Iskemiske hjerneslag er en kompleks hendelse der bidraget av astrocyttene til berørte hjernen regionen utsatt for glukose oksygenmangel (OGD) er vanskelig å studere. Denne artikkelen presenterer en metode for å skaffe isolert astrocyttene og studere deres reaktivitet og spredning under OGD forhold.
Iskemiske hjerneslag er en kompleks hjerneskade forårsaket av en blodpropp eller embolus hindrer blodtilførsel til deler av hjernen. Dette fører til deprivasjon av oksygen og glukose, som forårsaker energy feil og neuronal død. Etter en iskemiske hjerneslag fornærmelse, astrocyttene bli reaktive og sprer rundt skade området som det utvikler seg. I dette scenariet er det vanskelig å studere bidraget av astrocyttene til hjernen regionen utsatt for ischemia. Derfor presenterer denne artikkelen en metodikk for å studere primære astrocytter reaktivitet og spredning under en i vitro modell av ischemia-lignende miljø, kalt glukose oksygenmangel (OGD). Astrocyttene ble isolert fra 1-4 dagers-gamle neonatal rotter og antall uspesifisert astrocytic celler ble vurdert astrocytter selektiv markør Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og kjernefysiske flekker. Perioden der astrocyttene utsettes for OGD tilstanden kan tilpasses, samt prosenten av oksygen de utsatt for. Denne fleksibiliteten gjør at forskere til å beskrive varigheten av iskemiske som betingelsen i forskjellige grupper av celler i vitro. Denne artikkelen omhandler tidsrammer av OGD som induserer astrocytter reaktivitet hypertrofisk morfologi og spredning målt ved immunofluorescence med voksende celle kjernefysiske Antigen (PCNA). Foruten spredning, astrocyttene gjennomgå energi og oksidativt stress, og svare på OGD ved å slippe løselig faktorer til celle medium. Dette mediet kan samles og brukes til å analysere effekten av molekyler utgitt av astrocyttene i primære neuronal kulturer uten celle-til-celle. I sammendraget, kan denne primære celle kultur modellen effektivt brukes til å forstå rollen av isolerte astrocyttene ved skade.
Slag er definert som “en akutt Nevrologisk dysfunction av vaskulær opprinnelse med plutselige eller rask utvikling av symptomer og tegn, tilsvarer involvering av fokal områder i hjernen”1,2. Det finnes to typer slag: hemoragisk og iskemiske. Når vaskulær dysfunksjon er forårsaket av aneurisme eller en Arteriovenøs feil, ledsaget av svekkelse med bakre brudd på en arterie, kalles dette hemoragisk hjerneslag3 som, i de fleste tilfeller fører til døden. Når en blodpropp eller en embolus hindrer blodstrøm, kalles forårsaker en midlertidig deprivasjon av oksygen og glukose til en hjernen regionen, det iskemisk slag4. Feil å ernære cellene rundt det berørte området eller iskemisk kjernen fører til en homøostatisk og metabolsk ubalanse, energisk dysfunksjon, neuronal død og betennelse5, som kan indusere en livslang funksjonshemming for pasienter6.
Iskemiske hjerneslag er en multifaktoriell skade som involverer flere typer celler som reagerer og deres effekter på ulike tidspunkt. Mange samhandlinger opprette et vanskelig miljø for å studere atferden til enkeltceller. Så, hvordan vi studere bidrag fra en bestemt celle type under så komplekse miljø? En akseptert i vitro modell av iskemi består av utsette celler til oksygen og glukose deprivasjon (OGD), for en viss periode, etterfulgt av restaurering av celler i et normoxic miljø. Dette systemet simulerer en iskemiske hjerneslag etterfulgt av blod reperfusion. I denne metoden, blir eller vev utsatt for en glukose-frie medier i et miljø renset av oksygen, ved hjelp av en spesialisert hypoxic kammer. OGD inkubasjon tiden kan variere fra noen få minutter til 24 timer, avhengig av hypotesen som ønsker å bli testet. Studier har vist at avhengig av ganger av OGD og normoxic miljø, bestemte fenotyper av hjerneslag (dvs., akutt eller Subkronisk) kan oppnås. Primære isolert astrocyttene, utsatt for OGD med bakre restaurering normoxic forhold, er godt studert mobilnettet modell å etterligne slag i vitro7. Bruke OGD er mulig å avsløre uavhengig molekylære mekanismer av isolerte celler under et slag-lignende miljø.
Som vår kunnskap om astrocytter biologi øker, har det blitt tydelig at de er avgjørende for å opprettholde synapser og opprettholde nevrale reparasjon, utvikling og plastisitet8. Under normale forhold, astrocyttene slipp og svare på cytokiner, chemokines, vekstfaktorer og gliotransmitters, metabolske balanse og homeostase i synapser5,9. I akutt neuroinflammation, for eksempel iskemiske hjerneslag, kan disse cellene bli reaktive, Vis en langsiktig overuttrykte av Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og Vis hypertrofi i deres morfologi5,10, 11 , 12. som den iskemiske betennelsessykdommer utvikler, homeostase av astrocyttene blir påvirket, om normal glutamat opptak, energi metabolisme, utveksling av aktive molekyler og antioksidant aktivitet13.
Reaktiverte astrocyttene sprer rundt betennelsessykdommer vevet mens leukocytter migrere mot den lesioned område14. Astrocytic spredning kan måles med markører som voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA), Ki67 og bromodeoxyuridine (BrdU)15. Denne proliferativ responsen er generert i en tidsavhengige måte og det hjelper danner glial arret, en rekke irreversibelt reaktive astrocyttene langs parenchyma av skadet området etter en skade9. En av de første funksjonene i denne arr er å begrense immun cellen bloduttredelse fra dette området. Men har studier vist at arret blir et fysisk hinder for axons å forlenge, så de slipper molekyler begrenser axonal vekst, og danner en fysisk barriere hindrer axons i å utvide rundt skadde området16. Likevel er det vitenskapelige bevis som viser at etter en ryggmargsskade, fullstendig å hindre glial skjemmende arr kan svekke fornyelse av axons17. Derfor sammenheng der bestemte astrocytic svaret måles, må vurderes på rammen av skaden studerte.
Presentert metodikken kan brukes for å studere individualisert funksjonen av astrocyttene etter glukose oksygenmangel, og det kan endres avhengig av spørsmål som etterforskeren ønsker å svare. For eksempel tillegg morfologiske endringen og markører uttrykt på ulike tidspunkter, OGD, supernatants fra astrocyttene utsatt for OGD kan videre analyseres for å identifisere løselig faktorer utgitt av disse cellene, eller brukes som en betinget media for å vurdere sin effekt i andre hjerneceller. Dette gir studier på astrocytter reaktivitet som kan føre til utviklingen av faktorene som styrer og modulere sine svar i en iskemiske hjerneslag scenario.
Denne protokollen beskriver isolering av astrocyttene fra rotte halvdelene. I denne metoden er det viktig å redusere forurensningen med andre cellulære typer som microglia, oligodendrocytes og fibroblaster. Flere tiltak kan iverksettes for å redusere antall microglia,: endre media, orbital risting og kjemiske behandlinger. Når kultur renhet er bekreftet av immunofluorescence bruke selektiv mobilnettet markører eller fremste celle forurensninger, kan eksperimenter utføres. Antistoff mot ionisert kalsium bindende ada…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Paola López Pieraldi for teknisk assistanse. A.H.M. er takknemlig for tilskudd 8G12MD007600 og U54-NS083924 som støttes av denne publikasjonen. Vi takker NIH-NIMHD-G12-MD007583 stipend for anlegget støtte. D.E.R.A. er takknemlig for fellesskap av NIHNIGMS-R25GM110513. Vi er takknemlige for bruk av vanlige instrumentering og ved hjelp av Dr. Priscila Sanabria for bruk av optisk Imaging anlegg av programmet RCMI ved å gi G12MD007583. I tillegg ønsker vi å takke Jose Padilla for sin enestående rolle i filming og redigering visual protokollen.
Instruments for Surgery – Step 1 | |||
Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
DMEM Preparation – step 2 | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
Astrocyte culture – step 3 | |||
Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
OGD Medium Preparation – step 5 | |||
Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
Confocal microscope | Olympus |