A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.
В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.
Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции 1 клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в области биологии стволовых клеток и терапии рака 2-4. В последние годы, появление микрофлюидальных платформ в значительной степени облегчает анализ одноклеточного, где позиционирование, лечение и наблюдение ответа от отдельных клеток были проведены с новыми аналитическими стратегиями 5.
Кавитация играет важную роль в разнообразных биомедицинских применений, в том числе при лечении злокачественных опухолей с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) 6, неинвазивный фрагментация камней в почках с помощью ударно – волновой литотрипсии (SWL) 7, лекарственное средство или ген доставки по sonoporation 8, а также недавно сообщили разрушения клеток или тканей с помощью гидродинамического кавитационного пузыря 9,10. Несмотря на это, не были хорошо изучены динамические процессы кавитационного пузырька (ами) взаимодействия с биологической ткани и клетки. Это происходит из-за хаотичности в инициировании и пузырьковых динамики кавитационных производства с помощью ультразвука, ударные волны, и локального гидравлического давления; Кроме того, существует недостаток стимулирующих методов для решения сложных по своей сути и быстрый отклик биологических клеток, особенно на уровне одной клетки.
Из-за этих проблем, это не удивительно, что очень небольшое число исследований было пчелап сообщили исследовать взаимодействия пузырьков клетки в хорошо контролируемых условиях эксперимента. Например, мембрана порации отдельных клеток в суспензии в ловушке 11 и импульсивный большая деформация человеческих красных кровяных клеток 12 были продемонстрированы с использованием лазерных сгенерированных одиночных пузырьков в микроканалов. Последний метод, однако, может производить только очень малую деформацию в эукариотических клетках , из – за наличия ядра 13. Кроме того, трудно контролировать вниз по течению биоэффектов при обработке клеток в суспензии. В других исследованиях, ультразвуковое возбуждение клеток переплете микропузырьков (или ультразвуковое контрастное вещество) для производства мембран порации и / или внутриклеточные реакции кальция в одиночных адгезивных клеток было сообщено 8. Мембрана порации отдельных адгезивных клеток , также могут быть получены при использовании генерируемое лазером пузырьков тандемные в тонком слое жидкости , содержащей светопоглощающий трипанового синего раствора 14, иликолеблющимся газового пузыря , генерируемого микросекунды лазерных импульсов , облучающих через оптически поглощающую подложку в микрокамеры 15. При сравнении оптически поглощающей подложке имеет преимущество по сравнению с лазерным поглощающие -ным раствором трипанового синего, поскольку последний является токсичным для клеток. Что еще более важно, лазерные генерируемые пузырьки более управляемым с точки зрения размера пузырьков и места, чем акустически возбужденных пузырьков. Тем не менее, во всех этих предыдущих исследованиях, форма клеток, ориентация и условия прилипания были не контролируется, что может существенно влиять на клеточный ответ и биоэффектов , полученные с помощью механических напряжений 16.
Для преодоления этих недостатков в предыдущих исследованиях, в последнее время мы разработали экспериментальную систему для образования пузырьков, клетки кучность, пузырь пузырь-клеточных взаимодействий, и в режиме реального времени биоэксперименты клеточного ответа в микрожидком чипа, построенного с использованием уникального сочетания микроструктур техничiques. Три основные черты , которые отличают нашу экспериментальную систему от других в области являются: 1) структурирование микронного размера золотых точек на стеклянной подложке , чтобы позволить локализованное поглощение лазера для образования пузырьков 17; 2) структурирование микронного размера островков внеклеточного матрикса (ЕСМ) для клеточной адгезии на той же подложке, чтобы контролировать как расположение и геометрию отдельных ячеек; и 3) сжатие размерности области взаимодействия пузырь пузырь-клеток из 3D в квази-2D пространства для облегчения в плоскости визуализации пузырьков пузыря взаимодействий, струйное поля течения, деформации клеток, и биоэффектов, все захваченные в один обтекаемый последовательность изображений (рис 1д).
Рисунок 1: Микрожидкостных чипа и схемы различных анализов. а) Собранный Микрожидкостных чип с каналами заполнены синими чернилами для визуализации. б) область внутри микрожидком чипа с узорчатыми клетками и золотыми точками (расстояние между двумя точками золота в непосредственной близости от 40 мкм). Многие пары рабочих блоков могут быть расположены в канале. с) Крупным планом изображение одного рабочего узла , состоящего из пары золотых точек и клетки HeLa прилипшего к области клеточной структуризации. d) Схема работы устройства. Одна ячейка придерживается и распространяется на "Н" -образного острова, покрытого фибронектина. Пара кавитационных пузырьков (тандем пузырь) с анти-фазовых колебаний производятся путем освещения импульсные лазерные лучи на золотых точек (рис 4а), что приводит к образованию быстро и локализованным струи движется в направлении клетки – мишени поблизости. Клетка может быть деформирован, porated для макромолекулярной поглощения, и / или стимулируются с ответом кальция, в зависимости от расстояния зазора , (S г) клетки на тандем – пузырь.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Эта платформа может быть дополнительно в сочетании с анализами флюоресценции и функционализированных бусинок, прикрепленных к поверхности клетки для кавитационных-индуцированной биоэффектов. В частности, эта платформа открывает путь для надежных и поддающихся количественной оценке анализов на уровне одной клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа тандемной пузыря-индуцированной деформации клеточных мембран, клеток порации и внутриклеточного поглощения, жизнеспособность, апоптоз и внутриклеточного кальция ответ. В следующем протоколе мы опишем процесс изготовления чипа и порядок анализа различных биоэффектов, упомянутых выше. Кроме того, также описаны операции чипа.
Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа 23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, м…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the use of the clean room facility SMIF at Duke University. We also want to thank Hao Qiang for his assistance in measuring the jet velocity. The authors thank Todd Rumbaugh of Hadland Imaging for providing the Shimadzu HPV-X camera used in this study.The work was funded in part by NIH through grants 5R03EB017886-02 and 4R37DK052985-20.
Reagent/Materials | |||
75x38mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
Photomask | Photoplotstore | N/A | 4×4 Direct write mask |
MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
Paraffin film | HACH | 251764 | |
SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
DPBS(1X) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
Carboxylate Microspheres 1.00μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
Carboxylate Microspheres 2.00μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
Water bath | VWR | 1122s | |
Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
software | Zeiss | AxioVision | |
PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |