Abstract
Этот подробный протокол описывает реализацию изображения наведением, на основе лазера деструкции гидрогеля для изготовления сосудов, полученных микрофлюидальных сетей, встроенных в PEGDA гидрогели. Здесь мы опишем создание виртуальных масок, которые позволяют изображения наведением лазерного управления; фотополимеризации из micromolded PEGDA гидрогеля, пригодным для изготовления микрожидкостных сети и головным приводом потока давления; установка и использование коммерчески доступного лазерного сканирования конфокальной микроскопии в паре с фемтосекундного импульсного Ti: S лазера, чтобы вызвать деградацию гидрогеля; и визуализация готовых микрофлюидальных сетей с использованием флуоресцентных видов и конфокальной микроскопии. Большая часть протокола фокусируется на правильной настройке и внедрению программного обеспечения микроскопа и микроскопа макро, так как они являются важными шагами в использовании коммерческого микроскопа для целей микрофлюидальных изготовления, которые содержат ряд тонкостей. Изображение наведением компонент этого techniquе позволяет реализовать 3D-стеков изображений или созданных пользователями 3D-модели, тем самым позволяя творческим микрожидком конструкции и для изготовления сложных микрофлюидальных систем практически в любой конфигурации. С ожидаемым эффектом в тканевой инженерии, методы, описанные в этом протоколе может помочь в изготовлении современных биомиметические microtissue конструкций для организмов и человека-на-чипе устройств. Имитируя сложную архитектуру, извилистость, размер и плотность сосудистой сети в естественных условиях, существенные биологические процессы переноса могут быть воспроизведены в этих конструкциях, что приводит к более точному моделированию в пробирке фармакокинетики лекарства и болезни.
Introduction
Сосудистая система, состоящая из обоих лимфатической и cardiovasculature, образует весьма плотные сети, которые необходимы для транспортировки питательных веществ и кислорода и для удаления отходов метаболизма. Соответственно, клетки , проживающие в тканях васкуляризированных никогда не более 50-100 мкм от сосуда 1. Способность воспроизводить в естественных условиях сосудистой архитектуры в пробирке имеет решающее значение для точного моделирования транспортных процессов в естественных условиях с использованием спроектированные конструкции. С недавнего привода для развития органа-на-чипе устройства 2 для высокой пропускной способности препарата скрининг 3,4 и моделирование болезни 5,6, методы создания микрожидкостных сети, перепросматривать транспорта в естественных условиях -как в синтетических или природных гидрогелей рисунок значительный интерес. Для усиления Biomimicry из microtissues, используемых в этих устройствах, мы разработали изображение наведением, на основе лазера метод разложения гидрогеля, который использует три dimensionaл (3D) изображения стеки родной сосудистую в качестве шаблонов для создания сосудистого происхождения микрожидкостных сети , встроенные в PEGDA гидрогели 7. Этот протокол описывает использование коммерчески доступного лазерного сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенного фемтосекундного импульсного лазера для фабрикации сосудистых происхождения, биомиметических микрожидкостных сети в PEGDA гидрогели, с помощью лазера на основе ухудшения качества изображения наведением.
Современные подходы к псевдоожижения гидрогели включают индукцию васкулогенного 8-10 или развитие кровеносных сосудов методами 10-12 эндотелиальные клетки самосборки и микроструктур создавать предварительно определенные каналы для эндотелизации 13-16. В то время как самоорганизующиеся сети перепросматривать плотность и сложную архитектуру микрососудов, они часто являются более проницаемыми , чем сети в естественных условиях 11,17,18, которые могут быть проблематичным при моделировании транспорта для скрининга лекарственных применений. Самоорганизующиеся сети состоят из physiologчески актуальна, капиллярные размера судов, но они могут быть трудно интегрировать с объемного потока жидкости из-за ограничений в области создания больших артериол размера судов. Поскольку нет никакого прямого контроля над сборкой этих сетей, окончательная архитектура может варьироваться в зависимости от образца к образцу, что делает его трудно повторно производить сети с теми же потока и транспортные свойства жидкости.
Для создания 3D, гидрогель встроенные микрожидкостных сети с повторяемой геометрии и четко определенной архитектуры, ряд методов микроструктур были разработаны, в том числе модульной сборки 13, 3D - печати жертвенных материалов 16, сборка прямой записи 14, и всенаправленный печати 15. Применяя эти методы, Микрожидкостных архитектуры и потока и транспортные свойства, поэтому жидкость, может быть многократно изготовлен во многих конструкций. Основным ограничением этих подходов, однако, является невозможность создать микрофluidic сети с капиллярным размером особенностей, от 4 до 10 мкм 19. Большинство методов микротехнологий часто ограничены функциями в пределах от 150 до 650 мкм в диаметре 13,16. Некоторые существующие методы способны генерировать иерархических сетей с каналами в широком диапазоне диаметров, от 10 до 300 мкм для узла 14 прямой записи, и от 18 до 600 мкм для всенаправленной печати 15, но они ограничены в их способности генерировать плотные сети или производить множество микрофлюидных сетей в непосредственной близости в пределах одной конструкции 7.
Для того, чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, мы разработали изображение наведением, лазерная методика на основе деградации гидрогель , который позволяет повторяемое изготовление Biomimetic, иерархические микрожидкостных сети, перепросматривать архитектуру микрососудов в естественных условиях. Для этого, на 790 нм, 140 фемтосекундных (Fs) импульсный лазер, работающий на 80 МГц является растровой разверткой яN желаемый 3D местоположений в гидрогеле, как это определено изображениями сосудистую сеть в естественных условиях. Мы полагаем , что процесс деградации действует через лазериндуцированной оптический пробой воды, формирование полученной плазмы, последующего быстрого термоупругих расширения воды, а также локальной деградации гидрогеля , поскольку вода расширяется 20. Этот механизм немного отличается от лазерной основе деградации белка на основе гидрогелей , 21-24. В отличие от PEGDA, который имеет низкую многофотонный поперечное сечение, белки часто имеют большое многофотонный поперечное сечение и, следовательно , ухудшается через многофотонного поглощения индуцированного химического разрушения 23. Для создания изображения наведением микрожидкостных сети, лазерный затвор управляется изображением полученных виртуальных масок, которые состоят из мозаики регионов интереса 9 , которые определяют микрожидкостных архитектуру. Используя этот подход, мы продемонстрировали способность изготовить 3D-сосудистую производных Biomimetic микрофлюидныхIC сети, которые Повторим плотную и извилистый архитектуру сосудистую сеть в естественных условиях, для того , чтобы локально регулировать пористость гидрогелей путем изменения количества энергии , отдаваемой в процессе деградации. Мы также были в состоянии генерировать два независимых микрожидкостных сети , которые переплетаются в непосредственной близости (15 мкм) , но никогда непосредственно соединяют 7. Мы также продемонстрировали способность endothelialize лазером деградировали микроканалов через пост деградации функционализации с интегрином лигирования пептидной последовательности, Аргинин-глицин-аспарагиновая кислота-серин (УВАЖЕНИЕМ), чтобы способствовать адгезии эндотелиальных клеток и формирование светового потока 7.
