5 sec.
  4. Posizionare un micro fiala all'interno di una fiala universale.
  5. Trasferire il campione nel micro fiala e tappare la fiala universale. Versare il campione verso l'alto per non introdurre bolle.
  6. Conservare a 2-8 ° C per un massimo di 1 giorno.
  7. Posizionare la fiala universale (con micro flacone contenente la soluzione di esempio) nel vassoio di ingresso del campione.

3. Preparazione del sistema CE.

  1. Sistema CE di pulizia.
    NOTA: Comportamento °è operazione almeno una volta alla settimana per evitare perdite di corrente elettrica derivata da accumulo di polvere e detriti. Tuttavia, a seconda dell'applicazione (per esempio, l'uso di un BGE con maggiore viscosità o ad alta concentrazione salina, campioni con un aumento di viscosità) elettrodi e leve di apertura può richiedere di essere pulito più frequentemente per evitare la contaminazione incrociata e trascinamento del campione.
    1. Spegnere l'interruttore di alimentazione dello strumento CE e aprire lo sportello anteriore.
    2. Pulire la superficie della copertura del campione, campione tenendo sistema (campione e tampone vassoi), copertura della cartuccia, barra di bloccaggio, blocco dell'interfaccia e gli elettrodi con un inumidito con acqua non tessuto wipe. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire e asciutto prima dell'uso.
    3. Lavare le leve di apertura a fondo con acqua. Pulire la superficie con un tessuto non tessuto pulire. Ripetere la procedura con un etanolo-inumidito pulire ed asciugare prima dell'installazione.
    4. Pulire le due estremità del cavo in fibra ottica attentamente con un panno in microfibra inumidito con acqua. Ripetere la procedura con un panno inumidito etanolo.
  2. Cartuccia.
    1. Rimuovere un nuovo capillare neutra (50 micron di diametro interno) dalla confezione.
    2. Nastro giù una estremità del capillare tubo protettivo al banco da lavoro. Srotolare, raddrizzare e tirare il capillare fuori il tubo.
    3. Attaccare un pezzo di nastro o di carta al banco da lavoro e aggiungere contrassegni di misura come segue: lunghezza al rivelatore (30 cm), la finestra capillare (0,2 cm) e lunghezza all'estremità di uscita (10 cm) (cioè, lunghezza 40,2 cm totale, 30.0 cm di lunghezza efficace).
    4. Allineare la finestra capillare per il marchio di misura 0,2 centimetri nel documento di riferimento. Fissare il capillare con nastro e segnare l'estremità del capillare 2 mm al di fuori delle marche di stazza.
    5. Tagliare il cappuccio protettivo all'estremità di entrata capillare (l'estremità più lontana dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.
      1. Immergere l'estremità capillare in una fiala universale ricoperto riempita con acqua al fine di evitare danni permanenti al rivestimento interno capillare. Ripetere questa procedura ogni volta che l'estremità capillare è esposto al ambiente per più di 1 min.
    6. Inserire l'estremità di ingresso capillare sul lato di uscita della cartuccia.
    7. Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando la finestra capillare è centrato alla finestra cartuccia.
    8. Inserire la spina di apertura (100 micron x 200 micron) nella finestra cartuccia.
      NOTA: Verificare che la luce bianca passa attraverso la finestra quando esposti ad una sorgente di luce bianca. Se la luce che passa attraverso ha un aspetto brunastro, regolare come necessario.
    9. Inserire il capillare nel tubo del liquido di raffreddamento preformato per una lunghezza totale capillare di 40,2 cm (con dado tubi pre-installato, puntale e O-ring ad entrambe le estremità in questo ordine).
    10. Spingere il capillare attraverso il coolantubazione t necessaria fino a quando il capillare appare all'altro lato del tubo.
    11. Inserire l'estremità del tubo refrigerante nel lato di uscita della cartuccia e serrare il dado tubo.
    12. Inserire l'estremità di ingresso capillare nel lato di ingresso della cartuccia.
    13. Premere e tirare il capillare attraverso la cartuccia necessaria fino a quando il capillare appare al lato ingresso della cartuccia.
    14. Inserire l'estremità del tubo del refrigerante nel lato di entrata della cartuccia e serrare il dado tubo.
    15. Tagliare il cappuccio protettivo sulla estremità di uscita capillare (l'estremità più vicina dalla finestra) in un unico movimento rettilineo utilizzando il bordo a filo della pietra scissione.
    16. Inserire le clip di tenuta-fermo sulle estremità dei capillari e premere per scattare in posizione. Effettuare il controllo visivo termina la capillare. Se non lo sono nemmeno, ripetere la procedura.
    17. Posizionare il modello capillare lunghezza sul bordo del banco di lavoro.
    18. Posizionare la cartuccia rivolta verso il basso against il modello capillare di lunghezza e allineare l'estremità del capillare con le linee di riferimento sul modello. Se i segni di misura capillare (vedi 3.2.4) non si allineano con le linee di riferimento, regolare come necessario.
    19. Mantenere il capillare contro il modello capillare di lunghezza e tagliare entrambe le estremità del capillare utilizzando il bordo a filo della scissione pietre 2 mm al di sotto delle linee di riferimento del modello.
    20. Controllare visivamente il capillare si conclude con una lente di ingrandimento. Se estremità capillari non sono uniformi, lustrare utilizzando il volto morbido della pietra scissione.
    21. Inserire l'O-ring di apertura nel foro del tappo apertura utilizzando lo strumento di inserimento O-ring.
    22. Installare fiale universali ricoperti pieni d'acqua nel bossolo e la cartuccia posto in caso immediatamente con le estremità dei capillari inserite in fiale. Per la conservazione a breve e lungo termine, tenere a 2-8 ° C.
  3. Preparazione dei vassoi tampone.
    1. Riempire e mettere univers innevateAl fiale in ingresso del buffer e vassoi di uscita (figura 1). le posizioni delle fiale si ripetono in corsie 2, 3, 4 e 5 secondo con il numero di campioni da analizzare, ponendo una corsia per ogni sei iniezioni di campione.
      NOTA: evitare di bagnare i tappi dei flaconi al fine di evitare la dispersione di corrente.

Figura 1
Figura 1: Posizione e livello di riempimento di fiale universali nei vassoi di entrata e uscita del buffer. Riempire i livelli: 1/1 = 1400 ml, 3/4 = 1300 ml e 1/2 = 1000 ml. Abbreviazioni: W = acqua, HCl = 0,1 M di acido cloridrico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Sistema CE componenti di assemblaggio.
    1. Installare il rivelatore UV.
    2. Installare le leve di aperturapremendo fino al blocco di interfaccia.
    3. Installare il cavo in fibra ottica. Inserire l'estremità corrispondente alla barra di bloccaggio e, tenendo entrambe le estremità, ruotare in senso orario. Collegare l'altra estremità al rivelatore UV.
      NOTA: Maneggiare il cavo in fibra ottica con cura durante questa procedura poiché flessione potrebbe causare la sua frattura.
    4. Collocare il campione e vassoi di buffer nel sistema di campionamento detenzione e scattano in posizione.
    5. Posizionare la cartuccia capillare nel blocco di interfaccia e, mentre premendo la barra di serraggio a entrambe le estremità, serrare le manopole.

4. Metodi Instrument Set-up

  1. Creare il condizionamento, esecuzione e metodi strumentali arresto secondo i seguenti parametri e Tabella 1: Tensione, max: 30,0 kV; Corrente, max: 300.0 μA; Temperatura di cartuccia: 20.0 ° C; temperatura di conservazione del campione: 10,0 ° C; rivelatore UV condizioni iniziali: Lunghezza d'onda: 214 nm; Velocità dati: 4 Hz; Filtro: Normal; Larghezza di picco (punti): 16-25; Segnale di assorbanza: Direct.
    NOTA: tasso di acquisizione dei dati può essere aumentata fino a 25 Hz per migliorare la copertura di zone di separazione strette.
<td> Acqua fiala di uscita
Condizionata programma orario metodo
Tempo (min) Evento Valore Durata fiala di ingresso fiala outlet sommario Commenti
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 1.0 min BI: C1 BO: C1 Inoltrare HCl 0,1 M
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Inoltrare
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 10.0 min BI: E1 BO: C1 Inoltrare BGE
0.00 Indipendente - Tensione 15,0 KV 10.0 min BI: D1 BO: D1 0,17 rampa Min, polarità normale Separato
10.00 Risciacquare - Pressione 2758 mbar 10.0 min BI: E1 BO: C1 Inoltrare BGE
20.01 Aspetta - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - punte di risciacquo
L'esecuzione del programma di tempo metodo
Tempo (min) Evento Valore Durata fiala di ingresso sommario Commenti
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 1.0 min BI: C1 BO: C1 Avanti, In / Out inc vial 6 HCl 0,1 M
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Avanti, In / Out inc vial 6 acqua
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 4,0 min BI: E1 BO: C1 Avanti, In / Out inc vial 6 BGE
- Iniettare - Pressione 34 mbar 20,0 sec SI: A1 BO: B1 Override, Forward iniezione del campione
- Aspetta - 0,4 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc vial 6 LAVAGGIO
0 Indipendente - Tensione 15,0 KV 30.0 min BI: D1 BO: D1 0,17 rampa Min, polarità normale, In / Out inc vial 6 Separazione del campione
0.5 Autozero - - - - - -
30.01 smettere di dati - - - - - -
30.02 Risciacquare - Pressione 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Avanti, In / Out inc vial 6 acqua
32.03 Aspetta - 0,0 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc vial 6 punte di risciacquo
32.04 Fine - - - - - Fine
Shutdown programma orario metodo
Tempo (min) Evento Valore Durata fiala di ingresso fiala outlet sommario Commenti
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 1.0 min BI: E6 BO: E6 Inoltrare HCl 0,1 M
- Risciacquare - Pressione 2068 mbar 6.0 min BI: F6 BO: F6 Inoltrare acqua
- Lamp - Spento - - - - - -
- Aspetta - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - punte di risciacquo

Tabella 1: condizionamento, esecuzione e programmi orari di spegnimento.

5. acquisizione ed elaborazione dati

  1. Programmare il campionario.
    1. Programmare il capillare per condizionare utilizzando il metodo dello strumento condizionata. Quando si utilizza il capillare per la prima volta, il programma quattro ripetizioni; altrimenti programmare solo due ripetizioni del metodo di condizionamento.
    2. Programmare i campioni da analizzare con il metodo dello strumento in esecuzione.
    3. Programmare il capillare per la memorizzazione utilizzando il metodo dello strumento di arresto e ripetere la procedura indicata nella sezione 3.2.22.
  2. Simula.
  3. Esportare i elettroferogrammi.
  4. Calcolare il tempo di migrazione ed il contenuto percentuale di base, un principaleisoforme acidi nd utilizzando l'integrazione linea dislivello del profilo dell'elettroferogramma.

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Representative Results

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La Figura 2 mostra il profilo corrente elettrica tipica di 200 mM EACA, 30 mM acetato di litio, pH 4.8 BGE con il campione anti-TNFa mAb diluito con tampone Tris (50 mM, pH 8,0). Come si può osservare, la corrente è stabile durante l'analisi e può oscillare tra i valori di 30 a 35 μA. La Figura 3 mostra l'elettroferogramma CZE di un campione in bianco dove il picco rilevato corrisponde allo standard interno istamina. Si prevede di istamina per avere un tempo di migrazione di 3,7 a 4,1 min. La Figura 4 mostra l'elettroferogramma CZE anti-TNFa mAb. Come si può notare, il picco principale è preceduta e seguita da picchi di minore intensità. Dal momento che la separazione è condotta sotto polarità normale (vale a dire, da positivo a negativo), l'analisi rivela isoforme di base (MAB varianti con carica positiva) che migrano più veloce e isoforme acidi (MAB varianti con carica negativa) migrazione più lenta della isoforma principale.

figura 2
Figura 2: Electrical profilo corrente di una tipica corsa CZE. La corrente BGE è stabile circa 30 μA quando il campione mAb è diluito con tampone Tris (50 mM, pH 8,0). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: CZE elettroferogramma del campione in bianco. Si noti che non vengono rilevati picchi parte quello dello standard interno istamina. AU = unità di assorbanza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

tenda "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: l'eterogeneità fisico-chimiche della anti-TNF mAb determinato da CZE. Questo campione è composto da isoforme di base, principali e acidi. Inserto mostra una visione allargata delle varianti deliberate dal CZE. AU = unità di assorbanza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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In questo tutorial, si evidenzia l'importanza di pratiche corrette per lo svolgimento di analisi CZE di anticorpi monoclonali, al fine di aumentare la probabilità di avere successo. Tuttavia, quando CZE viene utilizzato su una base di routine, i problemi sorgono inevitabilmente 12.

Per ottenere i migliori risultati, è importante seguire le note che sono stati inclusi in tutto il protocollo, in quanto vi aiuterà l'analista a superare e risolvere i problemi passaggi difficili. Una considerazione importante per ottenere risoluzione ottimale ad un dato insieme di condizioni è la corretta preparazione della soluzione BGE. Questo processo richiede avere uno stretto controllo forza ionica di agenti tampone, la concentrazione di additivi non tampone e pH. Nel complesso, il sistema CE richiede cura e attenzione al dettaglio. Può essere facilmente danneggiato se qualsiasi fase relativa alla pulizia sistema o impianto viene ignorato.

Il presente metodo considera l'uso di un capillare neutra. A differenza di capillari in silice fusa nude,capillari neutri ridurre l'adsorbimento di proteine sulla parete interna del capillare, migliorando così l'efficienza di separazione, precisione e ripetibilità 9. Tuttavia, il suo impiego è limitato dalla quantità di iniezioni che possono essere eseguite. Nella nostra esperienza, 120 a 150 iniezioni possono essere effettuate senza effetto sulla risoluzione a causa del progressivo degrado del rivestimento interno. Una volta che il capillare ha raggiunto questo limite, sarà necessario un nuovo capillare.

Altri protocolli sono stati riportati per l'analisi della eterogeneità fisico-chimiche dei mAbs da CZE, che include l'uso di permanently- e dinamicamente rivestite capillari 13,14. Tuttavia, questi studi propongono l'applicazione di una serie di condizioni fisse di analizzare la grande diversità di anticorpi monoclonali. In contrasto con i metodi esistenti, riteniamo che le prestazioni ottimali può essere raggiunto solo adattando condizioni sperimentali. Per esempio, il protocollo qui presentato è stato utilizzato e regolata nelpassato per analizzare l'eterogeneità isoforma di altri quattro anticorpi monoclonali differenti e un frammento mAb 10. Al fine di adattare questo protocollo per valutare altri anticorpi monoclonali, si consiglia la modulazione della BGE forza ionica e pH in funzione della diversità e varianti punto isoelettrico della molecola da analizzare.

Ulteriori passi Dopo aver imparato questa tecnica dovrebbe includere la valutazione delle prestazioni metodo. Parametri come selettività e ripetibilità (in termini di deviazione standard relativa di tempo migrazione e percentuale area) devono essere testati per confermare che il metodo è adatto per l'impiego previsto.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

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Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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