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Neuroscience

Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

doi: 10.3791/55108 Published: October 21, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Abstract

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão complexa do cérebro causada por um trombo ou êmbolo obstruindo o fluxo sanguíneo para partes do cérebro. Isto leva à privação de oxigênio e glicose, o que faz com que a falha de energia e morte neuronal. Depois de um insulto isquêmico, astrócitos tornar-se reativa e proliferam em torno do local da lesão, como ela se desenvolve. Sob esse cenário, é difícil estudar a contribuição específica dos astrócitos, a região do cérebro exposto à isquemia. Portanto, este artigo apresenta uma metodologia para estudar a reatividade astrocyte primária e proliferação sob um modelo in vitro de um ambiente, como isquemia, chamado de privação de oxigênio glicose (OGH). Astrócitos foram isolados a partir de dia 1-4-velhos ratos Neonatais e o número de células hamartomas específico foi avaliada utilizando marcador seletivo de astrocyte gliais de proteína ácida fibrilar (GFAP) e coloração nuclear. O período em que astrócitos estão sujeitos à condição de OGH pode ser personalizado, bem como a percentagem de oxigênio que estão expostos. Essa flexibilidade permite aos cientistas caracterizar a duração do estado isquêmico, como em diferentes grupos de células in vitro. Este artigo discute os prazos de OGH que induzem a reatividade astrocyte, morfologia hipertrófica e proliferação, como medido por imunofluorescência usando Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Além de proliferação, astrócitos passam por energia e estresse oxidativo e respondem a OGH pela liberação de fatores solúveis no meio de célula. Este meio pode ser coletado e utilizado para analisar os efeitos das moléculas lançados por astrócitos em culturas neuronal preliminares sem interação célula a célula. Em resumo, este modelo de cultura celular primária pode ser usado com eficiência para entender o papel dos astrócitos isolados após lesão.

Introduction

Traço é definido como "uma aguda disfunção neurológica de origem vascular com súbito ou rápido desenvolvimento de sintomas e sinais, correspondentes à participação de áreas focais no cérebro"1,2. Existem dois tipos de AVC: isquêmico e hemorrágico. Quando a disfunção vascular é causada por um aneurisma ou uma avaria arteriovenosa, acompanhado pelo enfraquecimento com posterior ruptura de uma artéria, este é denominado acidente vascular cerebral hemorrágico3 que, na maioria dos casos, leva à morte. Quando um trombo ou um êmbolo obstrui o fluxo sanguíneo, causando uma temporária privação de oxigênio e glicose para uma região do cérebro, é chamado de acidente vascular cerebral isquêmico4. Falha para nutrir as células ao redor da área afetada ou núcleo isquêmico leva a um desequilíbrio homeostático e metabólico, disfunção energética, morte neuronal e inflamação5, que pode induzir a uma deficiência ao longo da vida para pacientes6.

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão multifatorial, envolvendo vários tipos de células que reagem e exercem seus efeitos nos pontos de tempo diferentes. Muitas interações criam um ambiente difícil para estudar o comportamento de células individuais. Então, como é que estudamos o contributo de um tipo de célula específica em um ambiente tão complexo? Um modelo aceito em vitro de isquemia consiste em expor as células à privação de oxigênio e glicose (OGH), durante um determinado período, seguido da restauração das células para um ambiente normoxic. Este sistema simula um acidente vascular cerebral isquêmico seguido de reperfusão de sangue. Neste método, as células ou tecidos são expostos a uma mídia livre de glicose em um ambiente purificado de oxigênio, utilizando uma câmara especializada hipóxica. O tempo de incubação OGH pode variar de alguns minutos até 24 h, dependendo da hipótese de que quer ser testado. Estudos têm mostrado que, dependendo da época do OGH e normoxic ambiente, fenótipos específicos do curso (ou seja, aguda ou subcrónica) pode ser alcançado. Primários isolados astrócitos, expostos a OGH com posterior restauração às condições normoxic, é um modelo de celular bem estudado para imitar o traço in-vitro7. Usando OGH é possível revelar os mecanismos moleculares independentes de células isoladas em um ambiente semelhante ao curso.

À medida que aumenta nosso conhecimento da biologia de astrocyte, tornou-se evidente que eles são cruciais para manter as sinapses e sustentar de reparação, desenvolvimento e plasticidade neural8. Em condições normais, astrócitos liberar e respondem às citocinas, quimiocinas, factores de crescimento e gliotransmitters, mantendo o equilíbrio metabólico e homeostase dentro sinapses5,9. Em neuroinflammation aguda, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, estas células podem tornar-se reativa, mostrar uma superexpressão de longo prazo de Glial fibrilar ácida proteína (GFAP) e mostrar hipertrofia em sua morfologia5,10, 11 , 12. como o infarto isquêmico se desenvolve, a homeostase fornecida por astrócitos torna-se afetado, em relação a captação de glutamato normal, metabolismo energético, troca de moléculas ativas e antioxidante atividade13.