С помощью этого протокола, генерация сложных микрофлюидальных сетей в PEGDA гидрогелей стало возможным с помощью, на основе лазера ухудшения качества изображения наведением с использованием коммерчески доступного микроскопа доступный на многих университетских городках. Поскольку процесс деградации руководствуется цифровых, виртуальных масок, это Fabricaметод ции поддается для творческого дизайна микрожидкостных сетей, что позволяет использовать ее в широком спектре приложений. Мы предполагаем , что описанный здесь метод будет наиболее выгодным в проектировании биомиметических организмов и человека-на-чипе устройства , способные реплицироваться биологические процессы переноса важных в моделировании транспорта лекарства 2. Эта технология изготовления также может представлять интерес для генерации моделей в пробирке болезни, в том числе метастазирования рака и 5,6 моделей гематоэнцефалический барьер 25. Как лазер на основе гидрогеля деградации ранее использовался для создания треков для руководства нейронного отростка 21-23, изображение наведением расширение этой техники может оказаться полезным в странах с развитой тканевой инженерии стратегий для размещения клеток в определенных пользователем 3D пространственных механизмов.
Protocol
1. Создание виртуальных масок
Примечание: 3D стек изображение микрососудов мозга мыши была выбрана в качестве модели микрожидком для этого протокола, будучи отобран от гораздо большего набора данных, содержащего образы целой микрососудов мозга мыши. Микрососудистые изображения были получены с помощью ножа обрезом сканирующей микроскопии (KESM) 26, 2; аналогичные микрососудистых данные открыто доступны через KESM Mouse Brain Atlas 28.
- Открытое программное обеспечение обработки изображений 29 и открытым и обрезать стека изображений 3D TIF родной сосудистую систему так , чтобы нужная Микрожидкостных сеть, которая должна вырабатываться внутри гидрогеля, помещается в 450 мкм х 450 мкм х 1,5 мм (х через у по г) окно. Для этого нарисуйте квадрат вокруг нужного региона и нажмите кнопку "Изображение" → "Crop". Удалите ломтики в Z-направлении, нажав кнопку "Изображение" → "Дубликат" и тип в требуемом срезеассортимент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что желаемые характеристики вписываются в поле зрения (х на у) (531,2 х 531,2 мкм при использовании (NA1.0) цель погружения в воду 20X с размером кадра 2884 х 2884 пикселей и зумом 0,8 с лазерной сканирующей конфокальной микроскопии) и рабочее расстояние (г) 20X (NA1.0) объективом погружения в воду. Если неизвестно, то поле зрения для других систем может быть определена путем приобретения изображения с желаемой цели и настройки. - Поворот стека изображения таким образом, чтобы функции в основном выровнены с направлением растрового сканирования, или вдоль оси х, нажав кнопку "Изображение" → "Преобразование" → "Поворот". Это сокращает время, необходимое для изготовления.
- Шкала обрезанной стека изображений, так что матчи размер пикселя или превышает параметры, используемые для деструкции на конфокальной микроскопии (0,184 мкм / пиксель при использовании (NA1.0) цель погружения в воду 20X с размером кадра 2884 на 2884 пикселейи увеличение 0,8). Для этого нажмите на кнопку "Изображение" → "Настройка" → "Размер" и введите "2446" для "Ширина" (то есть, 450 мкм, или размер изображения , деленной на 0,184 мкм / пиксель).
- Порог / Binarize стек изображения, набрав "Ctrl + Shift + T". Снимите флажок "Темный фон" и нажмите кнопку "Применить" → "OK". Завершить процесс, нажав кнопку "Изображение" → "таблицы поиска" → "Инверсия LUT".
- Используя собственный алгоритм (исходный код доступен в дополнительном материале ссылочного рукописи) в ПТК 9, соответствовать двоичному виду (белый) особенности с мозаикой одного пикселя высотой четырехугольников параллельно направлению растрового сканирования (х -направлении) для создания областей интереса (трансформирования) , которые направляют положение лазера и затвор 9, 7, 30, 31, <SUP> 32.
Примечание: Пользовательский алгоритм 9 преобразует каждый отдельный самолет в стеке изображений TIF в файл RLS. - Измените расширение файла из RLS файлов .OVL для использования во время деградации.
2. Настройка лазерной сканирующей конфокальной микроскопии
Примечание: В то время как другие лазерные сканирующие микроскопы, оснащенные импульсными лазерами можно использовать, настройки и протокол здесь описывают использование лазерного сканирующего микроскопа (LSM) в сочетании с его программным обеспечением.
- С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, откройте программное обеспечение микроскопа, и нажмите кнопку "Start System". Выберите цель "W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC VIS-IR M27 75мм" на вкладке "Вести".
- Настройка конфигурации "Гидрогель визуализации"
- На вкладке "приобретение", убедитесь, что выбрана линия лазера (514 нм аргоновый лазер) и в "Лазер" Windoш. Примечание: Этот канал используется для изображения гидрогеля с помощью эозина Y флуоресценции для ориентирования целей 7.
- В окне "Настройка обработки изображений", установите "Mode" в положение "Режим канала", установите "стрелочного каждый" на "Frame", и выберите "Track1".
- В окне "Light Path", выберите только флуоресцентный детектор CH1, с диапазоном от 516 до 735 нм; главный светоделитель (MBS) 458/514 фильтр на линии видимого света; и тарелка в невидимой световой линии. Снимите детектор ФЭУ трубки ярко-поле "T-ПМТ".
