Summary
Ишемического инсульта является трудным для изучения сложных событий, в котором конкретный вклад астроциты в регионе пострадавших мозга воздействию кислорода глюкозы (OGD). Эта статья знакомит методологию для получения изолированных астроциты и изучить их реактивность и распространения OGD условиях.
Abstract
Ишемический инсульт является сложный мозга травмы, вызванные тромба или эмболии, препятствующих приток крови к части мозга. Это приводит к лишению кислорода и глюкозы, который вызывает энергии неудачи и нейрональных смерти. После ишемического инсульта инсульт астроциты стать реактивной и распространяться вокруг места повреждения, как она развивается. Согласно этому сценарию трудно изучить конкретный вклад астроциты подвержена ишемии мозга регионе. Таким образом эта статья знакомит методологии для изучения первичного экзоцитоз реактивности и распространения в рамках модели в vitro ишемии как окружающей среды, называется глюкоза лишение кислорода (OGD). Астроциты были изолированы от 1-4 дня-старый новорожденных крыс и количество неспецифические Астроцитарная клеток была оценена с помощью экзоцитоз селективного маркер глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и ядерных окрашивания. Можно настроить период, в котором астроциты подвергаются OGD состояния, а также процент кислорода, которым они подвергаются. Эта гибкость позволяет ученым охарактеризовать продолжительность ишемического как условие в различных группах клеток в пробирке. Эта статья обсуждает таймфреймы OGD, побудить экзоцитоз реактивности, гипертрофический морфологии и распространения как измеряется иммунофлюоресценции с помощью расползанию ядерного антигена клеток (PCNA). Помимо распространения астроциты пройти энергии и окислительного стресса и реагировать OGD, выпустив растворимых факторов в среду клетки. Это средство можно собирается и используется для анализа влияния, выпущенный астроциты в первичной нейрональных культур без ячеек для взаимодействия молекул. В целом эта модель культуры главной ячейки может использоваться эффективно понять роль изолированных астроциты после травмы.
Introduction
Инсульта определяется как «острый неврологической дисфункции сосудистого происхождения с внезапным или быстрое развитие симптомов и признаков, соответствующего участия областей в мозге»1,2. Существует два типа инсульта: геморрагический и ишемический. При сосудистой дисфункции является причиной аневризмы или артериовенозных неисправности, сопровождается ослаблением с задней разрывом артерии, это называется геморрагического инсульта3 , которая, в большинстве случаев, приводит к смерти. Когда тромб или эмболии препятствует кровотока, вызывая временное лишение кислорода и глюкозы в области мозга, это называется ишемического инсульта4. Неспособность питают клетки вокруг пораженной области или ишемического ядра приводит к гомеостаза и метаболического дисбаланса, энергичный дисфункции, нейронов смерти и воспаление5, который может побудить пожизненной инвалидности для пациентов6.
Ишемический инсульт является многофакторной травмы с участием нескольких типов клеток, которые реагируют и приложить их последствия в различных временных точках. Многие взаимодействия создают сложную обстановку для изучения поведения отдельных клеток. Итак как мы изучаем вклад типа конкретной ячейки в такой сложной среде? Принятыми в vitro модель ишемии состоит из подвергая клетки к лишению кислорода и глюкозы (OGD), за определенный период, после восстановления клеток в нормоксические среде. Эта система имитирует ишемического инсульта следуют крови реперфузии. В этом методе клетки или ткани подвергаются глюкозы свободных средств массовой информации в среде, очищены от кислорода, с помощью специализированной гипоксических камеры. Время инкубации OGD может варьироваться от нескольких минут до 24 часов, в зависимости от гипотезы, что хочет быть протестированы. Исследования показали, что в зависимости от времена OGD и нормоксические среды, конкретных фенотипов инсульта (т.е., острой и подострой) может быть достигнуто. Первичный изолированных астроциты, подвергается OGD с задней реставрации нормоксические условий, является хорошо изученных сотовой модель для имитации инсульта в пробирке7. С помощью OGD можно выявить независимых молекулярные механизмы изолированных клеток под инсульта-среде.
Как наши знания биологии экзоцитоз увеличивается, становится очевидным, что они имеют решающее значение для поддержания синапсов и поддержания для ремонта, развития и пластичности нейронных8. В нормальных условиях астроциты релиз и реагировать цитокины, chemokines, факторы роста и gliotransmitters, сохраняя Метаболик баланс и гомеостаза в синапсах5,9. В острых neuroinflammation, таких как ишемического инсульта эти клетки могут стать реактивной, показать долгосрочный гиперэкспрессия глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и показать гипертрофия в их морфология5,10, 11 , 12. по мере ишемический инфаркт гомеостаза, предоставляемые астроциты становится пострадавших, относительно нормальной глутамата поглощения, энергетический метаболизм, Обмен активных молекул и антиоксидантной активности13.
Возобновленные астроциты размножаться вокруг инфаркте ткани, а Лейкоциты мигрируют к пораженного области14. Астроцитарная распространения может быть измерена с помощью маркеров пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA), Ki67 и Бромдезоксиуридин (BrdU)15. Этот пролиферативной ответ генерируется в зависимости от времени, и это помогает, образуя глиальный рубец, массив необратимо реактивной астроциты вдоль паренхиме поврежденного участка после травмы9. Одна из первоначальных функций этот шрам заключается в ограничении иммунных клеток кровоподтек из этой области. Однако исследования показали, что шрам становится физическое препятствие для аксоны продлить, как они выпустят молекул, ингибирующих аксональное рост, и создать физический барьер предотвращая расширение вокруг травмированного участка16аксоны. Тем не менее есть научные доказательства того, что после травмы спинного мозга, полностью предотвращения глиальных рубцов может ухудшить регенерации аксоны17. Таким образом контекст, в котором измеряется конкретными Астроцитарная ответ, должны рассматриваться на рамках изучал травмы.
Представлена методология может применяться для изучения индивидуального функции астроциты после кислорода глюкозы, и он может быть изменен в зависимости от которых следователь хочет ответить на вопросы. Например, помимо морфологических изменений и маркеры, выраженные в разные времена OGD, supernatants от астроциты, подвергается OGD могут быть далее проанализированы для определения растворимых факторов выпущенное эти клетки, или использоваться в качестве условных СМИ для оценки ее эффект в другие клетки мозга. Этот подход позволяет исследования на реактивность экзоцитоз, которая могла привести к выяснение факторов, которые регулируют и модулировать их ответ в случае ишемического инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
постнатального крысы (Sprague-Dawley) 1-4 дней старый используются для изоляции коре. Метод эвтаназия является обезглавливание, утвержденными руководящими принципами NIH.
1. Подготовка инструменты и материалы для хирургии
- Стерилизируй-отпусти инструментов в автоклаве (температура: 121 ° c, давление: 15 psi, время: 30 минут) с помощью стальной коробке или мгновенное уплотнения мешок стерилизации. Смотрите материалы в Таблице материалах.
2. Завершить подготовку DMEM
- в один литр стакан, содержащие газобетона 700 мл воды, добавить Дульбекко ' s Modified Eagle ' s Средний порошок при комнатной температуре.
- Добавить бикарбонат натрия 3,7 г/Л, в то время как решение перемешивают с магнитной мешалкой.
- Регулировка рН 7,4, газобетона водой довести объем до 1 L, а затем фильтр. Для целей культуры, дополнить требуемый объем средств массовой информации с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и тепло в 37 градусов. Смотрите материалы в Таблице материалах.
Примечание: PH была скорректирована до 7,4 через вставки электроды рН в средствах массовой информации. Средства массовой информации должны помешивая, затем медленно добавить 1 M NaOH с помощью капельницы.
3. Основная экзоцитоз культуры
Примечание: после посева, ячейки СМИ должны быть изменены каждые три дня и клетки может быть выращен до confluency (11-13 дней). На третий день, коснитесь фляга несколько раз для подъема Микроглии клеток и клеток-предшественников Олигодендроциты от культуры, удалите все ' старый ' СМИ, мыть дважды с помощью 10 мл PBS, аспирационная PBS, затем добавить свежие новые средства массовой информации. Смотрите материалы в Таблице материалах.
- Рассечение мозга новорожденных крыс
- выполнения диссекции в культуре ткани капюшоном. Получить 1-4 дней старый новорожденных крыс щенков (2 крысы мозги используются за флакон 75 см 2).
- Подготовить три чашки Петри 60 мм и Пипетка 5 мл полного DMEM на каждом.
Примечание: Они могут быть разделены следующим образом: #1 для каждого крыса мозга, #2 для всех коре мозга и #3 для всех очищенные коре (без мозговых оболочек). - Понять щенка и спрей с 70% этиловом спирте. Обезглавить его и отбросить тела в контейнер для отходов небольшой biohazard.
- С помощью пинцета микро секционный, держать голову и вырезать кожу на верхней части головы подвергать черепной коробки.
- С другой парой ножницы, сделать " Т " разрез, начиная от задней части черепа к носу. Используйте пару щипцами осторожно удалить черепа.
- Удалить подвергаются мозга с парой пинцетом и место в одном из Петри, ранее заполнены с среднего мозга.
- Использовать другой набор стерильных инструментов для последующих шагов.
- Использовать микро Рассекающий щипцами осторожно поместить один мозг на крышке Перевернутый Петри 60 мм. Когда Петри помещается на стерильную марлю, это возможно для просмотра мозга четко и это проще вскрыть.
- Устойчивый мозга с микро Рассекающий щипцами и отделить полушарие головного мозга, мягко теребят вдоль срединной щели с острым концом микро Рассекающий щипцами.
- Deflect и пил коре, оставив позади белого вещества и передавать их на чашку Петри, ранее помечены #2. Повторите эту процедуру для всех мозги, объединяя все расчлененных коре в Петри помечены #2.
- Возьмите гиппокамп из под каждого коры и отказаться от него.
- Использовать микро Рассекающий пинцета и Петри 60 мм аккуратно чистить мозговых оболочек от отдельных корковых лопастями и поместить их в чашке Петри помечены #3.
- Диссоциации ткани: Гомогенизатор блендер метод
- налить ткани/средний подвеска (очищенные коре головного мозга) в мешок стерильный блендере и добавить достаточно среднего довести общий объем в мешке до 5 мл.
- Место мешок в блендере гомогенизатор, оставив примерно 2 см мешок видна над закрытую дверь. Диссоциации клеток осуществляется в течение 2,5 мин на высокой скорости.
Примечание: Кроме того это можно сделать путем закрытия мешок и аккуратно стучать со стаканом в капюшоне. Убедитесь в том использовать ткань между мешок и стакан, чтобы избежать трения. - Налить суспензию клеток в число 60 сетки сито, а затем налить отфильтрованной через поток на номер 100 сито, что позволяет фильтровать самотеком.
- С помощью 15 мл пробирок, центрифуга суспензию клеток на 200 x g в клинических центрифуги (предпочтительно качели ведро ротор) за 5 мин.
- Слейте супернатант в стакан, а затем с помощью Серологические Пипетки, вновь приостановить и разъединять Пелле клеток в максимум 5 мл СМИ.
- Подсчет клеток
- с микропипеткой, собирать 100 мкл суспензии клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл и 100 мкл Трипановый синий.
- Вставить 10 мкл собранная подвеска в Горяева и рассчитывать все клетки, которые являются жизнеспособными в четырех углах площади.
- Формулы для расчета плотности клеток перед подготовкой колбы являются:
- Добавить по крайней мере 500 000 ячеек на колбу 25 см 2. Пипетка до 5 мл DMEM в каждый флакон. Смесь не должен доходить до шеи колбу. Поместите их в инкубаторе 37 ° C на 5% CO 2, на 3 дня, затем измените СМИ.
- Методов очистки экзоцитоз: СМИ, механические и химические стратегии для изменения
Примечание: скорость метаболизма астроциты является высоким по сравнению с другими типами клеток, таким образом, в питательной лишен условий, эти клетки показывают низкой выживаемости после нескольких дней. В отличие от астроциты микроглии не подвержены недостатке питания и размножаться в таких средах 18. Чтобы сохранить ограниченное количество Микроглии клеток, авторы изменить СМИ культуры клеток астроглиальных каждые 3 дня. Это постоянное изменение ячейки СМИ также уменьшит микроглии населения, которые могут расти на вершине Астроцитарная клетки однослойная в колбу 19.- Использования Пастер пипетку для аспирационная СМИ с non сторонник Микроглии клеток от каждого из колбы. Вымойте любой мусор оставил с помощью стерильной фильтрации PBS для каждого из колбы в духе прикапывают (5 мл/колба).
- Добавить стерильной фильтрации DMEM (с антибиотиком и плода бычьим сывороточным) каплям каждый флакон (5 мл/колба). Аккуратно агитировать в круговое движение, чтобы покрыть всю поверхность.
- Место клетки в 37 ° C инкубатор на 5% CO 2 на 8-10 дней колбы до confluency (> плита покрытие 95%).
Примечание: Несколько протоколов показали, что когда астроциты достигают confluency, механические методы, такие как сотрясение культуры от 2 до 24 ч, приводит к отряд клеток, которые лежат на вершине этих астроциты, главным образом Микроглия и прекурсоров клетки 19 ,- 20. - Non Астроцитарная клетки уменьшаются в культуре, выполняя орбитальных встряхивания на 180 об/мин за 30 мин. После удаления клеток в надосадке, свежие СМИ накапаны в колбу (~ 15 мл).
- Для устранения клетки-предшественники олигодендроциты, увеличить пожимая скорость до 200 об/мин для 6 h 21 , 22 , 23, аспирационная супернатант и свежие СМИ накапайте.
Примечание: Чтобы уменьшить присутствие микроглии в культурах, два химические методы могут использоваться последовательно (не одновременно) в методологии культуры главной ячейки: арабинозы цитозином (Ara-C) и L-лейцина метил Эстер (LME) 24. - Сразу, когда клетки достигают confluency (100%), 3-4 дней после механического удаления микроглии, эти клетки можно лечить с помощью 8 мкм antimitotic составные арабинозы цитозином (Ara-C) в среде DMEM на 5 дней (изменение ежедневно свежие Ara-c в среде DMEM).
Примечание: Момент времени для добавления Ara-C имеет решающее значение, поскольку это соединение является antimitotic наркотиков, что уменьшает количество быстро делящиеся клетки микроглии 19 , 25 и фибробласты 26 . В отличие от микроглии, когда вырожденная, астроциты остановить пролиферирующих через контакт ингибирование 27. - 2 дней для клетки, чтобы оправиться от лечения Ара-С.
- Для дальнейшего сокращения загрязнения микроглии, после того, как клетки достичь confluency, используйте 50 мм L-лейцина метилового эфира (КМЭ) в среде DMEM зафиксировано на рН 7,4, за 1 ч при 37 ° c.
Примечание: LME кресты мембраны клеток и органелл, и после гидролизованный, L-лейцина производится накапливается в лизосомы этих клеток. Накопление этой аминокислоты приводит к осмотической припухлость и разрыв лизосом 28 , 29. LME является весьма эффективным на ликвидацию микроглии, по сравнению с другими клетками 20 , 30.
4. Астроциты в пластины 6-ну культивировать
- coverslips покрытие с поли D-лизин
- coverslip положить один в каждом 35 мм Петри, затем 100 мкл разбавленного поли-D-лизин решения каждой coverslip и ждать 1 ч.
- Удаление поли-D-лизин и мыть дважды с 2 мл стерильной воды.
- Удаление воды и ждать coverslips сухой внутри вытяжки. Хранить coverslips при-20 ° C до двух недель.
Примечание: Заморозить разбавленный раствор поли-D-лизин; Он может храниться до двух недель.
- Trypsinization
- с помощью пипетки Пастера, аспирационная среднего из колбы. Добавьте 5 мл/настой стерильной фильтрации PBS аккуратно прополоскать клетки.
- Аспирата выключить PBS и затем добавьте 5 мл/колба стерильной фильтрации 0,25% трипсина и 0,5 мм раствора ЭДТА. Место колбу в 37 ° c, 5% CO 2 инкубатора для 10 мин
Примечание: В то время как инкубации клеток, теплый 5 мл/настой свежих полный DMEM 37 ° C. - После 10 минут инкубации, агитировать чтобы убедиться, что все клетки снять колбу. Быстро добавить 5 мл теплой полный DMEM каждый флакон, чтобы нейтрализовать трипсина.
- Нежно Пипетка клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить любой " кусты ". Передать 15 мл конические центрифуги подвесные клетки из двух колб.
- Центрифуги для 5 минут при 200 x g для сбора клеток Пелле. Вновь приостановить гранулы в 500 мкл среднего и приступить к место клеток в колбах.
Примечание: Примеры анализа с клеток: 1) обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа экспрессии генов; 2) западную помарку для оценки выражения протеина; 3) потока cytometry анализ квантифицировать количество нейронных прогениторных клеток и белков интерес; 4) иммунофлюоресценции для анализа выражения протеина и локализации.
- Посев астроциты
- после лечения первичной астроциты с трипсина (см. 4.2), собирать 100 мкл суспензии клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл и добавить 0,5% Трипановый синий 100 мкл.
- Добавить 10 мкл собранных подвески в Трипановый синий Горяева и рассчитывать все клетки, которые являются жизнеспособными.
- Использовать формулы в шаге 3.3 вычислить плотность клеток перед подготовкой колб.
- Подготовка многоскважинных блюда, добавив одну стерильные, поли D-лизин с покрытием coverslip для каждой скважины. Пипетка 50 000 ячеек и заполнить остальные тома в каждом несколькими хорошо блюдо со свежими средний (примерно 2 мл).
- Поместить несколько хорошо блюда в 37 градусов инкубатор на 5% CO 2, и после 5-7 дней, астроциты могут расти и покрывают всю поверхность coverslips.
5. OGD протокол для первичного астроциты
- OGD средней подготовки
- дополнение Дульбекко ' s изменение орел ' s средне свободной глюкозы с бикарбонатом натрия 3,7 г/Л и 1% пенициллина/стрептомицина. Смотрите материалы в таблице 4.
- Очистить 20 мл среды свободной глюкозы, восходящей с 95% N 2 / 5% CO 2 10 мин на поток 15 Л/мин (обозначается расходомер), вставив Серологические Пипетки к газовой системе в средне-и.
Примечание: После продувки среднего кислорода, регулировка рН на 7,4 (см. Примечание на шаг 2.1). - Фильтр очищенных свободной глюкозы среднего, используя систему фильтров 50 мл трубки.
Примечание: Сделать свежий OGD среднего для каждого эксперимента, восходящей с 95% N 2 / 5% CO 2 перед использованием, чтобы обеспечить, что клетки подвергаются очистке кислорода среды.
- Экспериментальная процедура
- внутри вытяжки культуры ткани, удалите экзоцитоз СМИ из ранее подготовленных coverslips (обратитесь к шагу 4.3.5) и мыть с сотовой PBS дважды, чтобы удалить любые глюкозы в клетки.
- Добавить 2 мл OGD СМИ каждому хорошо и место несколько хорошо блюда в камере гипоксии с их крышками выкл
- Подключение газовой смеси на входе клапан и оставить открытым выход клапана. Потолочные камеры с газовой смесью из 95% N 2 / 5% CO 2, 15 Л/мин за 5 мин
- Остановить поток газа и сначала близко зажим на выходе клапана, а затем закройте зажим на трубке клапан входа газа.
Примечание: Убедитесь, что есть нет утечки газа, покрывая печать камеры с мыльной водой. Если печать является безопасным, должно образовываться никаких пузырей. - Поместить всю камеру в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, 1 часа или 6 h в OGD.
- После того, как закончится время инкубации, аспирационная OGD СМИ и тщательно пипетки 2 мл полного DMEM каждый 4.67 см 2 хорошо для нормоксические процесса 24 h.
6. Протокол для первичной подготовки иммунофлюоресценции экзоцитоз
Примечание: оценить чистоту экзоцитоз, различные мозг клеток такие типы, как нейроны, Микроглия и Олигодендроциты могут быть обнаружены иммунофлюоресценции с использованием различных клеточных маркеров. Маркеры распространения и PCNA пропидий йодидом (PI) может использоваться на первичной астроциты, подвергается OGD следуют нормоксические условий. Смотрите материалы в Таблице материалах.
- Иммунофлюоресценции подготовки
Примечание: это протокол общего иммунофлюоресценции, незначительные изменения могут выполняться для достижения оптимального сигнала (например, длительный инкубационный период, Температура инкубации). Каждый маркер из таблицы 1 может использоваться в зависимости от производителя ' протокол s.- Для оценки жизнеспособности клеток, клетки можно инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C с PI (5 мкм в полной DMEM) и мыть дважды с 2 мл PBS для 5 минут клетки, которые показывают PI пятнать менее жизнеспособными.
Примечание: Использование ячейки рассматривается в шаге 5.2.6. - Исправить клетки после окрашивания PI, добавить 2 мл 4% формалина в 4.67 см 2 хорошо, для 20 минут, 4 градусов. Для образцов, помечены PCNA, крепления предпочтительным является метанола для 10 мин на 4 градусов.
Осторожностью: Формалин и метанол являются токсичными.
Примечание: Всегда проверяйте специфическое антитело протоколы от каждой компании. - Мыть ячейки с 2 мл PBS для 5 минут и повторите этот шаг 3 раза.
- Инкубации клеток в блокировании раствор (0,5% неионные ПАВ, 10% FBS в PBS) за 30 мин при комнатной температуре с нежным пожимая.
- Мыть ячейки с 2 мл PBS на 5 мин, повторить 3 раза мыть.
- Инкубируйте на 4 ° C, на ночь (16 ч), с основного антитела (PCNA, СВМС) в раствор 1% FBS в PBS.
- Удалить решение основное антитело, вымыть клетки с 2 мл PBS для 5 минут и повторите этот шаг 3 раза.
- Инкубировать с вторичное антитело проспряганное с Флюорофор в раствор 1% FBS в PBS, за 1 ч, при комнатной температуре.
- Мыть ячейки с 2 мл PBS на 5 минут, повторите этот шаг 3 раза. Добавить 1 мкг/мл DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) на 5 минут, чтобы пятно клеточных ядер.
- Мыть ячейки с 2 мл PBS 5 мин, повторите этот шаг два раза и держать в PBS.
- Подготовить coverslips на микроскопа с помощью установки среднего.
- Для оценки жизнеспособности клеток, клетки можно инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C с PI (5 мкм в полной DMEM) и мыть дважды с 2 мл PBS для 5 минут клетки, которые показывают PI пятнать менее жизнеспособными.
- Конфокальный микроскоп
- после настройки Микроскоп, место на coverslip стороне вниз на сцене Микроскоп.
- С помощью программного обеспечения, выберите лазерный луч на 543nm для СВМС Cy3 конъюгированных антител.
7. Жизнеспособность Assay клетки
- Trypsinize и количественно астроциты, выполните шаги, 4.3 и 4.4.
- Добавить 1 x 10-4 клетки/хорошо 96-луночных пластины и вырастить их в confluency.
- С использованием методологии из шага 5, разоблачить культивировали 96-луночных пластины либо нормоксические 1 h OGD или 6 h OGD.
- После OGD лечение, нормоксические СМИ добавляется ко всем ячейкам на 24 часа и жизнеспособности измеряется с помощью MTT Реагент assay (использовать как производитель ' s инструкции указывают).
- Из 5 мг/мл раствора MTT, добавить 10% от общего объема каждой скважины и Инкубируйте 3 ч при 37 ° c с реактивом MTT.
- Удаление средств массовой информации и Ресуспензируйте кристаллы с помощью 200 мкл диметилсульфоксида. Читайте пластины в спектрофотометром в 570 Нм.
Примечание: Снижение поглощения относительно управления ячеек будет соотносить с менее жизнеспособность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной из главных проблем первичной Астроцитарная культуры является наличие других клеток, нейронов, олигодендроциты, фибробластов и микроглии. На рисунке 1изолированных клеток от крыс коре были СМИ изменений каждые 3 дня и были либо необработанных или обработанных с добавлением LME за 1 ч. 24 h позже, клетки были immunostained для общего и counterstained с DAPI. Неочищенные клетки показал в среднем 39% не СВМС позитивные клетки, хотя LME-лечение клеток показали 8%. Эти результаты показывают, как LME лечения и средства массовой информации изменить эффективно снижение не СВМС позитивные клетки в 4,75 раза, производство обогащенного экзоцитоз культуры. Чтобы определить, если 1 h или 6 h OGD влияет на жизнеспособность экзоцитоз после этой методологии, Рисунок 2 показывает МТТ assay экзоцитоз культур, 24 ч после оскорбление. Никакого существенного различия в жизнеспособности было обнаружено в любом состоянии, показывающ что оба раза может использоваться для изучения экзоцитоз реактивности. Пролиферация клеток является одним из эффектов, вызванных OGD в астроциты. Пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA) на рисунке 3 увеличилась с 10% в нормоксические клетках, до 30% после 1 h OGD, показаны ожидаемые в vivo Астроцитарная ответ15. Наконец астроциты были подвержены 6 h OGD следуют 24 h нормоксические условий. После этого периода времени была выполнена иммунофлюоресценции против СВМС. OGD-облученных клеток были по сравнению с астроциты в нормоксические условиях. Астроциты без OGD показать традиционные севрюга морфологии (рис. 4а) в то время как клетки, которые прошли OGD четко представляют характерный гипертрофия реактивной астроциты (рис. 4B). Этот гипертрофия могут быть визуализированы в соответствующий образ контраст (DIC) дифференциальной помехи астроциты коры головного мозга крыс при нормоксические и OGD условиях (рис. 5).
Рисунок 1 . Иммунофлюоресценции для проверки чистоты культуры астроциты первичной коры головного мозга крыс с СВМС и DAPI. (A) левой панели представляет СВМС положительные клетки клетки (красный), средняя группа показывает ядер (DAPI, синий), а правая панель объединенного изображения не лечить LME (Верхняя панель) и LME-лечение (Нижняя панель). Белые стрелки показывают СВМС неположительное окрашенных клеток. (B) количественную оценку положительных ядер не СВМС в КМЭ и не LME лечение клетки. Непарные t тест был проведен (p < 0.0001) и погрешностей представляют собой среднее с SEM. масштаба бары представляют 50 мкм и фотографии были приняты при 20-кратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Жизнеспособность пробирного астроциты с 24 h воздействием OGD. Астроциты были культивировали в 96-луночных пластины и подвергаются нормоксические, 1 h OGD или 6 h OGD условий. После лечения клетки были добавлены к нормоксические средствам массовой информации за 24 часа и жизнеспособности была измерена с помощью анализа МТТ. Поглощения в 570 Нм показывает жизнеспособность клеток OGD-облученных клеток в культуре по сравнению с клетками в условиях нормоксические. Данные были проанализированы с односторонним ANOVA (p = 0.9669) и представлен с погрешностей, которые представляют собой среднее с SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Распространения в астроциты крыс возрастает под воздействием лишение кислорода и глюкозы и могут быть обнаружены с помощью PCNA как маркер. (A) панели слева представляет PCNA позитивные клетки (зеленый), средней панели показывает ядер (DAPI, синий) и правая панель показывает объединенного изображения нормоксические клеток (верхняя группа) и 1 h OGD относились клетки (Нижняя панель). (Б) процент PCNA позитивных клеток в нормоксические против OGD лечение клетки. Непарные тест был проведен (p < 0.0001) и погрешностей представляют собой среднее с SEM. масштаба бары представляют 50 мкм и фотографии были приняты при 20-кратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Выражение глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) проспряганное с Cy3 в культуре первичных крыса корковых экзоцитоз. (A) астроциты в нормоксические среде шоу характерным севрюга морфологии. Промежуточные нити белка, СВМС, заполняет ячейки органов и простирается в тонких цитоплазматических процессов. (B) после 6 h OGD экспозиции астроциты принял гипертрофических морфологии. Весы представляют 20 мкм и фотографии были приняты на 40 кратном в конфокального микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Астроциты корковых крысу под лишение кислорода глюкозы и нормоксические. Иммунофлюоресценции астроциты в нормоксические условиях (верхняя левая панель) или 6 ч OGD (нижней левой панели), окрашенных с помощью Cy3-конъюгированных антител против СВМС. Соответствующие дифференциальной помехи контраст (DIC) изображение будет показано в правой панели. Линейки шкалы представляет 20 мкм и фотографии были приняты при 20-кратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Цель | Антитела/маркер | Описание |
| Проверка культуры экзоцитоз | IBA-1 | Обнаруживает Микроглии клеток |
| NeuN | Идентифицирует зрелых нейронов | |
| Olig1 | Обнаруживает Зрелые Олигодендроциты | |
| Olig2, NG2 | Обнаруживает клетки-предшественники Олигодендроциты | |
| GalC | Идентифицирует незрелых или зрелых Олигодендроциты | |
| Распространение | PCNA | Связывает белок p36, выраженные на высоком уровне в пролиферирующих клеток |
| Жизнеспособность клеток | Пропидий йодидом (PI) | Связывается с ДНК, этот маркер указывает на отсутствие жизнеспособности клеток |
Таблица 1. Список реагентов, используемых для пятен различных типов клеток и клеточных процессов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает изоляции астроциты из крыса коре. В этом методе важно, чтобы уменьшить загрязнение с других клеточных типов, таких как микроглии, олигодендроциты и фибробластов. Чтобы уменьшить количество микроглии, некоторые шаги могут быть предприняты: изменение средств массовой информации, орбитальная встряхивания и химических обработок. После подтверждения чистоты культуры иммунофлюоресценции с помощью селективного клеточных маркеров или для самых известных загрязнителей клеток экспериментов может быть выполнена. Например антитела против ионизированного кальция привязки адаптера молекула 1 (Iba-1) может использоваться для обнаружения микроглии. Нейрональных смерти начинается рано в культуре и эти клетки устраняются вместе с Олигодендроциты клетки-предшественники (OPCs) после разговоров колбу и средства массовой информации изменения в день 331. Oligodendrocytic прекурсоров клетки могут быть определены с использованием антител, например olig2 или NG2. GalC может использоваться для определения незрелых или Зрелые олигодендроциты, но на этой стадии культуры эти вряд ли можно найти. Кроме того не СВМС позитивные клетки могут быть количественно и загрязнители могут быть оценены. Этот последний методологии не различать конкретных ячеек, но будет быстрее и более экономической методологии для определения доли не Астроцитарная клеток в культуре.
После того, как производится экзоцитоз обогащает культуру, OGD эксперименты могут проводиться для изучения экзоцитоз реактивности. Очистка раствором с азотом, восходящей заменить кислорода является часто используемым протоколом32. В нашей методологии мы используем метод восходящей маршрутизации для очистки кислорода азотом (95% N2, 5% CO2) в СМИ свободной глюкозы со скоростью потока 15 Л/мин, за 10 мин., общий объем 0,025 л Чтобы подтвердить, что кислород удаляется, мы измеренная концентрация кислорода, оставшиеся в средствах массовой информации с использованием кислорода метр для жидкостей и воздуха. Концентрация кислорода, оставшиеся в СМИ после продувки для 10 мин сократилось с 7.9 мг/Л до 0,3 мг/л. Чтобы определить, как долго камеры должны быть продуты заменить кислорода, очистка с N2 была выполнена с использованием не менее чем производитель камеры предложение (20 Л/мин, 2-5 мин). После 5 минут чистки в 15 Л/мин концентрация кислорода, оставшиеся в камере был 0%. Другие методологии с использованием аналогичных камер очищены в 8-20 Л/мин скорость потока и время 5-10 мин для замены кислородом воздуха с азотом33,34.
Как и другие модели сотовых OGD имеет ограничения, и результаты должны интерпретироваться тщательно. OGD может быть вредным для нейронов, однако, астроциты может выдержать эти условия до 24 h35. Еще одним ограничением является, что астроциты изолированы в этой системе, отсутствуют сигналы от других клеток. Одним из путей преодоления этого ограничения заключается в использовании условных СМИ от других клеток на тех же условиях ишемии как. Кроме того цитокинов или другие факторы могут добавляться в СМИ после OGD36.
Альтернативный метод для изучения последствий дефицита энергии в клетках, является добавление Уабаин в средствах массовой информации. Это соединение главным образом подавляет натрия/калия насос, который истощает внутриклеточном производства АТФ, аналогично влиянию OGD37,38. Однако этот метод имеет тот недостаток, что все свои механизмы полностью не поняты, и это побуждает пробить эффекты, который вводит переменные, которые составляют сценарий нереалистичных ишемического инсульта.
В резюме метод OGD является система изолированных клеток, которая позволяет нам непосредственно проверить последствия различных Астроцитарная наркотиков целей в пробирке , могли бы способствовать дальнейшему нейропротекции. Он также предоставляет инструмент для изучения основных экзоцитоз биологии. Эта модель можно создать прочную основу доказательств для обоснования экспериментальных условий для разработки лекарств, с помощью модели в vivo инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Паола Лопес Pieraldi для оказания технической помощи. А выражает признательность за гранты 8G12MD007600 и U54-NS083924, которые поддержали эту публикацию. Мы благодарим низ-NIMHD-G12-MD007583 Грант Фонда поддержки. D.E.R.A. благодарен за стипендий, предоставляемых NIHNIGMS-R25GM110513. Мы благодарны за использование области общего инструментария и помощи доктора Присцила Санабриа для использования оптических изображений объекта RCMI программы путем предоставления G12MD007583. Кроме того мы хотим поблагодарить за его выдающуюся роль в съемки и редактирования visual протокол Хосе Падилья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments for Surgery - Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation - step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture - step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation - step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence - step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody. |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody. |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining. |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M.
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V.
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
