Autophagy aktivering er nyttig i forebygging av en rekke sykdommer. En av de fysiologiske fremgangsmåter for å indusere autophagy in vivo er fysisk trening. Her viser vi hvordan du kan aktivere autofagi av aerob trening og måle autofagi nivåer i mus.
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Autophagy er en evolusjonært konservert degradering veien, som blir indusert i respons til forskjellige stressbetingelser som sult og hypoksi 1, 2. Under autofagi, dobbel-membran vesikler, kalt autophagosomes, innlemme unødvendige eller skadde subcellulære komponenter og transportere dem til lysosomer for degradering tre. Basal autofagi er viktig for cellulær funksjon og utvikling organisme, og svekket basal autophagy er innblandet i mange lidelser, inkludert nevrodegenerasjon, tumorigenese og type 2-diabetes 4, 5, 6.
Det mest kjente fysiologiske autofagi indus er sult. Den har imidlertid to store begrensninger. For det første tar sult lang tid til effektivt å indusere autophagy i dyr, for eksempel 48 timer med mat begrensning i musi de fleste organer. For det andre, sult knapt induserer hjerne autophagy, på grunn av en forholdsvis stabil næringstilførsel i hjernen. Faktisk er det også vanskelig å oppdage autofagi induksjon av små-molekyl induktorer, som mange medikamenter ikke kan passere blod-hjerne barrieren. Således, for bedre å analysere funksjonen av autophagy aktivering i patogenesen sykdom, vi nylig oppdaget at oppgaven er en mer potent fysiologisk metode for å indusere autophagy i løpet av kort tid 7, 8, 9. Sammenlignet med sult, er autofagi effektivt indusert av tredemølle å kjøre så fort som 30 min. Dermed er trening en praktisk og potent fysiologisk tilnærming for å studere mekanismen av autofagi i formidling helsemessige fordeler og forebygge sykdommer.
Det er flere protein markører for påvisning av autophagy aktivitet, blant annet LC3 og P62. LC3 (microtubule-assosiert protein 1A / 1B-light cHain 3) er et cytosolisk protein (LC3-I skjemaet), som er konjugert til PE (fosfatidyletanolamin) ved autophagy induksjon. PE-lipidert LC3 (LC3-II form) er rekruttert til autophagosomal membraner og kan brukes til å visualisere autophagosomes når merket med GFP. Dens trans fra cytosol til punktat strukturer av autophagosomes henhold mikroskopi er en indikasjon på autophagy induksjon. p62 er en last reseptor for Autophagy substrater (for eksempel ubiquitinering proteiner), og er inkorporert i autophagosomes også. Siden proteinet nedbrytes i lysosomer sammen med autophagosomes, kan nivåene brukes til å måle den autophagy fluksen. Her viser vi hvordan du bruker disse markørene for å kvantifisere autofagi i forskjellige muse vev forårsaket av aerob trening, herunder tvungen trening (tredemølle) og frivillig trening (løping hjul). De samme prosedyrer kan også bli brukt til in vivo måling av autophagy etter behandling av andre inducere.
Autophagy er en katabolsk prosess som gir energi og reduserer cytotoksisitet av lysosomal degradering av cytoplasma komponenter eller skadede organeller. Studerer autofagi er viktig å forstå at reguleringen av cellulær homeostase og mekanismene for stressrespons. Nye modeller og metoder dukker opp i forskningsfeltet 15, for å studere hvordan nedsatt autofagi bidrar til en rekke patologiske prosesser 16, 17.
<p class="jove_content"…The authors have nothing to disclose.
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
ImageJ | NIH |