- В окне "Режим захвата", убедитесь, что выбран правильный цель и установить "режим сканирования" на "Frame", то "Размер кадра" на "2884", в X и Y, "линии Шаг" на "1" , «число Усреднение" на "1", "Усреднение Mode" на "линии", то "Усреднение метод" до "Среднее", то "Битовая глубина "до" 16 бит ", а" направление "на" <-> "для двунаправленного сканирования.
- В окне "Режим захвата", установите "Speed" в соответствии с пожеланиями и установите "Corr X" и "Y" на "0,05" или корректировать по мере необходимости для конкретного используемого микроскопа. Снимите флажок "HDR".
- В окне "Режим захвата", убедитесь, что "Scan Area" отображает "Размер изображения" из "531,2 мкм х 531,2 мкм" и "Pixel размер" "0,18", с "Zoom" установлено значение "0,8" ; установить все другие значения "Scan Area" к нулю.
- В окне "Каналы", выберите "Track1" в качестве детектора флуоресцентного Ch1. Выберите лазерная линия "514", с процентной силой "10,0", А "точечным" из "1AU", первоначальный "Gain (Master)" из "800", "цифровая Offset" "0", и "цифровой Gain" из4; 1 ".
Примечание: Настройте эти параметры, которые необходимы для конкретного используемого микроскопа. - Сохраните эту конфигурацию, как «гидрогель Визуализация».
- Настройка конфигурации "Канал" Формирование
- На вкладке "приобретение", убедитесь, что линия лазера (790 нм 140 фс импульсными Ti: S лазера) выбран и в окне "Laser". Установите "GDD Коррекция" на "4000" для максимальной выходной мощности при 790 нм.
- Установить окно "Setup" изображение, как описано в пункте 2.2.2.
- В окне "Light Path", убедитесь, что никакие флуоресцентные детекторы не выбраны, с 458/514/561/633 фильтром MBS на видимой линии и МБС 760+ фильтр на невидимой световой линии. Снимите детектор ФЭУ трубки ярко-поле "T-ПМТ".
- В окне "Режим захвата", проверьте, что правильная цель находится в списке. Установите "Speed" на "3"И все остальные параметры, как указано в пункте 2.2.4.
- В окне "Каналы", выберите "Track1" в качестве детектора Т-PMT. Выберите лазерной линии "790", с процентной мощности "100,0", первоначальный "Gain (Master)" в "800", "цифровая Offset" "0" и "Digital Gain" "1" ,
- В окне "Stage", нулевой этап, нажав кнопку "Установить нулевую". Отметьте местоположение, нажав кнопку "Mark". Это очень важно для загрузки виртуальных масок микроскопа макрос на шаге 3.
- В окне "Time Series", набор "Циклы", как "1" и "Интервал", как "0".
- В окне "Bleach", установите флажок "Start Отбеливание после # сканирований" поле и установите его в значение "0 1". Выберите "Различные скорости сканирования", со значением "3" (что соответствует времени пикселя выдержки из 8,96 мкс / пиксель). Выберите "Безопасный блкаждый для GaAsP ".
- В разделе лазерной линии окна "Bleach", выберите 790 лазерной линии и установить процент мощности на "100,0". Оставьте все остальные флажки в окне отбеливателя невыбранные. Сохраните настройки отбеливателя в окне "Bleach".
- Сохраните эту конфигурацию, как "Первый канал формирования".
ПРИМЕЧАНИЕ: "Z-Stack", "Регионы", "Фокус", и окна "Stage" также важны для этого протокола, но не нужно устанавливать или регулировать во время начальной конфигурации.
3. Создание рецепта и загрузка виртуальных масок к микроскопу программного обеспечения и макроэлементов
- С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии еще работает и микроскопа программного обеспечения по-прежнему включен, выберите только окно "Регионы" (рядом с кнопкой "Начать эксперимент") в конфигурации "Формирование канала".
- Для того, чтобы гарантировать, что маски загрузки в микроскоп макро правильныйLY, установить процентную мощность в окне "Каналы" на "0,2" и "Скорость" в окне "Режим захвата" до "8", и нажмите кнопку "Привязать" в верхнем левом углу экрана.
- Убедитесь, что размер изображения по-прежнему "531,2 мкм х 531,2 мкм", с размером пикселя "0,18", на вкладке "Информация" изображения. Если эти значения не верны, проверьте "размер кадра" и значения "Zoom" снова.
- ВАЖНЫЙ: Проверьте, что места X и Y в окне "Стадии" обнулены и что положение отмечено перед открытием микроскопа макроса. Обратитесь к п.2.3.6.
- Чтобы открыть макрос микроскопа, типа "Alt + F8", нажмите кнопку "Load" и выберите правильный вариант. Подробнее см Перечень конкретных материалов / оборудования. Длинный список вложенных макросов откроется в окне "Macro Control".
- В окне "Macro Control", нажмите кнопку "Выполнить", чтобы открыть MICRoscope макрос, а затем закройте окно "Macro Control".
Примечание: Альтернативные версии микроскопа макроса могут быть не совместимы с лазером на основе деградации гидрогеля с использованием этого протокола. - На вкладке "Сохранение" микроскопа макро, обеспечивают произвольное "Базовое имя файла", выберите "один выходной файл", и выбрал папку "временный файл". Установить "Открыть папку Temp" на месте "1", выберите "Single временную папку изображения", и назовите рецепт в "Магазин / Применить Рецепт" с "Список отзыва места» выбран. Нажмите кнопку "Сохранить", чтобы сначала создать рецепт.
- На вкладке "Приобретение" микроскопа макро, убедитесь, что "Конфигурация сканирования" совпадает с именем, заданным в конфигурации микроскопа программного обеспечения, установленного на шаге 2.3. Установите "Нет Времени точек в пределах блока" на "1", с "Interval" "0". Убедитесь в том, что "Помеченные Z - верх Z StacК "подсвечивается зеленым цветом. Все остальные настройки по умолчанию в порядке, как они.
- На вкладке "Timing" микроскопа макро, убедитесь, что "Wait Delay" будет выделен зеленым, установите "Эксперимент повторениями» и «Группа повторы" на "1" и "Wait Интервал перед блоком в первом местоположении Only" на "0" , Все остальные настройки по умолчанию в порядке, как они.
ПРИМЕЧАНИЕ: "Группа Повторения" (а не "Эксперимент") Повторы окно , где можно установить сколько раз лазерного сканирования по области (то есть повторы рецепта). - На вкладке "Z" Список микроскопа макро, плоскости разложения в направлении г уточняются. Установите Z-интервал, "DZ", чтобы "1 мкм", с "Количество позиций" установлен в соответствии с количеством виртуальных масок, которые будут использоваться.
- Нажмите кнопку "Создать Z Стек", чтобы сделать "Z List" появится в выпадающем списке "Liго местоположений "в нижней части окна. Убедитесь, что количество мест и г-расстояния являются правильными и что места X и Y обнулены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если они не являются, не храним рецепт; закрыть микроскопа макрос и повторите шаг 2.3.6 перед повторным открытием микроскопа макрос и снова настройки рецепт.
Примечание: Вместо того, чтобы 100 масок, разнесенных на 1 мкм каждый, например, может быть предпочтительным иметь 50 масок, каждый из занятых в два раза, и отстоят друг от друга 1 мкм, чтобы получить эквивалентную микрофлюидальный структуру, как и загрузки отдельных масок для микроскопа макрокоманда может отнимать много времени. - На вкладке "Bleach" микроскопа макро, все маски должны быть загружены и согласованы с конкретным пронумерованном месте в "Список местоположений". Для начала, установите флажок "Bleach" и убедитесь, что "Config." совпадает с именем настройки отбеливающих в окне "Bleach" в главном экране микроскопа программного обеспечения (обратитесь к шагу 2.3.8). Установить "Подождите Задержка после Bleach" на "0", снимите флажок "спот" и оставить "ROI" пустым.
- Есть ли что-нибудь в "Location" не изменяет, "Плитка", "Сетка", "Автофокус", "блоки" и "Параметры" вкладки из настроек по умолчанию.
- Для загрузки масок с микроскопом макро, выберите только окно «Регионалы» в программном обеспечении микроскопа и откройте вкладку "Bleach" микроскопа макроса. В окне "Регионы", нажмите кнопку "Load" и выберите файл .OVL для маски в нижней части Z-стека деградирует.
Примечание: Первое положение в "Z" список является нижней части Z-стека, а микроскоп макро работает свой путь к вершине Z-стека, или гидрогеля. - После того, как список трансформирования появится в окне "Регионы", нажмите кнопку со стрелкой для просмотра трансформирования маски в поле зрения (на изображение сфотографирована на шаге 3.2). Убедитесь в том, что трансформирования вписываться вполе зрения.
- Чтобы сохранить загруженный маску в микроскоп макро, дайте маске имя и номер в поле "Добавить текущий регион в список ROI" на вкладке "Bleach", а затем нажмите кнопку "Добавить текущую область в список ROI". Название и номер появится в "ROI" выпадающего списка с любыми другими масками (включая маски из других ранее созданных рецептов). Удалить маску в окне «Регионалы» в программном обеспечении микроскопа.
- Повторите шаги 3.14 и 3.16, чтобы загрузить и сохранить все маски для микроскопа макроса.
- Чтобы назначить загруженными маски для каждого Z-местоположения, выделите позицию 1 в раскрывающемся списке "Список местоположений". Выберите соответствующий ROI от "ROI" списка. Убедитесь в том, что поле "Bleach" выбрано в верхней части вкладки "Bleach" в микроскоп макроса.
- Повторите шаг 3,18 для всех позиций в раскрывающемся списке "Список местоположений", а затем нажмите кнопку "магазин" на &# 34; Сохранение "на вкладке, чтобы сохранить рецепт в его окончательном виде.
4. фотополимеризации с PEGDA гидрогеля
- Создание Стерильный HEPES буферном солевом растворе (HBS) с триэтаноламина (TEOA)
- В 1-л лабораторный стакан, добавьте 500 мл ДИ H 2 O. мешалкой, размешать в 2,922 г хлорида натрия, 1,196 г HEPES и 7,5 мл TEOA в вытяжном шкафу.
- Доведения рН до 8,3 с помощью раствора гидроксида натрия 1н путем добавления по каплям с помощью пипетки Пастера.
- Стерильный фильтр раствор через 0,2 мкм вакуумной присоской фильтрации в автоклавного стеклянной бутылке СМИ 500 мл. Алиготе и хранить при температуре 4 ° С.
- Приложите кольцо двусторонней клейкой с поддержкой специализированному 60-мм чашки Петри с 20-мм отверстие вырезать из нижней части. Оставляя поддержку на клеевой кольца, выдавить пузырьки воздуха из пространства между чашку Петри и клея.
- Подготовьте материалы. Доведите синтезированного 33 3.4 кДа PEGDA из -80 ° C морозильника и дайте ему нагреться до комнатной температуры. Включите источник белого света, по крайней мере за 15 минут до фотополимеризации гидрогели.
- В вытяжном шкафу, добавляют 1 мл HBS с TEOA до фольги, покрытой, 2-мл янтарного центрифужную пробирку (используется для предотвращения попадания света фотоинициатора, эозина Y). Добавляют 10 мкл 1 мМ эозина Y динатриевой соли в ДИ H 2 O.
- В вытяжном шкафу, извлечь небольшой объем 1-винил-2-пирролидон (НВП) в стеклянный стакан с пипеткой Пастера. Из этого объема, пипетки 3,5 мкл НВП в янтарный центрифужную пробирку с HBS, TEOA и эозином Y.
- Во втором из фольги, покрытой, 2-мл янтарного центрифужную пробирку (используется для предотвращения ошибочного фотоактивацию раствора предполимера), добавляют 10 мг 3.4kDa PEGDA. Добавить 0,2 мл HBS, TEOA, эозина Y, НВП решение для 5% вес / объем раствора полимера предварительно PEGDA. Vortex до PEGDA полного растворения. С помощью измерителя мощности и детектора палочки, регулировать интенсивность белого Liисточник GHT до 95 мВт.
- Построение поли (диметилсилоксан) (PDMS) Плесень
- Построить PDMS плесень 7 на большей поверхности (стекло, полистирол тканевой культуры блюдо) для удобства обработки и сборки пресс - формы , такие , что формованные гидрогели подходят в пределах круга диаметром 20 мм.
- Для генерирования прямоугольной формы гидрогель с толщиной 500 мкм, поместите два 500 мкм толщиной PDMS проставки на поверхность PDMS для создания двух определенных гидрогелевые кромок.
- Включите 300 мкм PDMS распорку, чтобы придать 300 мкм скважины глубиной на поверхности гидрогеля, который является полезным для введения жидкости.
- Пипетка 60 мкл 5% вес / объем раствора форполимера PEGDA на форму PDMS. Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырьков во время пипеткой.
- Центр и место [3- (метакрилоилокси) пропил] триметоксисилана (TMPSA) функционализированный 7, диаметр 40 мм, # 1.5 покровного стекла на верхней части раствора. Убедитесь в том, что coverslIP лежит на PDMS распорок 500 мкм. Гидрогель будет связываться с метакрилированные покровное и предотвратить гидрогель из плавающих в растворе.
- Поместите PDMS, раствор предварительно полимера PEGDA и покровное сборку под источником белого света в течение 3 мин.
- Поток ДИ H 2 O между формой и покровное , чтобы отделить гидрогель из PDMS. Ополосните гидрогель с DI H 2 O. Сухие края покровного стекла с лабораторной ткани. Будьте осторожны, чтобы не трогать или фитиль воду из гидрогеля.
- После удаления подложку с клеящей, придерживаться покровное на подготовленную чашку Петри и осторожно удалить пузырьки воздуха из пространства между клеевым слоем и стеклом. Погрузитесь гидрогель в чашку Петри с DI H 2 O.
ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS плесень может быть повторно использована , чтобы сделать дополнительные гидрогели , если промыты дистиллированной H 2 O, сушат с помощью азота, и свободными от пыли.
5. фабрикации Сосудистый происхождения Микрожидкостных сетьс помощью лазерной основе Деградация
- С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и программного обеспечения микроскопа на, выберите цель "W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC VIS-IR M27 75мм" на вкладке "Вести". На вкладке "приобретение", убедитесь, что необходимые лазерные линии (514 нм аргоновый лазер и 790 нм 140 фс импульсными Ti: S лазера) включены и прогреты.
- Настройка Гидрогель для формирования входного канала
- Установить гидрогель и чашку Петри на этапе вставки и поместите этап вставки на столик микроскопа. Заполните чашку Петри, по меньшей мере 5 мл ДИ H 2 O. Центр гидрогеля и также особенности на глаз перед опусканием цель погружения в воду в DI H 2 O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не раздавить гидрогель с целью-два никогда не должны трогать! - Чтобы найти гидрогель, переключиться на конфигурацию "гидрогель" Визуализация с шага 2.2. Нажмите кнопку "Live", чтобы включить линию лазера на и принести тысе цель ближе к гидрогеле до эозина Y сигнала (детектирован детектором флуоресцентного СН1) в верхней части гидрогель можно увидеть.
Примечание: Чтобы найти гидрогель легко, процент мощность может быть увеличена или обскура может быть открыт. После того, как цель ориентирована на гидрогеля, однако, падение процентов мощности, чтобы защитить флуоресцентного детектора и уменьшить крошечное отверстие обратно в 1AU, чтобы избежать перенасыщения детектора и точно находить поверхность гидрогеля. - В окне "Stage", отметьте расположение в верхней и нижней части гидрогеля и дна колодца.
Примечание: Z-значения здесь поможет в определении толщины гидрогеля и глубину скважины. - Используйте джойстик для перемещения в X и Y, чтобы найти край колодца. Поместите гидрогель в правой части экрана, с хорошо слева, или наоборот. Разрешить гидрогель не заполнять не более чем на две трети поля зрения.
- Отбросьте плане фокуса вниз 150 мкм в гидрогель, установив "Размер шага" до "150" в окне "Фокус" и нажмите на стрелку вниз рядом с полем "Z-Position". Повторите шаг 5.2.4, если это необходимо.
Примечание: х, у, г положение впускного отверстия зависит исключительно от конструкции виртуальных масок. - ВАЖНЫЙ: Обнуление X и Y расположение в окне "Stage", удалите все другие отмеченные места, и только пометить это место.
Примечание: Если этот шаг не выполняется, микроскоп макрос не будет правильно восстановить места в ранее сохраненного рецепта, и гидрогель не будет разлагаться в нужном месте.
- Установить гидрогель и чашку Петри на этапе вставки и поместите этап вставки на столик микроскопа. Заполните чашку Петри, по меньшей мере 5 мл ДИ H 2 O. Центр гидрогеля и также особенности на глаз перед опусканием цель погружения в воду в DI H 2 O.
- Формирование входного канала
- "Привязка" изображение и нарисуйте прямоугольную область, которая будет на входе в сосудистую сеть с помощью кнопки прямоугольник в окне "Регионы".
Примечание: Убедитесь, что часть области простирается в скважину, чтобы гарантировать, что йна входе е соединит скважины к сосудистой сети. - Рядом с ROI, генерируемой в окне "Регионы", выберите "приобретение" и снимите флажок "Bleach" и "Анализ".
- Сохраните конфигурацию "Гидрогель Визуализация", снимите флажок «Регионалы», и изменения в конфигурации "Формирование канала", созданного на шаге 2.3. В конфигурации "Формирование канала", выберите "Регионы" снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: При переключении между «гидрогель Визуализация» и «Формирование канала» конфигураций, не забудьте отменить выбор регионов в верхнем левом углу экрана. Иногда масштабирование регионов может неожиданно измениться между конфигурациями, если это не будет сделано. - В конфигурации "Формирование канала", убедитесь, что только "Регионы" и "Z-Stack" выбраны. В окне "Z-Stack", нажмите кнопку "Центр" в верхней части и затем "Центр" стыковойна выше "Offset", чтобы задать центр Z-стека в качестве текущего Z-положении. В зависимости от того, насколько велика на входе должно быть, установить количество "Кусочки" с "Interval" "1". Размер Z-стека будет отображаться под "Диапазон".
- Убедитесь, что "Скорость" в окне "Режим захвата" установлен в положение "3" и что "Процент мощности" в окне "Каналы" установлен в положение "100". Сохраните конфигурацию и нажмите кнопку "Начать эксперимент".
Примечание: Микроскоп макрокоманда не требуется для разложения ту же самую простую форму на нескольких плоскостях, как выполнено здесь, чтобы сформировать канал на входе. Макросъемки требуется только тогда, когда деградирует различные регионы на каждой отдельной плоскости, и он используется для хранения виртуальных масок в рецепте. - Для визуализации гидрогеля во время деградации, либо увеличить "Gain (Master)" в окне "Каналы", если область в тон поле зрения является черным, или уменьшить "Gain (Master)", если область белого цвета.
Примечание: формирование пузыря здесь является показателем лазерно-индуцированной деградации гидрогеля. - Деградировать впускном несколько раз, а не только один раз, отрегулируйте "Циклы" в окне "Time Series".
- В конфигурации "Гидрогель Визуализация", нажмите кнопку "вживую", чтобы убедиться, что на входе был сформирован.
- "Привязка" изображение и нарисуйте прямоугольную область, которая будет на входе в сосудистую сеть с помощью кнопки прямоугольник в окне "Регионы".
- Настройка гидрогеля для генерации Микрожидкостных сети
- В окне "Регионы", загрузить любой файл .OVL из Z-стека виртуальных масок и нажмите кнопку со стрелкой, чтобы увидеть трансформирования в поле зрения.
- Нажмите кнопку "Live", чтобы жить сканировать конфигурацию "Гидрогель визуализации" и с помощью джойстика или окно "Stage", чтобы позиционировать гидрогель в X и Y, таким образом, что входное отверстие соединяет в правильное место в сосудистой сети.
Примечание: Убедитесь, чтоТрансформирования виртуальной маски слегка перекрывается с предварительно формованной входом. - Отбросьте плоскость фокуса вниз 50 мкм по сравнению с предыдущим центром Z-адресом, или 200 мкм от поверхности гидрогеля, используя "Step Size" в окне "Фокус" и нажмите на стрелку вниз рядом с "Z-Position "коробка. Это будет первая позиция в микроскоп макроса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фактическое расстояние двигаться в направлении г зависит от конструкции сети. Убедитесь, что требуемая сеть не выходит за пределы верхней или нижней поверхности гидрогеля в Z-направлении. - ВАЖНЫЙ: Обнулить места X и Y в окне "Stage", удалите все другие отмеченные места, и только пометить это место.
Примечание: Это будет отправной точкой в микроскоп макроса. Рецепт будет работать свой путь назад по направлению к поверхности гидрогеля. - "Привязка" изображение в конфигурации "Гидрогель Визуализация", удалять и deselecт "Регионы", и сохраните конфигурацию.
- Создание Микрожидкостных сети
- Изменение конфигурации "Формирование канала", и только выбрать "Time Series" и "Отбеливающие" окна. Убедитесь в том, что настройки для "Time Series" и окна "Отбеливатели" являются, как они были первоначально установлены на этапах 2.3.7 и 2.3.8.
- Установите "Скорость" в окне "Режим захвата" до "8" и процент мощности лазерной линии на "0,2" в окне "Каналы". Сохраните конфигурацию.
- Открыть микроскопа макрос следующим шагом 3.5. На вкладке "Сохранение" макроса, выберите ранее сделанный рецепт из шага 3 и нажмите кнопку "Применить".
Примечание: Не нажимайте кнопку "магазин" или рецепт будут перезаписаны! - Проверьте настройки на всех вкладках и убедитесь, что виртуальные маски (.OVL файлы) по-прежнему правильно связаны с тон Z-места в списке. Также проверьте, что первый Z-расположение соответствует отмеченному местоположению в окне "Stage" программного обеспечения микроскопа.
Примечание: это и противоречит интуиции, второе место в списке ниспадающего будет физически выше первого местоположения, в качестве микроскопа макро будет работать свой путь от нижней части гидрогеля (самый дальний от цели) к верхней части гидрогеля (ближе всего к задача). - Сохранить конфигурацию "Формирование канала" еще раз, а затем нажмите кнопку "Обновить" в микроскоп макроса. Нажмите кнопку "Нет" "Переписать текущий список Местоположение?", А затем нажмите кнопку "Пуск" в микроскоп макроса, чтобы начать рецепт.
6. Визуальное Микрожидкостных сеть
- Для просмотра гидрогель и образовавшейся микрожидкостных сети после деградации, закрыть микроскопа макрос. Переход к конфигурации "гидрогель" Визуализация для просмотра эозина Y сигнал гидрогеля; непригодное сеть появится темный.
Примечание: Деградация гидрогель не могут быть визуализированы в то время как микроскоп макрос выполняется. - Для просмотра микрожидкостных сети специально, использовать конфигурацию «гидрогель визуализация» при более низкой мощности лазера, чтобы включить визуализацию введен флуоресцеина (FITC) меченных декстрана, который имеет более яркий сигнал, чем нативный эозина Y сигнала гидрогеля.
- Перед введением флуоресцентно меченого декстрана, фитиль воду из колодца в гидрогеле с использованием лабораторной ткани. Пипетка в 10 мкл 5 мг / мл 2000 кДа FITC-меченого декстрана в DI H 2 O (предварительно фильтруют через шприцевой фильтр 0,2 мкм).
Примечание: Используйте любой декстран размером 2000 кДа или больше, чтобы предотвратить распространение в гель. Если изображения в течение более 30 мин, используют инкубированный стадию с 60% влажности (или выше), чтобы предотвратить гидрогеля сушку и выпаривание воды из FITC-меченого декстрана раствор. - Удалите гидрогеля Aй Петри со сцены и отметьте чашку Петри, чтобы позволить легкое расположение сформированной сосудистой сети во время последующего эксперимента.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать реализацию изображения наведением, на основе лазера деградации гидрогеля для формирования 3D, производный сосудисто-микрожидкостных сети, мы использовали 3D - стека изображений сосудистой сети мозга мыши , который был приобретен с помощью ножа обрезом сканирующей микроскопии (KESM) 26, 27 , Выбранный 3D область более крупного набора данных микрососудов был преобразован в серии виртуальных масок для формирования Микрожидкостных сетевого образа наведением, как описано выше. После изготовления, в результате Микрожидкостных сеть перфузию раствором ФИТЦ-меченым, 2000 кД декстрана и с помощью отображаемого конфокальной микроскопии. Стек изображений сосудистой сети в естественных условиях , которые определили сетевую архитектуру (Рисунок 1А и С) и изготовлены Микрожидкостных сети (Фиг.1В и D) , были использованы для создания Z-проекции (рис 1А и В) и 3D - визуализации (фиг.1С и D в естественных условиях. Методика поддается изготовления сетей, содержащих широкий диапазон диаметров; в рисунке 1, были получены каналы в диапазоне от 3,3 до 28,8 мкм в диаметре. Следует отметить , что большая прямоугольная структура в верхнем левом рисунке 1В и в левом углу рис 1D является впускной канал для введения потока в сеть.
Рисунок 1: сосудисто-Derived микрожидком сеть. Последовательность виртуальных масок, полученный из стека изображений сосудистой сети мозга мыши (А и С), были использованы для Fabricaт.е 3D - Biomimetic микрожидкостных сеть встроенный в гидрогеле PEGDA (B и D) через, на основе лазера ухудшения качества изображения наведением. Микрожидкостных сеть вливают с 2000 кДа FITC-меченого декстрана и с помощью отображаемого конфокальной микроскопии. Z-проекции (А и В) и 3D - визуализации (C и D) двух сетей продемонстрировать способность генерировать микрожидкостных сети, перепросматривать плотность, организацию и общую архитектуру сосудистую сеть в естественных условиях. Стрелка (D) знаменует собой прямоугольный вход , созданный для введения декстрана. Шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Мы внедрили два метода, головок давления и шприцевые насосы для инициирования жидкости пнизким содержанием этих встроенных микрофлюидальных сетей. Например, 30 по 30 мкм прямоугольный канал был изготовлен для соединения двух лунок в micromolded PEGDA гидрогеля (фиг.2А), с потоком жидкости в движение через головку 7 давления. Сгенерировано в левой яме, напорный индуцированный поток через микроканалов и в колодец справа. На рисунке 2А, начальный фронт тетраметилродамин (TRITC) меченных, 70 кДа декстран наблюдалось перемещение по каналу с помощью покадровой микроскопии. Позже, на фигуре 2В, диаметром 10 мкм флуоресцентные полистирола сфера текла из левой яме, через канал, к колодцу справа. При длительности потока контролируемого объема жидкости, присутствующей в скважине micromolded на входе и скорости потока контролируемой гидростатического градиента, возникающего между входным и выходным отверстием и, гидростатический напор управляемый поток в micromolded гидрогелей обеспечивает простой метод для потока вводственных, без необходимости внешнего корпуса или шприцевой насос.
Рисунок 2: Давление Head-Driven потока в Micromolded PEGDA гидрогеля. PEGDA был micromolded с образованием гидрогеля, содержащего две скважины, соединенные встроенным микроканала. Напорный сформировалась в левой яме , чтобы инициировать поток TRITC-меченого, 70 кДа декстрана (А1-А3) и полистирола сферы диаметром 10 мкм (B1-B3) через прямоугольный канал 30 на 30 мкм от одной скважины до Другие. Шкалы составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В качестве альтернативы, для создания постоянного потока текучей среды внутри микроканалов сети, шприцевой насос приводом Fнизкое значение может быть инициировано фотополимеризации гидрогеля внутри вторичного микрожидком устройства с входными и выходными портами для шприцевого насоса интерфейсной. На фигуре 3А, коммерчески доступный, быстровозводимых Микрожидкостных устройство показано с 1-мм полосу гидрогеля фотополимеризованные по всей ширине устройства 7. Деградация на основе лазера была реализована для изготовления микрожидкостных каналов и сетей в корпусном гидрогели, используя тот же протокол, описанный здесь, отдельно стоящая гидрогели. Шприцевой насос , сгенерированных поток можно видеть на фигуре 3В, где цилиндрический диаметр канала 20 мкм изготавливали в гидрогеле размещалась в микрожидком устройстве. В этом канале диаметром 20 мкм, отдельные 2 мкм флуоресцентные полистирола сферы легко разрешаются без потока жидкости (рис 3B1), в то время как при применении / с скорость потока 5 мкл, сферы перемещаться по полю зрения, о чем свидетельствует исчерчивать (Рисунок 3B2 </ Сильный>). Этот же подход был использован , чтобы вызвать поток через 2D, сосудистый полученных сети для мониторинга потока TRITC-меченого, 65 кДа декстрана через сеть и диффузии в окружающую гидрогеля (рис 3C).
Рисунок 3: шприцевой насос-Driven потока в PEGDA гидрогели полимеризуется в микрожидком корпусы. Имеющийся в продаже, быстровозводимые Микрожидкостных устройство (А) с 17 х 3,8 х 0,53 мм (х, у, г) микроканале жилище фотополимеризованные 1 х 3,8 х 0,53 мм (х, у, г) PEGDA гидрогеля, с указанием черная стрела. Цилиндрический диаметр канала 20 мкм деградировала через гидрогеля, и 2-мкм полистироловые сферы прокачивали через устройство (B). Сферы четко решены без потока жидкости (В1), но они появляются в виде прожилок при скорости потока 5 мкл / с(В2). В другом размещалась гидрогеля, 2D - сосудистый производных сеть была изготовлена и TRITC-меченого, 65 кДа декстран прокачивали через сеть (C). Покадровый микроскопию использовали для мониторинга флуоресцентного декстран, как она заполнила каналы и диффундировать в окружающие гидрогеля. Белые стрелки в (В) и (С) указывают направление потока жидкости. Панель калибровки в (С) указывает на интенсивность флуоресцентного декстрана. Масштабные столбики представлены 20 мкм , (В1) и (В2) и 50 мкм (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Важнейшую роль в переопределение стандартные функции программного обеспечения микроскопа, чтобы разрешить использование виртуальных масок для, на основе лазера ухудшения качества изображения наведением, микроскоп макрос должен быть настроен и тщательно манипулируют. Как интерфейсы микроскопа программного обеспечения с помощью микроскопа макро иногда может быть противоречит здравому смыслу, и много усилий было вложено в определении оптимальных параметров в обеих программах для разработки этого метода. Общее понимание основных лазерной сканирующей конфокальной микроскопии использование рекомендуется, особенно с "Stage" и "Фокус" окна для поиска и правильного позиционирования гидрогель в плоскости х, у, и размеры г, перед попыткой деградации на основе лазера. Кроме того, изготовление впускного канала имеет решающее значение для протокола; подвесные люминесцентные виды должны иметь возможность ввести Микрожидкостных системы для успешной визуализации и сетевых характеристик. Важно отметить, что этот протокол применяется к конкретному лазерносканирующей конфокальной микроскопии сконфигурирован с определенным фемтосекундного импульсного лазера, выполнения определенных версий программного обеспечения микроскопа и микроскопа макро (подробнее см Перечень конкретных материалов / оборудования). Мы обнаружили, что новые версии микроскопа макроса не хватает необходимого контроля и функциональных возможностей, необходимых для изображения наведением лазерного управления. В то время как другие микроскопы платформы и импульсные лазерные источники могут быть использованы, этот протокол применяется именно к этой системе и будут нуждаться в модификации в зависимости от платформы, источник лазерного излучения, а также программное обеспечение реализовано. Основополагающие принципы на протяжении всего этого протокола все еще применяются, однако.
Потенциальный модификация этого протокола предполагает изменение композиции гидрогеля. Здесь мы использовали 5 мас%, 3,4 кДа PEGDA гидрогели, но разложение на основе лазера (для целей помимо микрожидком поколения сети) внедрена деградировать как синтетические и природные гидрогели, в том числе пегилированного фибринаоген 21,22, шёлковый протеин гидрогели 23, и коллаген 24. Регулировка мощности лазерного излучения, скорость сканирования, интервал между Z-срезах, а также количество повторений поможет в определении оптимальных параметров для изготовления микрожидкостных сети в других гидрогелевых композиций.
Одно ограничение тока техники является общий объем гидрогеля, который может разлагаться в осуществимый промежуток времени. Чтобы создать открытые пустоты или микрожидкостных особенности внутри гидрогеля, лазер время выдержки должно быть на уровне или выше 8,96 мкс / пиксель (или скорости сканирования лазерного 0,021 мкм / мкс) при использовании плотности энергии лазерного излучения 37.7 нЖ / мкм 2. С помощью этих настроек, она занимает 1,4 часа деградировать судов в объеме 0,014 мм 3 (как показано на рисунке 1). Использование лазерного времени выдержки от 4,48 мкс / пиксель или ниже, энергия поставляется недостаточно для полной деградации композиции гидрогеля, используемого здесь. Реализация другого гидрогельКомпозиция может преодолеть это ограничение. Использование фотолабильными гелей, содержащих светочувствительные компоненты 34-36 или гидрогели , которые имеют большие многофотонных сечений 21-24 хорошие варианты , которые позволили бы использовать меньше энергии и привели бы к более быстрому разложению. Что касается пространственных ограничений, возможности были изготовлены до глубоких в гидрогеле 7 1,5 мм. Глубина достижимой является функцией рабочего расстояния объектива и может быть увеличена с помощью ультра-длиннее расстояние цели , оптимизированных для визуализации в естественных условиях. Наименьшая измеренная канал 7 создается с использованием 20X (NA1.0) цель погружения в воду имела ширину 3,3 мкм и глубину 8,9 мкм, которая находится на одном уровне с размером самых маленьких каналов , генерируемых на рисунке 1. В то время как другие лаборатории использовали низкие цели НС 21,23,24, мы ожидаем , что микрофлюидальные сети с меньшими функциями могут быть получены с использованием высокихЦели эр Н.А. за счет уменьшенного рабочего расстояния. В конечном счете, однако, разрешение метода является функцией от функции рассеяния точки сфокусированного лазерного луча, свойства сканирования лазера, количество энергии, с помощью лазера, и свойства лазерного поглощения материала деградирует.
Кроме того, лазерные свойства (скорость, плотность потока, расстояние между виртуальными масками, и количеством повторений) должен быть оптимизирован в зависимости от свойств гидрогеля (плотность сшивок, макромер / мономер молекулярной массы, весовой процент, и тип гидрогеля: на основе белков по сравнению с синтетическими ), так как они будут по своей сути изменяют взаимодействие с лазером и, таким образом, в конечном итоге разрешения процесса. По мере того как энергия поставляется также зависит от цели, используемой, дополнительная оптимизация требуется при переключении между задачами. Что касается расходов, связанных, доступ к микроскопу с импульсным лазером требуется, и в то время как много различных объективистскиеставители могут быть использованы, те , с высокой числовой апертурой и большим рабочим расстоянием (для визуализации в естественных условиях) может быть дорогим.
Выше и вне протокола подробно описаны здесь, микрофлюидальные сети , генерируемые с помощью этой методики можно также функционализированных клеточно-клеевой пептидов после изготовления канала для индукции адгезии эндотелиальных клеток и формирование светового потока 7. Кроме того, введение клеток-разлагаемые пептидных последовательностей в объемном материале 9 до канала деградации может позволить для изучения миграции клеток в и через гидрогель. Для непрерывного псевдоожижения микрожидком сети в гидрогеле, гидрогели могут быть фотополимеризованные в больших жидкостных устройств или корпусов, как показано на рисунках 2 и 3 7.
Поколение сосудистых сетей через васкулогенного или ангиогенного самосборки 8-12 обеспечивает прямой подход к индуцируют ваscularization на протяжении относительно большого объема гидрогеля. Хотя такой подход приводит к perfusable жидкостных сетей, то трудно непосредственно контролировать размер, извилистость, плотность и общую архитектуру сети. Из-за этого ограничения, профиль потока и скорости сдвига в сосудистой системе могут отличаться между экспериментами. В качестве альтернативы, методы микротехнологий 13-16 для обеспечения непосредственного контроля над сетевой архитектурой , но часто ограничены неспособностью генерировать маленькие, капиллярные размера каналов или изготовление плотных сетей , которые имитируют в архитектуре естественных условиях сосудистой. В то время как лазер на основе гидрогеля метод деградации описано здесь была вновь переориентированы для микрожидком поколения, он одновременно преодолевает как архитектурно-строительного контроля и размера на основе ограничения существующих методов микроструктур, позволяя создавать 3D биомиметические микрофлюидальных сетей, перепросматривать плотность, извитость, диапазон размеров, и в целом architecturе сосудистую сеть в естественных условиях. Кроме того, множественные жидкостные сети могут быть сформированы в одном гидрогель, что позволяет изучение межсетевом транспорта 7. Для тканевой инженерии , которые стремятся к более тесному репликации в естественных условиях процессов переноса в лабораторных условиях , высоко разрешенные гидрогель встроенные микрофлюидальные сети , описанные здесь , хорошо подходят. Мы ожидаем , что этот протокол будет полезен при разработке конструкции ткани , которые более точно имитируют транспорт в естественных условиях для использования в качестве скрининга лекарственных средств устройств и экстракорпоральное моделей заболеваний.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
