This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
यह विस्तृत प्रोटोकॉल संवहनी व्युत्पन्न microfluidic PEGDA हाइड्रोजेल में एम्बेडेड नेटवर्क के निर्माण के लिए छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट के कार्यान्वयन की रूपरेखा। यहाँ, हम आभासी मास्क उस छवि को निर्देशित लेजर नियंत्रण के लिए अनुमति की रचना का वर्णन; एक micromolded PEGDA हाइड्रोजेल, microfluidic नेटवर्क के निर्माण और दबाव सिर संचालित प्रवाह के लिए उपयुक्त की photopolymerization; सेटअप और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग confocal एक femtosecond स्पंदित तिवारी के साथ रखा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें: एस लेजर हाइड्रोजेल गिरावट प्रेरित करने के लिए; और गढ़े microfluidic नेटवर्क की इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रजातियों और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग। प्रोटोकॉल के लिए बहुत, उचित स्थापना और माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर और माइक्रोस्कोप मैक्रो के कार्यान्वयन पर ध्यान केंद्रित किया है के रूप में इन microfluidic निर्माण प्रयोजनों कि जटिलताओं के एक नंबर के होते हैं के लिए एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस तकनीकों की छवि को निर्देशित घटकई जिससे रचनात्मक microfluidic डिजाइन के लिए और लगभग किसी भी विन्यास के जटिल सिस्टम microfluidic के निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए, 3 डी छवि के ढेर या उपयोगकर्ता जनित 3 डी मॉडल के कार्यान्वयन के लिए अनुमति देता है। ऊतक इंजीनियरिंग में एक उम्मीद प्रभाव के साथ, तरीकों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित अंग और मानव-ऑन-ए-चिप उपकरणों के लिए उन्नत biomimetic microtissue निर्माणों के निर्माण में सहायता कर सकता है। जटिल वास्तुकला, टेढ़ा-मेढ़ापन, आकार, और इन विवो वाहिका का घनत्व नकल उतार द्वारा, आवश्यक जैविक परिवहन प्रक्रियाओं इन निर्माणों में दोहराया जा सकता है, दवा फार्माकोकाइनेटिक्स और रोग का अधिक सटीक इन विट्रो मॉडलिंग के लिए अग्रणी।
नाड़ी तंत्र, दोनों लसीका और cardiovasculature से मिलकर, रूपों अत्यधिक सघन नेटवर्क है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के परिवहन के लिए और चयापचय अपशिष्ट को हटाने के लिए आवश्यक हैं। तदनुसार, vascularized ऊतकों की कोशिकाओं में रहने वाले कभी नहीं एक पोत 1 से अधिक से अधिक 50-100 माइक्रोन दूर हैं। इन विट्रो में इन विवो संवहनी वास्तुकला पुन: पेश करने की क्षमता सही इंजीनियर निर्माणों का उपयोग करने में विवो परिवहन प्रक्रियाओं मॉडल करने के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में एक 3,4 और रोग मॉडलिंग 5,6 स्क्रीनिंग उच्च throughput दवा के लिए अंग-ऑन-ए-चिप उपकरणों 2 विकसित करने के लिए ड्राइव के साथ, तरीकों microfluidic नेटवर्क है कि पुनरावृत्ति सिंथेटिक या प्राकृतिक हाइड्रोजेल में इन विवो तरह परिवहन बैठक कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण हित। इन उपकरणों में इस्तेमाल किया microtissues की biomimicry बढ़ाने के लिए, हम एक छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट तरीका है कि तीन-dimensiona का इस्तेमाल विकसितटेम्पलेट्स के रूप में देशी वाहिका के एल (3 डी) छवि के ढेर संवहनी व्युत्पन्न microfluidic PEGDA में एम्बेडेड हाइड्रोजेल 7 नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए। इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग confocal एक femtosecond स्पंदित लेजर छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के माध्यम से PEGDA हाइड्रोजेल में संवहनी व्युत्पन्न, biomimetic microfluidic नेटवर्क के निर्माण के लिए के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के उपयोग की रूपरेखा।
हाइड्रोजेल fluidize करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण vasculogenic 8-10 या 10-12 एन्जियोजेनिक endothelial सेल आत्म विधानसभा और तकनीक microfabrication की प्रेरण endothelialization 13-16 के लिए पूर्व निर्धारित चैनल बनाने के लिए शामिल हैं। आत्म इकट्ठे नेटवर्क घनत्व और microvasculature की जटिल संरचना पुनरावृत्ति है, वे अक्सर इन विवो नेटवर्क 11,17,18, जो दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए मॉडलिंग परिवहन में समस्याग्रस्त किया जा सकता है और अधिक से अधिक प्रवेश के योग्य हैं। आत्म इकट्ठे नेटवर्क physiolog से मिलकर बनता हैically प्रासंगिक, केशिका आकार के जहाजों, लेकिन वे बड़े धमनिका आकार के जहाजों को पैदा करने में सीमाओं के कारण थोक तरल पदार्थ के प्रवाह के साथ एकीकृत करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इन नेटवर्कों का विधानसभा पर कोई सीधा नियंत्रण नहीं है अत: अंतिम वास्तुकला यह मुश्किल बना रही है बार बार एक ही द्रव का प्रवाह और परिवहन गुणों के साथ नेटवर्क के उत्पादन के लिए नमूने के लिए नमूना से भिन्न हो सकते हैं।
3 डी, repeatable ज्यामिति और अच्छी तरह से परिभाषित वास्तुकला के साथ हाइड्रोजेल एम्बेडेड microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए, microfabrication तकनीकों का एक नंबर मॉड्यूलर विधानसभा 13, बलि सामग्री 16, प्रत्यक्ष लिखने विधानसभा 14, और सर्वदिशात्मक मुद्रण 15 के 3 डी मुद्रण सहित विकसित किया गया है। इन तरीकों, microfluidic वास्तुकला, और इसलिए द्रव का प्रवाह और परिवहन संपत्तियों को लागू करने, बार-बार कई निर्माणों भर में गढ़े जा सकता है। इन तरीकों में से एक प्रमुख सीमा है, तथापि, microf बनाने के लिए अक्षमता हैकेशिका आकार सुविधाओं के साथ luidic नेटवर्क, 4 से 10 माइक्रोन से 19। अधिकांश तकनीक microfabrication अक्सर व्यास 13,16 में 150 से 650 माइक्रोन से लेकर सुविधाओं तक सीमित हैं। कुछ मौजूदा तकनीक प्रत्यक्ष लिखने विधानसभा के लिए 14 एक विस्तृत व्यास रेंज भर में चैनलों के साथ श्रेणीबद्ध नेटवर्क पैदा करने, 10 से 300 माइक्रोन के लिए सक्षम हैं, और 18 के लिए सर्वदिशात्मक मुद्रण 15 के लिए 600 माइक्रोन, लेकिन वे घने नेटवर्क या उत्पन्न करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैं एक भी निर्माण 7 भीतर करीब निकटता में कई microfluidic नेटवर्क का उत्पादन।
इन सीमाओं से कुछ दूर करने के लिए, हम एक छवि निर्देशित, लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट तकनीक है कि biomimetic की repeatable निर्माण, श्रेणीबद्ध microfluidic नेटवर्क है कि इन विवो microvasculature की वास्तुकला पुनरावृत्ति की अनुमति देता है विकसित की है। ऐसा करने के लिए, एक 790 एनएम, 140 femtosecond (एफएस) स्पंदित लेजर 80 मेगाहर्ट्ज पर काम कर रेखापुंज-स्कैन रहा हैn एक हाइड्रोजेल भीतर 3 डी स्थानों वांछित है, के रूप में विवो वाहिका की छवियों से परिभाषित किया। हम अटकलें के रूप में पानी फैलता 20 कि गिरावट प्रक्रिया लेजर प्रेरित ऑप्टिकल पानी के एवज में प्लाज्मा गठन पानी के बाद तेजी से विस्तार thermoelastic हाइड्रोजेल के स्थानीय गिरावट टूटने,,, और के माध्यम से चल रही है। इस तंत्र प्रोटीन आधारित हाइड्रोजेल 21-24 की लेजर आधारित गिरावट से थोड़ा भिन्न होता है। PEGDA है, जो एक कम multiphoton पार अनुभाग के विपरीत, प्रोटीन अक्सर एक बड़े multiphoton पार अनुभाग है और इसलिए एक multiphoton अवशोषण प्रेरित रासायनिक टूटना 23 के माध्यम से अपमानित कर रहे हैं। छवि निर्देशित microfluidic नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए, लेजर शटर की छवि व्युत्पन्न आभासी मास्क, जो ब्याज 9 के क्षेत्रों है कि microfluidic वास्तुकला को परिभाषित की पच्चीकारी से मिलकर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम 3 डी संवहनी व्युत्पन्न biomimetic microfluid के निर्माण की क्षमता का प्रदर्शन कियाआईसी नेटवर्क है, जो करने के लिए इन विवो वाहिका के घने और कपटपूर्ण वास्तुकला पुनरावृत्ति, क्रम में स्थानीय स्तर पर गिरावट के दौरान दिया ऊर्जा की मात्रा बदलकर हाइड्रोजेल के porosity नियंत्रित करते हैं। हम भी दो स्वतंत्र microfluidic नेटवर्क है कि करीब निकटता (15 माइक्रोन) में एक दूसरे से लिपटना लेकिन सीधे कनेक्ट कभी नहीं 7 उत्पन्न करने में सक्षम किया गया है। हम यह भी Arginine ग्लाइसिन Aspartic एसिड-सेरीन (RGDS), endothelial सेल आसंजन और लुमेन गठन 7 बढ़ावा देने के लिए इंटीग्रिन ligating पेप्टाइड अनुक्रम के साथ पोस्ट गिरावट functionalization के माध्यम से लेजर अपमानित microchannels endothelialize करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है।
इस प्रोटोकॉल के साथ, PEGDA हाइड्रोजेल में जटिल microfluidic नेटवर्क की पीढ़ी के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप कई विश्वविद्यालय परिसरों पर सुलभ का उपयोग कर छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के माध्यम से संभव बनाया है। गिरावट प्रक्रिया डिजिटल, आभासी मास्क द्वारा निर्देशित है के रूप में, इस Fabrication तकनीक आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इसके उपयोग की अनुमति के microfluidic नेटवर्क के रचनात्मक डिजाइन के लिए उत्तरदायी है। हम आशा करते हैं कि यहाँ वर्णित विधि जैविक प्रक्रियाओं परिवहन मॉडलिंग दवा परिवहन 2 में महत्वपूर्ण नकल करने में सक्षम biomimetic अंग और मानव-ऑन-ए-चिप उपकरणों को डिजाइन करने में सबसे लाभप्रद होगा। इस निर्माण तकनीक को भी कैंसर मेटास्टेसिस 5,6 और रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल 25 सहित इन विट्रो रोग मॉडल, की पीढ़ी के लिए ब्याज की हो सकती है। लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट पहले से neuronal परिणाम 21-23 के मार्गदर्शन के लिए पटरियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस तकनीक की छवि को निर्देशित विस्तार उपयोगकर्ता परिभाषित 3 डी स्थानिक व्यवस्था में कोशिकाओं की स्थिति के लिए उन्नत ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों में उपयोगी साबित हो सकता है।
माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के मानक कार्यों अधिभावी छवि निर्देशित, लेजर आधारित गिरावट के लिए आभासी मास्क के उपयोग को सक्षम करने के लिए गंभीर, माइक्रोस्कोप मैक्रो सेटअप और ध्यान से चालाकी से किया जाना चाहिए। कैसे माइक्रोस्कोप मैक्रो के साथ खुर्दबीन सॉफ्टवेयर इंटरफेस कभी कभी counterintuitive हो सकता है, और बहुत प्रयास के दोनों कार्यक्रमों में इष्टतम सेटिंग्स का निर्धारण करने के लिए इस विधि को विकसित करने में निवेश किया गया था। बुनियादी लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन उपयोग की एक सामान्य समझ की सिफारिश की है, विशेष रूप से "स्टेज" और लग रहा है और सही ढंग से हाइड्रोजेल स्थिति एक्स, वाई, जेड और आयामों में, लेजर आधारित गिरावट प्रयास करने से पहले के लिए "फोकस" खिड़कियों के साथ। इसके अतिरिक्त, एक इनलेट चैनल के निर्माण के प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है; निलंबित फ्लोरोसेंट प्रजातियों सफल इमेजिंग और नेटवर्क लक्षण वर्णन के लिए सिस्टम microfluidic प्रवेश करने में सक्षम होना चाहिए। यह ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल एक विशिष्ट