Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula
Summary
A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.
Abstract
In questo manoscritto, abbiamo prima descriviamo il protocollo fabbricazione di un chip microfluidico, con punti d'oro e regioni fibronectina rivestite sullo stesso substrato di vetro, che controlla appunto la generazione di bolle tandem e cellule individuali modellata nelle vicinanze con sedi e forme ben definite. Abbiamo poi dimostrare la generazione di bolle tandem utilizzando due laser pulsati illuminanti un paio di punti d'oro con un ritardo di tempo alcuni microsecondi. Visualizziamo l'interazione bolla-bolla e la formazione di jet da immagini ad alta velocità e caratterizzano il campo di moto risultante utilizzando l'immagine di particelle velocimetria (PIV). Infine, vi presentiamo alcune applicazioni di questa tecnica per l'analisi singola cellula, tra cui poration cella a membrana con l'assorbimento macromolecola, deformazioni della membrana localizzata determinato dagli spostamenti di perline integrine vincolante attaccati, e la risposta di calcio intracellulare dalle immagini raziometrico. I nostri risultati mostrano che un flusso di getto veloce e direzionale è proprodotta dall'interazione bolla tandem, che può imporre una sollecitazione di taglio altamente localizzata sulla superficie di una cellula coltivata in prossimità. Inoltre, diversi effetti biologici possono essere indotti alterando la forza del flusso di getto regolando la distanza standoff dalla cella alle bolle tandem.
Introduction
Vi è una crescente consapevolezza che eterogeneità cellulare, derivanti dall'espressione stocastico di geni, proteine e metaboliti, esiste all'interno di una vasta popolazione cellulare e serve come un principio fondamentale in biologia per consentire l'adattamento delle cellule ed evoluzione 1. Pertanto, è spesso imprecisi e inaffidabili utilizzare misurazioni di massa di popolazione comprendere la funzione delle singole cellule e le loro interazioni. Lo sviluppo di nuove tecnologie per l'analisi singola cellula è pertanto di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, e può essere utilizzato, ad esempio, per meglio comprendere le vie di segnalazione e processi chiave in biologia delle cellule staminali e la terapia del cancro 2-4. Negli ultimi anni, l'emergere di piattaforme microfluidici ha notevolmente facilitato l'analisi singola cellula, in cui il posizionamento, il trattamento, e l'osservazione della risposta da singole cellule sono state eseguite con strategie analitiche innovative 5.
La cavitazione svolge un ruolo importante in una vasta gamma di applicazioni biomediche, compreso il trattamento di tumori di High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) 6, la frammentazione non invasivo di calcoli renali con onda d'urto litotripsia (SWL) 7, droga o gene consegna da sonoporazione 8, e la distruzione recentemente riportato di cellule o tessuti da idrodinamica 9,10 bolla di cavitazione. Nonostante ciò, i processi dinamici della bolla di cavitazione (s) interazioni con tessuti e le cellule biologiche non sono state ben comprese. Ciò è dovuto alla casualità in cavitazione iniziazione e bolle dinamiche prodotte dagli ultrasuoni, onde d'urto, e la pressione idraulica locale; Inoltre, vi è una mancanza di permettere tecniche per risolvere le risposte intrinsecamente complesse e veloci di cellule biologiche, in particolare a livello di singola cellula.
A causa di queste sfide, non è sorprendente che pochissimi studi hanno apen segnalato per indagare le interazioni bolla-cellula in condizioni sperimentali ben controllate. Ad esempio, poration membrana delle cellule individuali intrappolato in sospensione 11 e la grande deformazione impulsiva di globuli rossi umani 12 è stata dimostrata utilizzando laser generato singole bolle in canali microfluidica. Quest'ultima tecnica, tuttavia, può produrre solo molto piccola deformazione in cellule eucariotiche per la presenza del nucleo 13. Inoltre, è difficile controllare bioeffetti valle quando trattando le cellule in sospensione. In altri studi, gli ultrasuoni l'eccitazione di un (o mezzo di contrasto ecografico) microbolle cellule-bound per la produzione di membrane poration e / o risposte intracellulari di calcio in singole cellule aderenti stato segnalato 8. All'incorporazione membrana di singole cellule aderenti può essere prodotto utilizzando bolle tandem laser generato in un sottile strato liquido contenente Trypan blue soluzione che assorbe la luce 14, oda una bolla di gas oscillante generato da impulsi laser microsecondo che irradiano attraverso un substrato otticamente assorbente in microchambers 15. Rispetto, il substrato otticamente assorbente ha un vantaggio rispetto alla soluzione Trypan blu laser assorbente perché quest'ultimo è tossico per le cellule. Ancora più importante, le bolle laser generati sono più controllabili in termini di dimensioni e la posizione della bolla di bolle acusticamente eccitati. Tuttavia, in tutti questi studi precedenti, la forma delle cellule, l'orientamento e condizioni di aderenza non erano controllati, che possono influenzare sostanzialmente la risposta cellulare e effetti biologici prodotti dalle sollecitazioni meccaniche 16.
Per ovviare a questi inconvenienti in studi precedenti, abbiamo recentemente sviluppato un sistema sperimentale per la generazione di bolle, patterning cella, interazioni bubble-bubble-cellulari, e in tempo reale biosaggi di risposta delle cellule in un chip microfluidico costruita utilizzando una combinazione unica di microfabbricazione tecniques. Tre caratteristiche principali che contraddistinguono il nostro sistema sperimentale da altri nel campo sono: 1) il patterning di punti d'oro micron dimensioni sul substrato di vetro per consentire l'assorbimento laser localizzato per la generazione della bolla 17; 2) il patterning di isole micron di dimensioni di matrice extracellulare (ECM) per l'adesione cellulare sullo stesso substrato di controllare sia la posizione e geometria delle singole celle; e 3) la compressione della dimensione del dominio di interazione bubble-bubble-cellulare da 3D a uno spazio quasi-2D per facilitare la visualizzazione nel piano di interazioni bolla bolle, getto campi di flusso, deformazioni cella, e bioeffetti, tutti catturati in una sequenza di immagini snella (Figura 1d).
Figura 1: Il chip microfluidica e schemi di saggi differenti. a) Un chip microfluidica assemblato con canali riempito con inchiostro blu per la visualizzazione. b) Una regione all'interno del chip microfluidico con celle motivi geometrici e punti d'oro (la distanza tra i due punti d'oro in prossimità è 40 micron). Molte coppie di unità di lavoro possono essere disposti in un canale. c) Immagine del primo piano di una singola unità di lavoro costituito da una coppia di punti d'oro e una cellula HeLa aderito alla regione cellula-patterning. d) Schema del funzionamento del dispositivo. Una singola cellula aderisce e si diffonde sulla "H" isola a forma rivestito con fibronectina. Un paio di bolle di cavitazione (bolle tandem) con oscillazione anti-fase viene prodotta illuminando raggi laser pulsati sui punti d'oro (vedi figura 4a), che porta alla generazione di un getto veloce e localizzato muovendo verso la cellula bersaglio vicina. La cella può essere deformata, porata per l'assorbimento macromolecolare, e / o stimolato con una risposta di calcio, a seconda della distanza distanziatore (S d) della cella alla bolla tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Questa piattaforma può essere ulteriormente combinato con saggi di fluorescenza e perline funzionalizzati attaccati alla superficie cellulare per bioeffetti cavitazione indotta. In particolare, questa piattaforma apre la strada a test affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l'analisi di tandem bolla indotta deformazione della membrana cellulare, poration cellulare e captazione intracellulare, la vitalità, apoptosi, e la risposta del calcio intracellulare. Nella seguente protocollo, si descrive il processo di fabbricazione di chip e la procedura per analizzare i vari effetti biologici sopra menzionati. Inoltre, sono anche descritti operazioni del chip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi cella singola, in combinazione con il live-cell imaging, ha notevolmente migliorato la nostra comprensione dei processi dinamici e spesso variabile in singole cellule, come lo sviluppo del fenotipo e la risposta immunitaria 23. In contrasto con la coltura cellulare convenzionale piatti o flaconi, sistemi microfluidici permettono un controllo preciso del microambiente, fino al livello di singola cellula, in tempo reale. Di conseguenza, i progressi nella tecnologia microfluidica e tecniche sono in gran …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.
Materials
| Reagent/Materials | |||
| 75x38mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4×4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS(1X) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
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