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Neuroscience

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.

Abstract

Ictus ischemico è una lesione complessa del cervello causata da un trombo o embolo che ostruisce il flusso di sangue alle parti del cervello. Questo porta alla privazione di ossigeno e glucosio, che causa guasto di energia e morte neuronale. Dopo un insulto di colpo ischemico, astrociti diventano reattivi e proliferano attorno al sito di lesione, come si sviluppa. In questo scenario, è difficile studiare il contributo specifico dei astrocytes per la regione del cervello esposto ad ischemia. Di conseguenza, questo articolo introduce una metodologia per studiare la reattività Astrocita primario e proliferazione sotto un modello in vitro di un ambiente di ischemia-simile, chiamato privazione di ossigeno glucosio (OGD). Gli astrociti sono stati isolati da 1-4 giorno-vecchi ratti neonatali e il numero di cellule astrocytic aspecifica è stata valutata utilizzando Astrocita marcatore selettivo della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e macchiatura nucleare. Il periodo in cui gli astrociti sono sottoposti alla condizione OGD può essere personalizzato, così come la percentuale di ossigeno a che sono esposti. Questa flessibilità permette agli scienziati di caratterizzare la durata della condizione ischemica-come in diversi gruppi di cellule in vitro. Questo articolo discute i tempi di consegna di OGD che inducono la reattività di astrociti, morfologia ipertrofica e proliferazione come misurato dall'immunofluorescenza usando proliferando Cell Nuclear Antigen (PCNA). Oltre alla proliferazione, astrociti subiscono l'energia e lo sforzo ossidativo e rispondono agli OGD attraverso il rilascio di fattori solubili nel mezzo delle cellule. Questo mezzo possa essere raccolte e utilizzato per analizzare gli effetti delle molecole rilasciate dai astrocytes in colture neuronali primarie senza interazione cellula--cellula. In sintesi, questo modello della coltura cellulare primaria in modo efficiente consente di comprendere il ruolo degli astrociti isolati dopo un danno.

Introduction

Ictus è definito come "un'acuta disfunzione neurologica di origine vascolare con sviluppo rapido o improvviso dei sintomi e dei segni, corrispondenti alla partecipazione delle zone focali del cervello"1,2. Ci sono due tipi di ictus: ischemico ed emorragico. Quando la disfunzione vascolare è causata da un aneurisma o un malfunzionamento arterovenoso, accompagnato da indebolimento con posteriore rottura di un'arteria, questo è definito ictus emorragico3 che, nella maggior parte dei casi conduce alla morte. Quando un trombo o un embolo ostacola il flusso di sangue, causando una temporanea privazione di ossigeno e glucosio per una regione del cervello, si chiama colpo ischemico4. Inadempimento di nutrire le cellule intorno alla zona interessata o core ischemico conduce ad un squilibrio omeostatico e metabolico, disfunzione energetica, morte neuronale e l'infiammazione5, che può indurre una disabilità permanente per pazienti6.

L'ictus ischemico è una ferita multifattoriale che coinvolge diversi tipi di cellule che reagiscono ed esercitano i loro effetti in diversi momenti. Molte interazioni creano un ambiente difficile per studiare il comportamento delle singole celle. Così, come noi a studiare il contributo di un tipo specifico delle cellule in un ambiente così complesso? Un modello accettato in vitro di ischemia consiste di esponendo le cellule a deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD), per un certo periodo, seguito dal restauro delle cellule ad un ambiente normoxic. Questo sistema simula un colpo ischemico seguito da riperfusione di sangue. In questo metodo, le cellule o i tessuti sono esposti a una media glucosio-liberi in un ambiente che ha eliminato l'inceppo di ossigeno, utilizzando una camera ipossica specializzata. Il tempo di incubazione di OGD può variare da pochi minuti fino a 24 h, a seconda l'ipotesi che vuole essere testato. Studi hanno dimostrato che in base ai tempi di OGD e normoxic ambiente, fenotipi specifici del colpo (cioè, acuta o subcronica) può essere realizzato. Astrociti isolati, esposti a OGD con restauro posteriore a condizioni di normossia, è un modello di cellulare ben studiato per simulare la corsa in vitro7. Utilizzando OGD è possibile svelare i meccanismi molecolari indipendenti delle cellule isolate in un ambiente di colpo-come.

Come aumenta la nostra conoscenza della biologia di astrociti, è diventato evidente che sono cruciali per mantenere la sinapsi ed il sostenimento di riparazione, di sviluppo e plasticità neurale8. In condizioni normali, gli astrociti rilasciare e rispondere alle citochine, chemochine, fattori di crescita e gliotrasmettitori, mantenendo l'equilibrio metabolico e l'omeostasi nelle sinapsi5,9. In neuroinflammation acuta, come l'ictus ischemico, queste cellule possono diventano reattive, mostrare una lungo termine sovraespressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e mostrano ipertrofia nella loro morfologia5,10, 11 , 12. come si sviluppa l'infarto ischemico, l'omeostasi fornito da astrociti diventa affetto, per quanto riguarda l'assorbimento normale del glutammato, metabolismo energetico, scambio di molecole attive e antiossidante attività13.

Gli astrociti riattivati proliferano intorno al tessuto di infarto mentre leucociti migrano verso la zona leso14. Proliferazione astrocytic può essere misurata usando gli indicatori come antigene nucleare delle cellule di proliferazione (PCNA), Ki67 e bromodeossiuridina (BrdU)15. Questa risposta proliferativa viene generata in un modo dipendente dal tempo e aiuta a formare la cicatrice gliale, matrice di astrociti reattivi irreversibilmente lungo il parenchima del sito danneggiato dopo un infortunio9. Una delle funzioni iniziali di questa cicatrice è di limitare lo stravaso delle cellule immuni da questa zona. Tuttavia, gli studi hanno mostrato che la cicatrice diventa un impedimento fisico per gli assoni estendere, come essi rilasciare molecole inibendo la crescita assonale e creare una barriera fisica che impedisce che gli assoni che si estende intorno alla zona danneggiata16. Tuttavia, ci è prove scientifiche che dimostrano che dopo una lesione del midollo spinale, completamente prevenire la formazione di cicatrice gliale può alterare la rigenerazione di assoni17. Così, il contesto in cui viene misurata la risposta astrocytic specifica, deve essere considerato al momento il quadro della ferita ha studiato.

La metodologia presentata può essere applicata per studiare la funzione individualizzata dei astrocytes dopo privazione di ossigeno del glucosio e può essere modificato a seconda delle domande che lo sperimentatore vuole rispondere. Ad esempio, oltre il cambiamento morfologico e gli indicatori espressi in tempi diversi di OGD, i surnatanti dagli astrociti esposti a OGD possono essere analizzati ulteriormente per identificare fattori solubili rilasciati da queste cellule, o usato come un media condizionati per valutare la effetto in altre cellule del cervello. Questo approccio permette studi sulla reattività di astrociti che potrebbe portare alla delucidazione dei fattori che regolano e modulano la loro risposta in uno scenario di ictus ischemico.

Protocol

ratti postnatali (Sprague Dawley) 1-4 giorni vecchi vengono utilizzate per isolare cortecce. Il metodo dell'eutanasia è la decapitazione, come approvato dalla linee guida NIH.

1. preparazione degli strumenti e materiali per la chirurgia

  1. strumenti di sterilizzare in autoclave (temperatura: 121 ° c, pressione: 15 psi, tempo: 30 minuti) utilizzando una scatola d'acciaio o un istante di sigillamento del sacchetto di sterilizzazione. Vedi materiali nella Tabella materiali.

2. Completare la preparazione di DMEM

  1. In un becher da un litro contenente 700 mL di acqua in autoclave, aggiungere Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Media polvere a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere bicarbonato di sodio di 3,7 g/L, mentre la soluzione è agitata con un agitatore magnetico.
  3. Regolare il pH a 7.4, con acqua in autoclave
  4. portare il volume fino a 1 L, quindi filtrare. Ai fini della cultura, integrare il volume desiderato di media con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina e caldo a 37 ˚ c. Vedi materiali nella Tabella materiali.
    Nota: Il pH è stato regolato a 7,4 tramite inserimento l'elettrodo di pH metro in media. I media devono essere mescolando, quindi aggiungere lentamente 1 M NaOH con un contagocce.

3. Colture primarie di astrociti

Nota: dopo la semina, cell supporti devono essere cambiati ogni tre giorni e le cellule possono essere coltivate fino a confluenza (11-13 giorni). Il terzo giorno, tocca il pallone più volte ascensore alle cellule della microglia e cellule progenitrici del oligodendrocyte fuori la cultura, rimuovere tutti i ' vecchio ' media, lavare due volte utilizzando 10 mL di PBS, aspirare il PBS, quindi aggiungere fresca nuovi media. Vedi materiali nella Tabella materiali.

    1. Eseguire la dissezione in una cappa di coltura del tessuto la dissezione del cervello di ratto neonato. Ottenere 1-4 giorni vecchi cuccioli di ratto neonato (2 cervelli di ratto sono utilizzati per fiaschetta di 75 cm 2).
    2. Preparare tre piastre di petri da 60 mm e pipettare 5 mL di DMEM completo su ciascuno.
      Nota: Essi possono essere suddivisi come segue: #1 per ogni ratto del cervello, #2 per tutte le cortecce dei cervelli e #3 per tutte le cortecce sbucciate (senza meningi).
    3. Afferrare il cucciolo e spray con etanolo al 70%. Esso decapitare e gettare il corpo in un contenitore per rifiuti biologici piccolo.
    4. Con le pinzette micro-dissezione, tenere la testa e tagliare la pelle in cima alla testa per esporre il cranio.
    5. Con un altro paio di forbici, fare una " T " incisione a partire dalla parte posteriore del cranio verso il naso. Usare un paio di pinze per rimuovere delicatamente il cranio.
    6. Rimuovere il cervello esposto con un paio di pinzette e mettere il cervello in uno dei piatti petri precedentemente riempiti con medie.
    7. Utilizzare un altro set di strumenti sterili per i passi successivi.
    8. Utilizzare micro-dissezione forcipe per posizionare delicatamente un cervello sul coperchio rovesciato di una capsula di Petri 60 mm. Quando la capsula di Petri è collocato su garza sterile, è possibile visualizzare chiaramente il cervello ed è più facile sezionare.
    9. Costante del cervello con il forcipe micro-dissezione e separare l'emisfero cerebrale di delicatamente prendere in giro lungo la fessura del midline con la punta della pinza micro-dissezione.
    10. Trasferimento e sbucciare le cortecce, lasciando dietro di sé la materia bianca e trasferirli in una capsula di Petri, in precedenza denominata #2. Ripetere la procedura per tutti i cervelli, che unisce tutte le cortecce dissecate nella capsula di Petri con etichettata #2.
    11. Estrarre l'ippocampo da sotto ogni corteccia e gettare esso.
    12. Utilizzare le pinzette micro-dissezione e un petri 60mm per Sbucci delicatamente le meningi dai singoli lobi corticali e metterli nel piatto petri denominato #3.
  1. Dissociazione del tessuto: Metodo frullatore omogeneizzatore
    1. versare sospensione tessuto/medio (pelate cortecce del cervello) nel sacchetto sterile frullatore e aggiungere abbastanza terreno per portare il volume totale nel sacchetto a 5ml.
    2. Mettere il sacchetto nel frullatore omogeneizzatore, lasciando circa 2 cm della borsa visibile sopra la porta chiusa. La dissociazione di cella avviene durante 2,5 min ad alta velocità.
      Nota: In alternativa, questo può essere fatto di chiusura del sacchetto e battere delicatamente con un becher nella cappa. Assicurarsi di utilizzare un panno tra la borsa e il bicchiere per evitare attriti.
    3. Versare la sospensione cellulare in un setaccio con maglie numero 60 e poi versare il flusso filtrato attraverso sul setaccio numero 100, permettendogli di filtrare dalla forza di gravità.
    4. Utilizzando 15 mL provette, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g in una centrifuga clinica (preferibilmente rotore oscillazione) per 5 min.
    5. Versare il sovranatante in un becher, quindi utilizzando una pipetta sierologica, risospendere e dissociare il pellet di cellule in un massimo di 5 mL di media.
  2. Conta cellulare
    1. con una micropipetta, raccogliere 100 µ l di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 µ l di blu di trypan.
    2. Inserire 10 µ l della sospensione raccolta nell'emocitometro e contare tutte le celle che sono vitali ai quattro angoli del quadrato.
    3. Le formule per calcolare la densità delle cellule prima di preparare le beute sono:
      Equation 1
      Equation 2
    4. aggiungere almeno 500.000 cellule per fiaschetta 2 25 cm. Pipettare fino a 5 mL di DMEM in ciascuna beuta. La miscela non deve raggiungere il collo del pallone. Metterli in un incubatore a 37 ° C 5% CO 2, per 3 giorni, poi cambiare il supporto.
  3. Tecniche di purificazione del astrocyte: supporto di modifica, meccaniche e chimiche strategie
    Nota: il tasso metabolico degli astrociti è alto rispetto ad altri tipi di cellule, di conseguenza, in nutrizionalmente privato condizioni, queste cellule mostrano tassi di sopravvivenza basso dopo pochi giorni. A differenza di astrociti, microglia non sono interessati da privazione nutrizionale e proliferano in tali ambienti 18. Per mantenere un numero ridotto di cellule microgliali, gli autori modificare il terreno di coltura delle cellule astrogliali ogni 3 giorni. Questo continuo cambiamento nella media delle cellule diminuirà anche la popolazione di microglial che può crescere in cima il monostrato di cellule astrocitiche a pallone 19.
    1. Uso un Pasteur pipetta per aspirare i media con le cellule microglial antiaderente da ciascuno dei palloni. Lavare i detriti lasciati alle spalle con PBS sterile filtrata a ciascuno dei palloni in maniera goccia a goccia (5 mL/boccetta).
    2. Aggiungere goccia a goccia il DMEM sterile filtrata (con siero bovino fetale e antibiotico) a ciascuna beuta (5 mL/boccetta). Agitare delicatamente con un movimento circolare per coprire l'intera superficie.
    3. Cellule di posizione in un 37 ° Incubatrice di C in 5% CO 2 per 8-10 giorni fino a raggiungono le beute confluency (> 95% di copertura di lamiera).
      Nota: Diversi protocolli hanno dimostrato che quando gli astrociti raggiungono confluency, metodi meccanici, quali scuotendo la cultura da 2 a 24 h, porta al distacco di cellule che si trovano in cima a questi astrociti, microglia ed il precursore cellule 19 , 20.
    4. Cellule Non-astrocytic sono ridotti nella cultura eseguendo agitazione orbitale a 180 rpm per 30 min. Dopo la rimozione di cellule nel surnatante, media fresco è dispensato nel pallone (~ 15 mL).
    5. Per eliminare le cellule progenitrici del oligodendrocyte, aumentare la velocità di agitazione a 200 giri/min per 6 h 21 , 22 , 23, aspirare il surnatante e dispensare fresca media.
      Nota: Per diminuire la presenza di microglia nelle culture, due metodi chimici possono essere utilizzati in sequenza (non contemporaneamente) nella metodologia cultura cellula primaria: arabinosio citosina (Ara-C) e L-leucina metil estere (LME) 24.
    6. Immediatamente quando le cellule raggiungono la confluenza (100%), 3-4 giorni dopo la rimozione meccanica della microglia, queste cellule possono essere trattate con 8 µM della citosina di arabinosio composta antimitotiche (Ara-C) in DMEM per 5 giorni (cambio giornaliero di Ara-C fresca in DMEM).
      Nota: Il punto di tempo per aggiungere Ara-C è critico, poiché questo composto è una droga antimitotica, che riduce il numero di cellule si dividono rapidamente come fibroblasti e microglia 19 , 25 26 . A differenza di microglia, quando confluenti, astrociti smettere proliferando via inibizione da contatto 27.
    7. 2 giorni per le cellule di recuperare dal trattamento di Ara-C.
    8. Per ridurre ulteriormente la contaminazione microglial, dopo che le cellule di raggiungere confluency, utilizzare 50mm di metilestere di L-leucina (LME) in DMEM fissata a pH 7.4, per 1 h a 37 ˚ c.
      Nota: LME attraversa la membrana delle cellule e degli organelli, e dopo essere idrolizzato, L-leucina prodotta si accumula nei lisosomi di queste cellule. L'accumulo di questo aminoacido porta ad un rigonfiamento osmotico e la rottura dei lisosomi 28 , 29. LME è altamente efficace ad eliminare microglia, rispetto alle altre cellule 20 , 30.

4. Coltivare gli astrociti in piastre da 6 pozzetti

  1. rivestimento coprioggetti con poli-D-lisina
    1. vetrino coprioggetto di mettere uno in ogni piatto di petri 35mm, quindi aggiungere 100 µ l della soluzione diluita poli-D-lisina per ogni vetrino coprioggetto e attendere 1 h.
    2. Rimuovere il poli-D-lisina e lavare due volte con 2 mL di acqua sterile.
    3. Rimuovere l'acqua e attendere per vetrini coprioggetti asciugare all'interno della cappa. Memorizzare i coprioggetti a-20 ° C fino a due settimane.
      Nota: Congelare la soluzione diluita di poli-D-lisina; può essere conservato fino a due settimane.
  2. Trypsinization
    1. usando una pipetta Pasteur, aspirare il mezzo dai palloni. Aggiungere 5 mL/flacone di PBS sterile filtrata per sciacquare delicatamente le cellule.
    2. Aspirato fuori il PBS e quindi aggiungere 5 mL/flacone di filtrato sterile 0,25% tripsina e 0,5 mM soluzione EDTA. Collocare la beuta nel 37 ˚ c, 5% CO 2 incubatore per 10 min.
      Nota: Mentre sono incubando le cellule, caldo 5 mL/flacone di DMEM fresca completa a 37 ° C.
    3. Dopo 10 min di incubazione, agitare per assicurarsi che tutte le celle sono sollevate da pallone. Aggiungere rapidamente i 5 mL di caldo DMEM completo a ciascuna beuta, per neutralizzare la tripsina.
    4. Pipetta delicatamente le cellule su e giù più volte per spezzare qualsiasi " ciuffi ". Trasferimento celle sospese da due boccette a una provetta conica per centrifuga da 15 mL.
    5. Centrifuga per 5 min a 200 x g per raccogliere il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 500 µ l di terreno e procedere per inserire le celle in beute.
      Nota: Esempi di analisi da effettuarsi con le cellule: 1) reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR) per analizzare l'espressione genica; 2) Western blot per valutare l'espressione della proteina; 3) analisi di citometria a flusso per quantificare il numero di cellule progenitrici neurali e le proteine di interesse; 4) immunofluorescenza per analizzare l'espressione della proteina e la localizzazione.
  3. Seeding astrociti
    1. dopo il trattamento gli astrociti primari con tripsina (vedere 4.2), raccogliere 100 μL della sospensione di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 μL di 0,5% del blu di trypan.
    2. Aggiungere 10 μL della sospensione raccolta in trypan blu per l'emocitometro e contare tutte le celle che sono vitali.
    3. Utilizzare le formule in fase 3.3 per calcolare la densità delle cellule prima di preparare le beute.
    4. Preparare il multi-pozzo piatti con l'aggiunta di una sterile, poli-D-lisina rivestito coprioggetto in ciascun pozzetto. Pipettare le 50.000 cellule e riempire il resto del volume in ogni piatto multi-pozzetto con medium fresco (circa 2 mL).
    5. Inserire i piatti multi-pozzetto in incubatore 37 ° c a 5% CO 2 e, dopo 5-7 giorni, gli astrociti possono crescere e ricoprire tutta la superficie delle lamelle.

5. OGD protocollo per astrociti di

  1. preparazione media OGD
    1. supplemento Dulbecco ' s modificato Eagle ' glucosio privo di mezzo di s con 3,7 g/L bicarbonato di sodio e 1% penicillina/streptomicina. Vedi materiali nella tabella 4.
    2. 20 mL di glucosio libero terreno di spurgo dalla bollitura con 95% N 2 / 5% CO 2 per 10 min a un flusso di 15 L/min (indicato con il misuratore di portata) inserendo una pipetta sierologica al sistema del gas nel medio.
      Nota: Dopo l'eliminazione il mezzo di ossigeno, regolare il pH 7,4 (vedere nota sul punto 2.1).
    3. Filtrare l'inceppo medium senza glucosio utilizzando un sistema di filtro tubo 50 mL.
      Nota: Fare mezzo OGD fresco per ogni esperimento, spumeggiante con 95% N 2 / 5% CO 2 prima dell'uso, per garantire che le cellule sono esposte ad un ambiente che ha eliminato l'inceppo di ossigeno.
  2. Procedura sperimentale
    1. all'interno della cappa di coltura del tessuto, rimuovere supporti Astrocita da precedentemente preparati vetrini coprioggetti (fare riferimento al passaggio 4.3.5) e lavare con PBS cellulare due volte per rimuovere tutto il glucosio sulle cellule.
    2. Aggiungere 2 mL di media OGD a ciascun bene e posizionare i piatti multi pozzetto all'interno della camera di ipossia con loro coperchi off.
    3. Collegare la miscela di gas alla valvola d'ingresso e lasciare aperta la valvola di uscita. Lavare la camera con la miscela di gas di 95% N 2 / 5% CO 2, a 15 L/min per 5 min.
    4. Fermare il flusso di gas e prima chiudere il morsetto della valvola di uscita, quindi chiudere il morsetto del tubo valvola di entrata gas.
      Nota: Assicurarsi che non vi siano perdite di gas coprendo il sigillo della camera con acqua e sapone. Se il sigillo è sicuro, non bolle.
    5. Inserire l'intera camera l'incubatrice della coltura cellulare a 37 ° C per 1 h o h 6 in OGD.
    6. Dopo tempo di incubazione è finita, aspirare i media OGD e attentamente Pipettare 2 mL di DMEM completo a ogni 4,67 cm 2 per le condizioni di normossia elaborare 24 h.

6. Protocollo per la preparazione di immunofluorescenza Astrocyte primaria

Nota: per valutare la purezza di astrociti, cellule cerebrali differenti tipi come neuroni, microglia ed oligodendrociti possono essere rilevati da immunofluorescenza usando gli indicatori differenti delle cellule. Gli indicatori di proliferazione, PCNA e ioduro di propidio (PI) può essere utilizzati su astrociti di ratto esposti a OGD seguita da condizioni di normossia. Vedi materiali nella Tabella materiali.

  1. Preparazione di immunofluorescenza
    Nota: si tratta di un protocollo generale di immunofluorescenza, piccole modifiche possono essere eseguite per ottenere un segnale ottimo (per esempio, periodi di incubazione più lungo, temperatura di incubazione). Ogni marcatore da tabella 1 può essere utilizzato secondo il produttore ' protocollo s.
    1. Per valutare la vitalità cellulare, le cellule possono essere incubate per 5 min a 37 ° C con PI (5 µM in DMEM completo) e lavare due volte con 2 mL di PBS per 5 min. cellule che mostrano la macchiatura di PI sono meno praticabile.
      Nota: Uso le cellule trattate nel passaggio 5.2.6.
    2. Per fissare le cellule dopo colorazione PI, aggiungere 2 mL di formalina 4% a 4,67 cm 2 bene, per 20 min a 4 ° c. Per campioni etichettati con PCNA, la soluzione di fissaggio comodo è metanolo per 10 min a 4 ° c.
      Attenzione: Formalina e metanolo sono tossici.
      Nota: Controllare sempre i protocolli dell'anticorpo specifico da ogni società.
    3. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min e ripetere il passaggio 3 volte.
    4. Incubare le cellule nella soluzione di blocco (0,5% tensioattivi non ionici, 10% FBS in PBS) per 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
    5. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min, ripetere il lavaggio 3 volte.
    6. Incubare a 4 ° C, durante la notte (16h), con l'anticorpo primario (PCNA, GFAP) in una soluzione di 1% FBS in PBS.
    7. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min e ripetere questa operazione 3 volte.
    8. Incubate con l'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo in una soluzione di 1% FBS in PBS, per 1 h a temperatura ambiente.
    9. Lavare le cellule con 2 mL di PBS per 5 min, ripetere questa operazione 3 volte. Aggiungere 1 µ g/mL di DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) per 5 min a macchiare i nuclei delle cellule.
    10. Lavare le cellule con 2 mL di PBS 5 min, ripetere questo passaggio due volte e tenere in PBS.
    11. Preparare i coprioggetti su un vetrino da microscopio utilizzando il mezzo di montaggio a.
  2. Microscopio confocale
    1. dopo aver impostato il microscopio, posizionare il lato di coprioggetto sul palco microscopio.
    2. Utilizzando il software, selezionare un raggio laser a 543nm per l'anticorpo coniugato GFAP-Cy3.

7. Analisi di attuabilità di cella

  1. Trypsinize e quantificare gli astrociti seguendo la procedura descritta 4.3 e 4.4.
  2. Aggiungere 1 x 10 4 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e farle crescere al confluency.
  3. Usando la metodologia dal passaggio 5, esporre coltivate piastre da 96 pozzetti per entrambi normoxic 1h OGD o 6h OGD.
  4. Trattamento dopo OGD, normoxic multimediale viene aggiunto a tutte le celle per 24 h e redditività è misurata usando l'analisi di MTT reagente (utilizzare come produttore ' s istruzioni indicano).
  5. Da una soluzione MTT di 5 mg/mL, aggiungere il 10% del volume totale ad ogni pozzetto e incubare per 3 ore a 37 ˚ c con il reagente MTT.
  6. Rimuovere i supporti e risospendere cristalli con solfossido dimetilico di 200 µ l. Leggere la piastra con uno spettrofotometro a 570 nm.
    Nota: Una capacità di assorbimento in diminuzione rispetto a cellule di controllo mette in correlazione con meno vitalità.

Representative Results

Una delle preoccupazioni principali della cultura astrocytic primario è la presenza di altre cellule come i neuroni, oligodendrociti, fibroblasti e microglia. Nella Figura 1, cellule isolate da cortecce di ratto avevano preparato cambia ogni 3 giorni e sono stati o non trattata o trattata con aggiunto LME per 1 h. 24 h più successivamente, le cellule immunostained per GFAP e controcolorati con DAPI. Le cellule non trattate hanno mostrato una media di 39% non-GFAP cellule positive, mentre le cellule LME-trattate hanno mostrato 8%. Questi risultati mostrano come media e trattamento LME cambia cellule positive efficacemente in diminuzione non-GFAP da 4,75 volte, producendo una cultura arricchita-astrociti. Per determinare se 1 h o h 6 OGD colpisce redditività Astrocita dopo questa metodologia, la figura 2 Mostra un'analisi di MTT di colture di astrociti, 24h dopo l'insulto. Nessuna differenza significativa nell'attuabilità è stata trovata in qualsiasi condizione, mostrando che entrambe le volte può essere utilizzato per studiare la reattività di astrociti. Proliferazione delle cellule è uno degli effetti innescati OGD negli astrociti. Antigene nucleare delle cellule (PCNA) nella Figura 3 è aumentata dal 10% nelle cellule normossiche, al 30% dopo 1 h OGD, risultati attesi in vivo astrocytic risposta15. Infine, gli astrociti sono stati esposti a 6 h di OGD seguita da condizioni di normossia 24h. Dopo questo periodo di tempo, immunofluorescenza contro GFAP è stato effettuato. Cellule esposte a OGD sono state confrontate con gli astrociti in condizioni di normossia. Astrociti senza OGD mostrano la morfologia tradizionale stellare (Figura 4A), mentre le cellule che hanno subito OGD presentano in modo chiaro l'ipertrofia caratteristico di astrociti reattivi (Figura 4B). Questa ipertrofia possa essere visualizzato nell'immagine contrasto (DIC) interferenza differenziale corrispondente di astrocytes corticali del ratto sotto condizioni di normossia e OGD (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 . Immunofluorescenza per convalidare la purezza di cultura astrocytes del ratto corticale primario con GFAP e DAPI. (A), il pannello di sinistra rappresenta GFAP positivo (rosso), il pannello centrale Mostra nuclei (DAPI, blu), e il pannello di destra Mostra immagini unite non-LME-trattati (pannello superiore) e LME-trattati (pannello inferiore) cellule. Frecce bianche mostrano non GFAP-positivo macchiato le cellule. (B) quantificazione dei nuclei positivi non-GFAP in LME e non-LME cellule trattate. È stato effettuato un test t spaiato (p < 0,0001) e le barre di errore rappresentano la media con rappresenti di SEM. scala bar 50 micron e foto sono state scattate a 20 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Analisi di attuabilità degli astrociti con 24 ore di esposizione a OGD. Gli astrociti sono stati coltivati in piastre da 96 pozzetti ed esposti a condizioni OGD normoxic 1h OGD o, 6 h. Dopo il trattamento, le cellule sono state aggiunte ai media normoxic per 24 h e redditività è stata misurata usando l'analisi di MTT. Assorbanza a 570 nm spettacoli l'attuabilità delle cellule delle cellule OGD-esposti nella cultura rispetto a cellule in condizioni di normossia. Dati sono stati analizzati con One-way ANOVA (p = 0.9669) e presentato con barre di errore rappresentano la media con SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Proliferazione nei astrocytes del ratto aumenta sopra l'esposizione alla privazione di ossigeno e glucosio e può essere rilevata utilizzando PCNA come marker. (A), il pannello di sinistra rappresenta le cellule positive di PCNA (verde), il pannello centrale Mostra nuclei (DAPI, blu) e il pannello di destra mostra le immagini unite delle cellule normossiche (pannello superiore) e 1h OGD trattato le cellule (pannello inferiore). (B) percentuale di cellule positive di PCNA in normoxic contro OGD cellule trattate. È stato effettuato un test di spaiati (p < 0,0001) e le barre di errore rappresentano la media con rappresenti di SEM. scala bar 50 micron e foto sono state scattate a 20 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) coniugato con Cy3 in cultura di astrociti corticali del ratto primario. (A) gli astrociti in uno spettacolo di ambiente normoxic la morfologia caratteristica stellare. La proteina dei filamenti intermedi, GFAP, riempie i corpi cellulari e si estende nei processi citoplasmici sottili. (B) dopo 6 h di OGD astrociti di esposizione adottato una morfologia ipertrofica. Scale rappresentano 20 micron e foto sono state scattate a 40 ingrandimenti in un microscopio confocale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Astrocytes corticali del ratto sotto condizioni di normossia e ossigeno-glucosio privazione. Immunofluorescenza di astrociti in condizioni di normossia (pannello di sinistra superiore) o a 6 h OGD (pannello inferiore sinistro), macchiato usando un anticorpo coniugato con Cy3 contro GFAP. L'immagine di contrasto (DIC) interferenza differenziale corrispondente viene visualizzata sul pannello di destra. Barra della scala rappresenta 20 micron e foto sono state scattate a 20 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Scopo Anticorpo/marcatore Descrizione
Astrocita cultura convalida IBA-1 Rileva le cellule microglial
NeuN Identifica i neuroni maturi
Olig1 Rileva oligodendrociti maturi
Olig2, NG2 Rileva le cellule del precursore del oligodendrocyte
GalC Identifica gli oligodendrociti immaturi o maturi
Proliferazione PCNA Si lega la proteina p36, espressa ad alti livelli nelle cellule proliferanti
Vitalità cellulare Ioduro di propidio (PI) Si lega al DNA, questo marcatore indica mancanza di attuabilità delle cellule
TR > MTT Funzionalità mitocondriale misure Reattività GFAP Indicatore della reattività Astrocita

Tabella 1. Elenco dei reagenti utilizzati per vari tipi di cellule e processi cellulari di macchia

Discussion

Questo protocollo descrive l'isolamento degli astrociti da cortecce di ratto. In questo metodo, è fondamentale per ridurre la contaminazione con altri tipi cellulari come microglia, oligodendrociti e fibroblasti. Per ridurre il numero di microglia, si possono adottare diverse misure: cambiando la media, agitazione orbitale e trattamenti chimici. Una volta che la purezza di cultura è confermata dall'immunofluorescenza usando gli indicatori cellulari selettivi o per i contaminanti più prominenti di cella, gli esperimenti possono essere eseguiti. Per esempio, anticorpo contro la molecola di calcio ionizzato associazione adattatore 1 (Iba-1) può essere utilizzato per rilevare la microglia. Morte neuronale inizia presto la cultura e queste cellule vengono eliminate insieme con le cellule del precursore del oligodendrocyte (OPCs) dopo aver toccato boccetta e supporto di modifica al 3 ° giorno31. Cellule progenitrici c' possono essere identificate utilizzando anticorpi come olig2 o NG2. GalC può essere utilizzato per identificare gli oligodendrociti immaturi o maturi, ma in questa fase di cultura queste sono improbabile da essere trovato. In alternativa, le cellule positive di GFAP non possono essere quantificate e contaminanti possono essere stimati. Questa ultima metodologia non discernere tra le cellule specifiche, ma sarà un più veloce e più economico metodologia per determinare la percentuale di cellule non-astrocytic nella cultura.

Una volta che viene prodotta una cultura Astrocita arricchita, OGD esperimenti possono essere condotta per studiare la reattività di astrociti. L'eliminazione di una soluzione con azoto dalla bollitura per sostituire l'ossigeno è un protocollo comunemente utilizzato32. Nella nostra metodologia, utilizziamo il metodo bubbling per eliminare l'ossigeno con gas azoto (95% N2, 5% CO2) in media glucosio-liberi ad una portata di 15 L/min, 10 min, per un volume totale di 0,025 L. Per confermare che l'ossigeno è eliminato l'inceppo, abbiamo misurato la concentrazione di ossigeno rimanente nei media utilizzando un misuratore di ossigeno per liquidi e aria. La concentrazione di ossigeno residuo nei media dopo l'eliminazione per 10 min è diminuito da 7,9 mg/L a 0,3 mg/L. Per determinare quanto tempo la camera deve essere eliminata per sostituire ossigeno, eliminazione con N2 è stato effettuato non utilizzando meno di suggerimento del produttore camera (20 L/min, 2-5 min). Dopo 5 min di spurgo a 15 L/min, la concentrazione di ossigeno residuo nella camera era dello 0%. Altre metodologie utilizzando camere simili hanno eliminato l'inceppo a un 8-20 L/min di portata e a volte di 5-10 min per sostituire l'aria ossigeno con azoto33,34.

Come altri modelli di cellulari, l'OGD ha limitazioni e risultati devono essere interpretati con cautela. L'OGD può essere nocivo ai neuroni, astrociti è tuttavia, in grado di sopportare queste condizioni per fino a 24 h35. Un'altra limitazione è che gli astrociti sono isolati in questo sistema, privo di segnali da altre cellule. Un modo per superare questa limitazione consiste nell'utilizzare media condizionati da altre cellule stesse condizioni ischemiche-come. In alternativa, citochine o altri fattori possono essere aggiunti ai media dopo OGD36.

Un metodo alternativo per studiare gli effetti della carenza di energia nelle cellule, consiste nell'aggiungere uabaina ai media.  Questo composto principalmente inibisce la pompa sodio/potassio, che impoverisce la produzione intracellulare di ATP, simile agli effetti di OGD37,38. Tuttavia, questo metodo ha lo svantaggio che tutti i suoi meccanismi completamente non sono capiti e induce effetti fuori bersaglio, che introduce le variabili che costituiscono uno scenario irrealistico ictus ischemico.

In sintesi, il metodo OGD è un sistema isolato delle cellule che permette di verificare direttamente gli effetti della droga astrocytic diversi bersagli in vitro che potrebbero contribuire ulteriormente alla neuroprotezione. Fornisce anche uno strumento per studiare la biologia di base astrociti. Questo modello può creare una forte base di prove per giustificare le condizioni sperimentali per lo sviluppo di farmaci utilizzando un modello in vivo del colpo.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vogliono ringraziare Paola López Pieraldi per l'assistenza tecnica. A.H.M è grato per le borse di studio 8G12MD007600 e U54-NS083924 supportato questa pubblicazione. Ringraziamo NIH-NIMHD-G12-MD007583 borsa di studio per il supporto della struttura. D.E.R.A. è grata per la borsa di studio fornito da NIHNIGMS-R25GM110513. Siamo grati per l'uso della zona di strumentazione comune e concedere l'aiuto del dottor Priscila Sanabria per l'uso della struttura Imaging ottico del programma RCMI da G12MD007583. Inoltre, vogliamo ringraziare Jose Padilla per il suo ruolo eccezionale in riprese e montaggio il protocollo visual.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

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Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione <em>in Vitro</em> in condizioni ischemiche-come
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Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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