करने के लिए लागू होता है महत्वपूर्ण है लेजरconfocal खुर्दबीन स्कैनिंग एक विशिष्ट femtosecond स्पंदित लेजर के साथ विन्यस्त, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के विशिष्ट संस्करणों और माइक्रोस्कोप मैक्रो (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की सूची में विवरण देखें) चल रहा है। हमें पता चला है कि माइक्रोस्कोप मैक्रो के नए संस्करणों के लिए आवश्यक नियंत्रण और कार्यक्षमता की छवि निर्देशित लेजर नियंत्रण के लिए आवश्यक की कमी है। अन्य माइक्रोस्कोप प्लेटफार्मों और स्पंदित लेजर स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल इस प्रणाली के लिए विशेष रूप से लागू होता है और मंच, लेजर स्रोत है, और सॉफ्टवेयर लागू के अनुसार संशोधन की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल भर सिद्धांतों अभी भी लागू है, लेकिन।
इस प्रोटोकॉल के लिए एक संभावित संशोधन हाइड्रोजेल संरचना को बदलने शामिल है। यहाँ, हम 5 डब्ल्यूटी%, 3.4 केडीए PEGDA हाइड्रोजेल, उपयोग किया लेकिन (microfluidic नेटवर्क पीढ़ी से अलग उद्देश्यों के लिए) लेजर आधारित गिरावट लागू किया गया है PEGylated आतंच सहित दोनों कृत्रिम और प्राकृतिक हाइड्रोजेल, नीचा करने के लिएogen 21,22, रेशम प्रोटीन 23 हाइड्रोजेल, और कोलेजन 24। लेजर शक्ति, गति स्कैन, जेड स्लाइस के बीच रिक्ति, और repetitions की संख्या का समायोजन इष्टतम मापदंडों का निर्धारण अन्य हाइड्रोजेल योगों में microfluidic नेटवर्क के निर्माण के लिए में सहायता करेगा।
तकनीक का एक वर्तमान सीमा हाइड्रोजेल उस समय के एक व्यवहार्य राशि में अपमानित किया जा सकता की कुल मात्रा है। खुले रिक्तियों या हाइड्रोजेल भीतर microfluidic सुविधाओं बनाने के लिए, लेजर समय ध्यान केन्द्रित होना चाहिए या इसके बाद के संस्करण 8.96 μs / पिक्सेल (या 0.021 माइक्रोन के एक लेजर स्कैन गति / μs) जब 37.7 न्यू जर्सी / माइक्रोन 2 के एक लेजर प्रभाव का उपयोग कर। इन सेटिंग्स के साथ, यह 1.4 एच (चित्र 1 में देखा है) लेता है एक 0.014 मिमी 3 मात्रा के भीतर जहाजों नीचा करने के लिए। 4.48 μs / पिक्सेल या नीचे के एक लेजर ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग, ऊर्जा को जन्म दिया हाइड्रोजेल यहां इस्तेमाल तैयार करने का पूरा गिरावट के लिए पर्याप्त नहीं है। एक अलग हाइड्रोजेल को लागूरचना इस सीमा को पार कर सकता है। Photolabile जैल कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील घटकों 34-36 या हाइड्रोजेल है कि बड़े multiphoton पार वर्गों 21-24 में होते हैं के उपयोग के लिए अच्छा विकल्प है कि कम ऊर्जा के उपयोग को सक्षम होता है और तेजी से गिरावट में परिणाम होता है। आयामी सीमाओं के संबंध में, सुविधाओं 1.5 मिमी हाइड्रोजेल 7 में गहरी करने के लिए निर्मित किया गया है। गहराई प्राप्त उद्देश्य के काम दूरी के एक समारोह है और अल्ट्रा लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्यों में vivo इमेजिंग के लिए अनुकूलित का उपयोग कर बढ़ाया जा सकता है। छोटी से छोटी मापा चैनल 7 का उपयोग कर एक 20X (NA1.0) पानी विसर्जन उद्देश्य 3.3 माइक्रोन की चौड़ाई और 8.9 माइक्रोन की गहराई है, जो चित्रा 1 में उत्पन्न सबसे छोटे चैनलों के आकार के साथ बराबर है था बनाया। दूसरी प्रयोगशालाओं के निचले NA उद्देश्यों 21,23,24 का इस्तेमाल किया है, हम आशा करते हैं कि छोटे सुविधाओं के साथ microfluidic नेटवर्क का उपयोग कर उच्च उत्पन्न किया जा सकताएक कम दूरी काम की कीमत पर एर NA उद्देश्यों। अंत में, हालांकि, तकनीक का संकल्प लेजर बीम ध्यान केंद्रित की बात फैल समारोह के एक समारोह है, लेजर स्कैनिंग गुण, ऊर्जा की राशि लेजर द्वारा दिया, और सामग्री की लेजर अवशोषण गुण अपमानित किया जा रहा।
