A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.
I dette manuskriptet, må vi først beskrive fabrikasjon protokoll av en microfluidic chip, med gullprikker og fibronektin-belagte områder på samme glasset underlaget, som nettopp styrer generasjon av tandem bobler og individuelle celler mønstrede nærheten med godt definerte steder og former. Vi viser genereringen av tandem-bobler ved hjelp av to pulsede lasere belyse et par av gull prikker med noen få mikrosekund-tidsforsinkelse. Vi visualiserer boble-boble samhandling og jet formasjon ved høy hastighet bildebehandling og karakterisere den resulterende strømningsfeltet ved hjelp av partikkel bilde velocimetry (PIV). Til slutt presenterer vi noen anvendelser av denne teknikken for enkelt celle analyse, inkludert cellemembranen poration med makromolekyl opptak, lokalisert membran deformasjon bestemmes av forskyvninger av vedlagte integrin-bindende perler, og intracellulær kalsium respons fra ratiometrisk bildebehandling. Våre resultater viser at en rask og retningsstrålestrømmen er prosert ved tandem boblen interaksjonen, som kan pålegge en sterkt lokalisert skjærspenning på overflaten av en celle dyrket i umiddelbar nærhet. Videre kan forskjellige bioeffekter bli indusert ved å endre styrken av høytrykks-spylestrømningen ved å justere veggavstanden fra cellen til tandem-bobler.
Det er en økende erkjennelse av at cellulær heterogenitet, som oppstår fra den stokastiske ekspresjon av gener, proteiner og metabolitter, eksisterer i en stor cellepopulasjon og tjener som et grunnleggende prinsipp i biologi for at cellene skulle tilpasning og evolusjon 1. Derfor er det ofte unøyaktig og upålitelig å benytte populasjonsbaserte massemålinger for å forstå funksjonen av de enkelte celler og deres vekselvirkninger. Utvikle ny teknologi for enkelt-celle analyse er derfor av stor interesse for biologisk og farmakologisk forskning, og kan anvendes, for eksempel for å bedre forstå de viktigste signalveier og prosesser i stamcellebiologi og cancerterapi 2-4. I de senere år har fremveksten av microfluidic plattformer meget lettere enkelt-celle-analyse, hvor posisjoneringen, behandling og observasjon av responsen fra individuelle celler er blitt utført med nye analytiske strategier 5.
Kavitasjon spiller en viktig rolle i et mangfoldig spekter av biomedisinske applikasjoner, inkludert behandling av kreft ved høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU) 6, non-invasiv fragmentering av nyrestein av sjokkbølgen lithotripsy (SWL) 7, narkotika eller genet levering ved sonoporation 8, og den nylig rapportert ødeleggelse av celler eller vev ved å hydrodynamisk kavitasjon boble 9,10. Til tross for dette er de dynamiske prosesser av kavitasjon boble (e) interaksjoner med biologisk vev og celler er ikke godt forstått. Dette skyldes tilfeldig i kavitasjon innvielses og boble dynamikk produsert av ultralyd, sjokkbølger, og lokale hydraulisk trykk; dessuten er det en mangel på slik at teknikker for å løse de iboende komplekse og rask respons av biologiske celler, spesielt på enkeltcellenivå.
På grunn av disse utfordringene, er det ikke overraskende at svært få studier har been rapportert å undersøke boble-celle interaksjoner under godt kontrollerte eksperimentelle forhold. For eksempel, membran poration av individuelle celler fanget i suspensjon 11 og impulsive store deformasjoner av menneskelige røde blodceller 12 er påvist ved hjelp av lasergenererte enkeltbobler i microfluidic kanaler. Den sistnevnte teknikk, kan imidlertid bare fremstille meget liten deformasjon i eukaryote celler på grunn av tilstedeværelsen av kjernen 13. Dessuten er det vanskelig å overvåke nedstrøms bioeffekter ved behandling av celler i suspensjon. I andre studier har ultralyd eksitasjon av en celle-bundet med mikrobobler (eller ultralydkontrastmiddel) for fremstilling av membranen poration og / eller intracellulære kalsium-respons i enkelt adherente celler er rapportert 8. Membran poration av enkle adherente celler kan også fremstilles ved hjelp av lasergenererte tandem bobler i et tynt væskelag som inneholder lysabsorberende Trypan blå løsning 14, ellerav en oscillerende gassboble som genereres av mikro laserpulser bestråling gjennom et optisk absorberende substrat i microchambers 15. Når sammenlignet, har det optisk absorberende substrat en fordel i forhold til laser-absorberende Trypan blå løsning, fordi den sistnevnte er toksisk for cellene. Enda viktigere, lasergenererte bobler er mer kontrollerbar i form av boblestørrelse og plassering enn akustisk glade bobler. Ikke desto mindre, i alle disse tidligere studier, celle form, orientering og adhesjon betingelser ble ikke kontrollert, noe som i vesentlig grad kan påvirke celleresponsen og bioeffekter produsert av mekaniske spenninger 16.
For å overvinne disse ulemper i tidligere undersøkelser, har vi nylig utviklet et forsøkssystem for bobledannelse, celle mønster, boble-boble-celleinteraksjoner, og sanntids-bioanalyser av cellerespons i et mikrofluidbrikken konstruert ved hjelp av en unik kombinasjon av microfabrication techniques. Tre viktigste funksjonene som skiller våre eksperimentelle system fra andre i feltet er: 1) fordelingen av mikron-størrelse gull prikker på glasset underlaget å aktivere lokalisert laser absorpsjon for bobledannelse 17; 2) mønstring av mikronstørrelse øyene ekstracellulære matriks (ECM) for celle adhesjon på det samme substratet til å styre både plasseringen og formen av de enkelte celler; og 3) komprimering av den dimensjon av boble-bubble-celle-interaksjon domene fra 3d til en kvasi-2D plass for å forenkle i planet visualisering av boble-boble interaksjoner, spyling strømningsfelt, celle deformasjon, og bioeffekter, alt tatt i en strømlinjeformet bildesekvens (figur 1d).
Figur 1: mikrofluid brikken og skjematisk av ulike analyser. a) En montert microfluidic chip med kanaler fylt med blått blekk for visualisering. b) Et område inne i mikrofluid brikke med mønstrede celler og gull prikker (avstanden mellom de to gull prikkene i nærhet er 40 um). Mange par av arbeidsenheter kan være anordnet i en kanal. c) Close-up bilde av en enkelt arbeidsenhet bestående av et par gullprikker og en HeLa celle levd opp til celle-mønster regionen. d) Skjematisk av driften. En enkelt celle holder og sprer seg på "H" -formet øy belagt med fibronektin. Et par av kavitasjonsbobler (tandem skum) med anti-fase oscillasjonen blir produsert ved å belyse pulsert laserstråler på gull prikkene (se figur 4a), som fører til generering av en rask og lokalisert stråle beveger seg mot målcellen i nærheten. Cellen kan være deformert, porated for makromolekylære opptak, og / eller stimulert med en kalsium-respons, avhengig av veggavstanden (S d) i cellen til tandem boble.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne plattformen kan videre kombineres med fluorescensanalyser og funksjonaliserte perler festet til celleoverflaten for kavitasjon-indusert bioeffekter. Spesielt, åpner denne plattformen veien for pålitelig og kvantifiserbare analyser på enkeltcellenivå. Inntil nå har vi benyttet anordning for analyse av tandem boble-indusert cellemembran deformasjon, celle poration og intracellulære opptaket, levedyktighet, apoptose, og intracellulær kalsiumrespons. I den etterfølgende protokoll beskriver vi prosessen for fremstilling brikken, og fremgangsmåten for å analysere de forskjellige bioeffekter nevnt ovenfor. Videre er driften av brikken også beskrevet.
Single-celle analyse, i kombinasjon med levende celle bildebehandling, har kraftig forbedret vår forståelse av de dynamiske og ofte variable prosesser i enkeltceller, som fenotype utvikling og immunrespons 23. I motsetning til den konvensjonelle cellekultur i retter eller kolber, microfluidic systemer gjør nøyaktig styring av mikromiljøet, ned til enkeltcellenivå, i sann tid. Følgelig, fremskritt innen mikrofluidteknologi og teknikker har i stor grad forbedret gjennomstrømning og reproduserbarheten av…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.
Reagent/Materials | |||
75x38mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
Photomask | Photoplotstore | N/A | 4×4 Direct write mask |
MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
Paraffin film | HACH | 251764 | |
SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
DPBS(1X) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
Carboxylate Microspheres 1.00μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
Carboxylate Microspheres 2.00μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
Water bath | VWR | 1122s | |
Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
software | Zeiss | AxioVision | |
PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |