एकल कोशिका के स्तर पर cavitation बुलबुला (s) सेल इंटरेक्शन और उसके एवज में Bioeffects जांच के लिए सतह patterning के साथ एक microfluidic प्रणाली
Summary
A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.
Abstract
इस पांडुलिपि में, हम पहली बार एक microfluidic चिप के निर्माण के प्रोटोकॉल, सोने डॉट्स और एक ही गिलास सब्सट्रेट, ठीक है कि मिलकर बुलबुले और अलग-अलग स्थानों पर अच्छी तरह से परिभाषित और आकार के साथ पास के नमूनों की कोशिकाओं की पीढ़ी को नियंत्रित पर fibronectin लेपित क्षेत्रों के साथ वर्णन है। हम तो दो स्पंदित कुछ-microsecond समय की देरी के साथ सोने के लिए डॉट्स की एक जोड़ी रोशन लेसरों का उपयोग करके मिलकर बुलबुले की पीढ़ी का प्रदर्शन। हम उच्च गति इमेजिंग द्वारा बुलबुला बुलबुला संपर्क और जेट गठन कल्पना और कण छवि velocimetry (PIV) का उपयोग परिणामी प्रवाह क्षेत्र की विशेषताएँ। अंत में, हम macromolecule तेज के साथ कोशिका झिल्ली poration, स्थानीय झिल्ली विरूपण जुड़ी इंटीग्रिन बाध्यकारी मोतियों की विस्थापन के द्वारा निर्धारित किया, और ratiometric इमेजिंग से intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया सहित एकल कोशिका विश्लेषण के लिए इस तकनीक का कुछ अनुप्रयोगों प्रस्तुत करते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि एक तेजी से और दिशात्मक jetting प्रवाह समर्थक हैमिलकर बुलबुला बातचीत है, जो एक सेल करीब निकटता में उगाया की सतह पर एक बेहद स्थानीय कतरनी तनाव लागू कर सकते हैं द्वारा पेश। इसके अलावा, विभिन्न bioeffects मिलकर बुलबुले के लिए सेल से गतिरोध दूरी का समायोजन करके jetting प्रवाह की ताकत फेरबदल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है।
Introduction
वहाँ एक से बढ़ मान्यता है कि सेलुलर विविधता, जीन, प्रोटीन, और चयापचयों के स्टोकेस्टिक अभिव्यक्ति से उत्पन्न होने वाली है, एक बड़ी सेल की आबादी के भीतर मौजूद है और जीव विज्ञान में एक मौलिक सिद्धांत के रूप में कार्य करता है सेल अनुकूलन और विकास 1 के लिए अनुमति देने के लिए है। इसलिए, यह अक्सर गलत और जनसंख्या के आधार पर थोक माप का उपयोग करने के लिए अलग-अलग कक्षों और उनकी बातचीत के समारोह को समझने के लिए अविश्वसनीय है। एकल कोशिका विश्लेषण के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास और जैविक औषधीय अनुसंधान के क्षेत्र में उच्च ब्याज का इसलिए है, और उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बेहतर कुंजी संकेत दे रास्ते और स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और कैंसर के उपचार में 2-4 प्रक्रियाओं को समझने के लिए। हाल के वर्षों में, microfluidic प्लेटफार्मों के उद्भव बहुत एकल कोशिका विश्लेषण, जहां स्थिति, उपचार, और व्यक्ति की कोशिकाओं से प्रतिक्रिया के अवलोकन के उपन्यास विश्लेषणात्मक रणनीतियों 5 के साथ प्रदर्शन किया गया है मदद की है।
Cavitation निभाता उच्च तीव्रता से कैंसर के इलाज सहित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विविध रेंज में एक महत्वपूर्ण भूमिका ध्यान केंद्रित अल्ट्रासाउंड (HIFU) 6, सदमे की लहर lithotripsy से गुर्दे की पथरी के गैर इनवेसिव विखंडन (SWL) 7, दवा या जीन डिलीवरी sonoporation 8, और hydrodynamic बुलबुला cavitation 9,10 द्वारा कोशिकाओं या ऊतकों की हाल ही में सूचना दी विनाश से। इस के बावजूद, cavitation बुलबुला (s) जैविक ऊतक कोशिकाओं और के साथ बातचीत के गतिशील प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से नहीं समझा गया है। यह अल्ट्रासाउंड, सदमे तरंगों, और स्थानीय हाइड्रोलिक दबाव द्वारा उत्पादित cavitation दीक्षा और बुलबुला गतिशीलता में randomness की वजह से है; इसके अलावा, वहाँ विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर, जैविक कोशिकाओं के स्वाभाविक जटिल और तेजी से प्रतिक्रिया को हल करने की तकनीक को सक्षम करने की कमी है।
क्योंकि इन चुनौतियों में से है, यह आश्चर्य की बात नहीं है बहुत कुछ अध्ययनों मधुमक्खी है किn अच्छी तरह से नियंत्रित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत बुलबुला सेल बातचीत की जांच को सूचना दी। उदाहरण के लिए, व्यक्ति की कोशिकाओं की झिल्ली poration निलंबन 11 में फंस रहे हैं और मानव लाल रक्त कोशिकाओं को 12 साल की आवेगी बड़ी विकृति microfluidic चैनलों में लेजर जनित एक बुलबुले का उपयोग प्रदर्शन किया गया है। बाद तकनीक, तथापि, केवल बहुत छोटे विरूपण नाभिक 13 की मौजूदगी की वजह से कोशिकाओं में उत्पादन कर सकते हैं। इसके अलावा, यह जब निलंबन कोशिकाओं के इलाज में नीचे की ओर bioeffects नजर रखने के के लिए मुश्किल है। अन्य अध्ययनों में, झिल्ली poration और / या एकल पक्षपाती कोशिकाओं में intracellular कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के उत्पादन के लिए एक सेल बाध्य microbubble (या अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट) के अल्ट्रासाउंड उत्तेजना 8 सूचित किया गया है। एकल पक्षपाती कोशिकाओं की झिल्ली poration भी एक पतली परत तरल में लेजर जनित मिलकर बुलबुले का उपयोग कर प्रकाश को अवशोषित Trypan नीले समाधान 14 से युक्त द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, याmicrosecond लेजर दालों microchambers 15 में एक ऑप्टिकली अवशोषित सब्सट्रेट के माध्यम से irradiating द्वारा उत्पन्न एक oscillating गैस बुलबुला द्वारा। जब तुलना में, ऑप्टिकली अवशोषित सब्सट्रेट क्योंकि कोशिकाओं को विषाक्त उत्तरार्द्ध है लेजर को अवशोषित Trypan नीले समाधान के ऊपर एक फायदा है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, लेजर जनित बुलबुले ध्वनिक उत्साहित बुलबुले से बुलबुला आकार और स्थान के संदर्भ में अधिक चलाया हुआ है। फिर भी, इन सभी पिछले अध्ययनों में, सेल आकार, अभिविन्यास, और आसंजन की स्थिति नियंत्रित नहीं कर रहे थे, जो काफी हद तक सेल प्रतिक्रिया और यांत्रिक तनाव 16 द्वारा उत्पादित bioeffects प्रभावित कर सकते हैं।
पिछले अध्ययनों में इन खामियों को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में बुलबुला पीढ़ी, सेल patterning, बुलबुला बुलबुला सेल बातचीत, और वास्तविक समय microfabrication techn का एक अनूठा संयोजन का उपयोग करके निर्माण एक microfluidic चिप में सेल प्रतिक्रिया की bioassays के लिए एक प्रायोगिक प्रणाली विकसित की हैiques। तीन मुख्य विशेषताएं है कि क्षेत्र में दूसरों से हमारे प्रायोगिक प्रणाली भेद हैं: 1) माइक्रोन आकार गिलास सब्सट्रेट पर सोने डॉट्स की patterning बुलबुला पीढ़ी 17 के लिए स्थानीय लेजर अवशोषण सक्षम करने के लिए; 2) एक ही सब्सट्रेट पर कोशिका आसंजन के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की माइक्रोन आकार द्वीपों के patterning दोनों स्थान और व्यक्ति की कोशिकाओं की ज्यामिति को नियंत्रित करने के लिए; और 3) एक अर्ध-2 डी अंतरिक्ष के लिए 3 डी से बुलबुला बुलबुला सेल बातचीत डोमेन के आयाम के संपीड़न बुलबुला बुलबुला बातचीत के विमान में दृश्य की सुविधा के लिए, प्रवाह क्षेत्र, सेल विरूपण, और bioeffects jetting, सभी में कब्जा एक सुव्यवस्थित इमेजिंग अनुक्रम (चित्रा -1)।
चित्रा 1: microfluidic चिप और विभिन्न परीक्षणों की schematics। एक) चैनल के साथ एक इकट्ठे microfluidic चिप नीले रंग की स्याही से भर दृश्य के लिए। ख) नमूनों कोशिकाओं और सोने डॉट्स के साथ microfluidic चिप के अंदर एक क्षेत्र (निकटता में दो स्वर्ण डॉट्स के बीच की दूरी 40 सुक्ष्ममापी है)। काम इकाइयों में से कई जोड़े के एक चैनल में व्यवस्थित किया जा सकता है। ग) सोने डॉट्स की एक जोड़ी और एक हेला सेल सेल patterning क्षेत्र से पालन से मिलकर एक ही काम इकाई के ऊपर बंद छवि। घ) डिवाइस ऑपरेशन के योजनाबद्ध। एक एकल कोशिका का पालन करता है और fibronectin के साथ लेपित "एच" के आकार का द्वीप पर फैलता है। Cavitation बुलबुले (मिलकर बुलबुला) विरोधी चरण दोलन के साथ की एक जोड़ी (चित्रा -4 ए देखें) सोने डॉट्स पर स्पंदित लेजर बीम रोशन, एक तेजी और स्थानीय जेट पास के लक्ष्य सेल की ओर बढ़ने की पीढ़ी के लिए अग्रणी द्वारा उत्पादित कर रहे हैं। सेल, विकृत किया जा सकता है macromolecular तेज के लिए porated, और / या एक कैल्शियम प्रतिक्रिया के साथ प्रेरित, मिलकर बुलबुले के लिए सेल का गतिरोध दूरी (एस डी) पर निर्भर करता है।च = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस मंच को आगे प्रतिदीप्ति assays और क्रियाशील मोती cavitation प्रेरित bioeffects के लिए कोशिका की सतह से जुड़ी साथ जोड़ा जा सकता है। विशेष रूप से, इस मंच एकल कोशिका के स्तर पर विश्वसनीय और मात्रात्मक assays के लिए रास्ता खुल जाता है। अब तक, हम मिलकर बुलबुला प्रेरित कोशिका झिल्ली विरूपण, सेल poration और intracellular तेज, व्यवहार्यता, apoptosis, और intracellular कैल्शियम प्रतिक्रिया के विश्लेषण के लिए डिवाइस का इस्तेमाल किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम चिप निर्माण की प्रक्रिया और ऊपर वर्णित विभिन्न bioeffects का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है। इसके अलावा, चिप का संचालन भी वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल कोशिका विश्लेषण, लाइव सेल इमेजिंग के साथ संयोजन में, बहुत ऐसी phenotype के विकास और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 23 के रूप में व्यक्तिगत कोशिकाओं में गतिशील और अक्सर चर प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.
Materials
| Reagent/Materials | |||
| 75x38mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4×4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS(1X) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
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