इसके अलावा, लेजर गुण (गति, प्रभाव, आभासी मास्क, और repetitions की संख्या के बीच अंतर) हाइड्रोजेल गुणों के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए (Crosslink घनत्व, macromer / मोनोमर आणविक वजन, वजन प्रतिशत, और हाइड्रोजेल के प्रकार: प्रोटीन आधारित बनाम सिंथेटिक ), इन स्वाभाविक लेजर और इस तरह की प्रक्रिया के अंतिम संकल्प के साथ बातचीत बदल जाएगा। के रूप में दिया ऊर्जा का भी इस्तेमाल किया उद्देश्य से प्रभावित होता है, जब अतिरिक्त अनुकूलन के उद्देश्यों के बीच स्विच करने की आवश्यकता है। लागत शामिल करने के लिए सम्मान के साथ, एक स्पंदित लेजर के साथ एक खुर्दबीन के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और जबकि कई अलग अलग ओर्बtives इस्तेमाल किया जा सकता है, एक उच्च एनए और लंबे समय तक काम दूरी (vivo इमेजिंग के लिए) के साथ उन लोगों के लिए महंगा हो सकता है।
ऊपर और प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत परे है, इस तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न microfluidic नेटवर्क भी endothelial सेल आसंजन और लुमेन गठन 7 प्रेरित करने के लिए सेल चिपकने वाला पेप्टाइड्स के बाद चैनल के निर्माण के साथ क्रियाशील किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, थोक माल 9 पूर्व में सेल सड़ सकने पेप्टाइड दृश्यों का समावेश गिरावट चैनल करने में और हाइड्रोजेल के माध्यम से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है। हाइड्रोजेल भीतर microfluidic नेटवर्क के निरंतर तरलीकरण के लिए, हाइड्रोजेल, बड़ा fluidic उपकरणों या housings में photopolymerized जा सकती है के रूप में आंकड़े 2 और 3 से 7 में प्रदर्शन किया।
Vasculogenic या एन्जियोजेनिक आत्म विधानसभा 8-12 के माध्यम से संवहनी नेटवर्क की पीढ़ी VA प्रेरित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता हैएक अपेक्षाकृत बड़े हाइड्रोजेल मात्रा भर scularization। इस दृष्टिकोण perfusable fluidic नेटवर्क में यह परिणाम है, यह सीधे आकार, टेढ़ा-मेढ़ापन, घनत्व, और समग्र नेटवर्क वास्तुकला नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इस सीमा के कारण, प्रवाह प्रोफ़ाइल और वाहिका में कतरनी दरों प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, तकनीक microfabrication 13-16 नेटवर्क वास्तुकला पर सीधा नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन अक्सर छोटे, केशिका आकार चैनलों या घने नेटवर्क है कि इन विवो संवहनी वास्तुकला में नकल के निर्माण उत्पन्न करने के लिए अपनी असमर्थता द्वारा सीमित हैं। लेजर आधारित हाइड्रोजेल गिरावट यहाँ रेखांकित तकनीक नव microfluidic पीढ़ी के लिए repurposed किया गया है, इसके साथ ही, दोनों वास्तु नियंत्रण और 3 डी biomimetic microfluidic नेटवर्क है कि घनत्व, टेढ़ा-मेढ़ापन पुनरावृत्ति के सृजन को सक्षम करने से मौजूदा microfabrication के तरीकों के आकार के आधार पर सीमाओं पर काबू आकार सीमा है, और समग्र architecturइन विवो वाहिका के ई। इसके अलावा, कई fluidic नेटवर्क के लिए एक एकल हाइड्रोजेल में उत्पन्न किया जा सकता है, अंतर-नेटवर्क परिवहन 7 के अध्ययन की अनुमति। ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों है कि और अधिक बारीकी से इन विट्रो में विवो परिवहन प्रक्रियाओं में दोहराने के लिए प्रयास करते हैं के लिए, अत्यधिक सुलझाया हाइड्रोजेल एम्बेडेड microfluidic यहाँ रेखांकित नेटवर्क अच्छी तरह से अनुकूल हैं। हम आशा करते हैं कि इस प्रोटोकॉल ऊतक निर्माणों को विकसित करने में उपयोगी हो जाएगा कि दवा स्क्रीनिंग उपकरणों के रूप में और इन विट्रो रोग मॉडल में उपयोग के लिए और अधिक सही नकल विवो परिवहन।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |