Summary

Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

Published: January 10, 2017
doi:

Summary

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Abstract

В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и ​​форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.

Introduction

Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции 1 клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в области биологии стволовых клеток и терапии рака 2-4. В последние годы, появление микрофлюидальных платформ в значительной степени облегчает анализ одноклеточного, где позиционирование, лечение и наблюдение ответа от отдельных клеток были проведены с новыми аналитическими стратегиями 5.

Кавитация играет важную роль в разнообразных биомедицинских применений, в том числе при лечении злокачественных опухолей с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) 6, неинвазивный фрагментация камней в почках с помощью ударно – волновой литотрипсии (SWL) 7, лекарственное средство или ген доставки по sonoporation 8, а также недавно сообщили разрушения клеток или тканей с помощью гидродинамического кавитационного пузыря 9,10. Несмотря на это, не были хорошо изучены динамические процессы кавитационного пузырька (ами) взаимодействия с биологической ткани и клетки. Это происходит из-за хаотичности в инициировании и пузырьковых динамики кавитационных производства с помощью ультразвука, ударные волны, и локального гидравлического давления; Кроме того, существует недостаток стимулирующих методов для решения сложных по своей сути и быстрый отклик биологических клеток, особенно на уровне одной клетки.

Из-за этих проблем, это не удивительно, что очень небольшое число исследований было пчелап сообщили исследовать взаимодействия пузырьков клетки в хорошо контролируемых условиях эксперимента. Например, мембрана порации отдельных клеток в суспензии в ловушке 11 и импульсивный большая деформация человеческих красных кровяных клеток 12 были продемонстрированы с использованием лазерных сгенерированных одиночных пузырьков в микроканалов. Последний метод, однако, может производить только очень малую деформацию в эукариотических клетках , из – за наличия ядра 13. Кроме того, трудно контролировать вниз по течению биоэффектов при обработке клеток в суспензии. В других исследованиях, ультразвуковое возбуждение клеток переплете микропузырьков (или ультразвуковое контрастное вещество) для производства мембран порации и / или внутриклеточные реакции кальция в одиночных адгезивных клеток было сообщено 8. Мембрана порации отдельных адгезивных клеток , также могут быть получены при использовании генерируемое лазером пузырьков тандемные в тонком слое жидкости , содержащей светопоглощающий трипанового синего раствора 14, иликолеблющимся газового пузыря , генерируемого микросекунды лазерных импульсов , облучающих через оптически поглощающую подложку в микрокамеры 15. При сравнении оптически поглощающей подложке имеет преимущество по сравнению с лазерным поглощающие -ным раствором трипанового синего, поскольку последний является токсичным для клеток. Что еще более важно, лазерные генерируемые пузырьки более управляемым с точки зрения размера пузырьков и места, чем акустически возбужденных пузырьков. Тем не менее, во всех этих предыдущих исследованиях, форма клеток, ориентация и условия прилипания были не контролируется, что может существенно влиять на клеточный ответ и биоэффектов , полученные с помощью механических напряжений 16.

Для преодоления этих недостатков в предыдущих исследованиях, в последнее время мы разработали экспериментальную систему для образования пузырьков, клетки кучность, пузырь пузырь-клеточных взаимодействий, и в режиме реального времени биоэксперименты клеточного ответа в микрожидком чипа, построенного с использованием уникального сочетания микроструктур техничiques. Три основные черты , которые отличают нашу экспериментальную систему от других в области являются: 1) структурирование микронного размера золотых точек на стеклянной подложке , чтобы позволить локализованное поглощение лазера для образования пузырьков 17; 2) структурирование микронного размера островков внеклеточного матрикса (ЕСМ) для клеточной адгезии на той же подложке, чтобы контролировать как расположение и геометрию отдельных ячеек; и 3) сжатие размерности области взаимодействия пузырь пузырь-клеток из 3D в квази-2D пространства для облегчения в плоскости визуализации пузырьков пузыря взаимодействий, струйное поля течения, деформации клеток, и биоэффектов, все захваченные в один обтекаемый последовательность изображений (рис 1д).

Рисунок 1
Рисунок 1: Микрожидкостных чипа и схемы различных анализов. а) Собранный Микрожидкостных чип с каналами заполнены синими чернилами для визуализации. б) область внутри микрожидком чипа с узорчатыми клетками и золотыми точками (расстояние между двумя точками золота в непосредственной близости от 40 мкм). Многие пары рабочих блоков могут быть расположены в канале. с) Крупным планом изображение одного рабочего узла , состоящего из пары золотых точек и клетки HeLa прилипшего к области клеточной структуризации. d) Схема работы устройства. Одна ячейка придерживается и распространяется на "Н" -образного острова, покрытого фибронектина. Пара кавитационных пузырьков (тандем пузырь) с анти-фазовых колебаний производятся путем освещения импульсные лазерные лучи на золотых точек (рис 4а), что приводит к образованию быстро и локализованным струи движется в направлении клетки – мишени поблизости. Клетка может быть деформирован, porated для макромолекулярной поглощения, и / или стимулируются с ответом кальция, в зависимости от расстояния зазора , (S г) клетки на тандем – пузырь.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Эта платформа может быть дополнительно в сочетании с анализами флюоресценции и функционализированных бусинок, прикрепленных к поверхности клетки для кавитационных-индуцированной биоэффектов. В частности, эта платформа открывает путь для надежных и поддающихся количественной оценке анализов на уровне одной клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа тандемной пузыря-индуцированной деформации клеточных мембран, клеток порации и внутриклеточного поглощения, жизнеспособность, апоптоз и внутриклеточного кальция ответ. В следующем протоколе мы опишем процесс изготовления чипа и порядок анализа различных биоэффектов, упомянутых выше. Кроме того, также описаны операции чипа.

Protocol

1. микротехнологий Примечание: Все процедуры микротехнологий выполняются в чистом помещении. Хромированная маска предназначена до микротехнологий, смотри Рисунок 2. Рисунок 2: Схема…

Representative Results

Микрожидкостных платформа описана в этой работе, может быть использован для изучения пузыря пузырь взаимодействий и анализировать различные кавитационных индуцированных биоэффектов на уровне одной клетки. Здесь мы приведем несколько примеров, демонстрирующих раз?…

Discussion

Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа 23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, м…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.

Materials

Reagent/Materials
75x38mm Plain Microscope Slides Corning 2947-75X38
Acetone Sigma Aldrich, Co. 320110 ACS reagent, ≥99.5%
Isopropyl alcohol Sigma Aldrich, Co. W292907 ≥99.7%, FCC, FG
Sulfuric acid Sigma Aldrich, Co. 320501 ACS reagent, 95.0-98.0%
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich, Co. 216763 30 wt.% in H2O
Primer P-20 Microchem MCC Primer 80/20
NFR photoresist JSR NFR016D2
Photomask Photoplotstore N/A 4×4 Direct write mask
MF-319 Developer Shipley (Rohm and Haas) Microposit MF-319
1165 Photoresist Remover Dow Chemical, Co. DEM-10018073 1-methyl-2-pyrrolidinone based
S1813 photoresist Shipley (Rohm and Haas) S1813
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Paraffin film HACH 251764
SU-2025 photoresist Microchem SU-2025
PDMS Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Microbore Tubing Saint-Gobain PPL Corp. S-54-HL
Metal pins New England Small Tube NE-1300-01  Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long
HeLa cells Duke Cell Culture Facility (307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS(1X) buffer ThermoFisher Scientific 14190144
DMEM culture medium ThermoFisher Scientific 11995065
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher Scientific 33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1X) ThermoFisher Scientific 25200056
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P21493
Carboxylate Microspheres 1.00μm Polysciences, Inc 08226-15
Carboxylate Microspheres 2.00μm Polysciences, Inc 18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) ThermoFisher Scientific 22980
Sulfo-NHS Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) 24510
Peptite-2000 Advanced BioMatrix 5020-5MG
FITC Annexin V ThermoFisher Scientific A13199
Fura-2, AM ThermoFisher Scientific F1221
DMSO Sigma Aldrich, Co. D2650
F-127 invitrogen P6866 0.2 µm filtered (10% Solution in Water)
Reduced serum media  ThermoFisher Scientific 11058021
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Plasma asher Emitech K-1050X O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials
Mask aligner SUSS MicroTec  Karl Suss MA6/BA6
E-beam evaporator CHA Industries CHA Industries Solution E-Beam
RIE Trion Technology  Trion Technology Phantom II (oxide/ nitride/ polymer) etching
Stereoscope AmScope American Scope SM-4TZ-FRL Stereo Microscope
Syringe pump Chemyx Inc NanoJet
Cell culture incubator NuAire AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator
Biological Safety Cabinets NuAire NU-425-400
Water bath VWR 1122s
Centrifuge IEC Centra CL2
Microscope Zeiss Axio Observer Z1
Nd:YAG laser  (laser 1) New Wave Research Tempest
Nd:YAG laser  (laser 2) New Wave Research Orion
Delay generator Berkeley Nucleonics  BNC 565-8c
Flash lamp Dyna-Lite ML1000 fiber-coupled flashtube
high speed camera DRS Hadland  Imacon 200
high speed  camera Shimadzu HPV-X
high speed camera Vision Research Phantom V7.3
PIV software LaVision DaVis 7.2
camera Zeiss AxioCam MRc 5
software Zeiss AxioVision
PTI system Horiba S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software Horiba Easy Ratio Pro 2 version 2.3.125.86
63× objective Zeiss LD Plan Neofluar

References

  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in ‘omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  4. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
  5. Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
  6. Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
  7. Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
  8. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  9. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
  10. Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
  11. Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  12. Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
  13. Li, F., M, M., Ohl, C. .. D. .. Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
  14. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
  15. Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
  16. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  17. Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
  18. Yang, C. . Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , (2013).
  19. Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
  20. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  21. Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
  22. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
  23. Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  24. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
  25. Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
  26. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
  27. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
  28. van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
  31. Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).

Play Video

Cite This Article
Li, F., Yuan, F., Sankin, G., Yang, C., Zhong, P. A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)–Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level. J. Vis. Exp. (119), e55106, doi:10.3791/55106 (2017).

View Video