Reativados astrócitos proliferam em torno do tecido de infarto enquanto leucócitos migram para o lesado área14. Hamartomas proliferação pode ser medida usando marcadores como antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), Ki67 e bromodeoxyuridine (BrdU)15. Esta resposta proliferativa é gerada de forma dependente do tempo e ajuda a formar a cicatriz glial, uma matriz de astrócitos reativos irreversivelmente ao longo do parênquima do local danificado após uma lesão de9. Uma das funções iniciais desta cicatriz é limitar o extravasamento de células imunes dessa área. No entanto, estudos têm mostrado que a cicatriz se torna um impedimento físico para axônios estender, como eles liberam moléculas inibindo o crescimento axonal e criar uma barreira física, impedindo que os axônios estendendo-se ao redor da área lesada16. No entanto, há evidências científicas mostrando que após uma lesão na medula espinhal, impedir completamente a formação de cicatriz glial pode prejudicar a regeneração de axônios17. Assim, o contexto no qual é medida a resposta hamartomas específica, deve ser considerado em cima do quadro da lesão estudada.

A metodologia apresentada pode ser aplicada para estudar a função individualizada de astrócitos após privação de glicose oxigênio e ele pode ser modificado dependendo as perguntas que o investigador quer responder. Por exemplo, além da alteração morfológica e os marcadores expressados em momentos diferentes do OGH, os sobrenadantes de astrócitos expostos a OGH podem ser mais analisados para identificar fatores solúveis liberados por essas células, ou usado como uma mídia condicionada para avaliar sua efeito em outras células do cérebro. Esta abordagem permite estudos sobre reatividade astrocyte que poderia levar a elucidação dos fatores que governam e modulam sua resposta em um cenário acidente vascular cerebral isquêmico.

Protocol

pós-natal ratos (Sprague Dawley) 1-4 dias de idade são usados para isolar os córtices. O método de eutanásia é decapitação, conforme aprovado pelas diretrizes do NIH.

1. preparação de instrumentos e materiais para cirurgia

  1. instrumentos esterilize em autoclave (temperatura: 121 ° c, pressão: 15 libras por polegada quadrada, tempo: 30 minutos) usando uma caixa de aço ou uma mágica instantânea selagem bolsa de esterilização. Ver os materiais na Tabela de materiais.

2. Concluir a preparação de DMEM

  1. em um copo de um litro contendo 700 mL de água esterilizada, adicionar Dulbecco ' s Modified Eagle ' s médio pó à temperatura ambiente.
  2. Adicionar 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, enquanto a solução é agitada com um agitador magnético.
  3. Ajustar o pH para 7,4, com água esterilizada trazer o volume até 1 L e, em seguida, filtrar. Para fins de cultura, completar o volume desejado de mídia com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e morno em 37 ˚ c. Ver os materiais na Tabela de materiais.
    Nota: O pH foi ajustado para 7,4 através de inserir o eletrodo medidor de pH em meios de comunicação. Então a mídia deve ser agitação, adicionar lentamente 1 M NaOH, usando um conta-gotas.

3. Cultura primária de Astrocyte

Nota: após a semeadura, mídia celular deve ser alterada a cada três dias e as células podem ser cultivadas até confluência (dias 11-13). No terceiro dia, toque o frasco várias vezes para elevador microglial células e as células progenitoras oligodendrocyte fora da cultura, remover todos os ' velho ' mídia, lavar duas vezes com 10 mL de PBS, aspirar a PBS, em seguida, adicionar mídia nova fresca. Ver os materiais na Tabela de materiais.

  1. De dissecação do cérebro de rato recém-nascido
    1. executar a dissecação de um capuz de cultura de tecidos. Obter o 1-4 dias velho filhotes recém-nascidos (2 cérebros de ratos são usados por balão de 75 cm 2).
    2. Preparar três pratos de petri 60mm e pipetar 5 mL de DMEM completa em cada um.
      Nota: Eles podem ser divididos da seguinte forma: #1 para cada rato no cérebro, #2 para todos os córtices dos cérebros e #3 para todos os córtices pelados (sem as meninges).
    3. Segure o filhote e spray com etanol a 70%. Decapitá-lo e descartar o corpo em um recipiente de resíduos de risco biológico pequeno.
    4. Usando as pinças microdissecando, segure a cabeça e cortar a pele em cima da cabeça para expor o crânio.
    5. Com outro par de tesouras, fazer um " T " incisão começando da parte de trás do crânio em direção ao nariz. Usar um par de pinças para remover suavemente o crânio.
    6. Remover o cérebro exposto com um par de pinças e colocar o cérebro em um dos pratos petri previamente preenchidos com meio.
    7. Usar um outro conjunto de instrumentos esterilizados para as etapas subsequentes.
    8. Usar fórceps microdissecando delicadamente, colocar um cérebro na pálpebra invertida de um prato de petri de 60 mm. Quando o prato de petri é colocado em gaze estéril, é possível ver claramente o cérebro, e é mais fácil dissecar.
    9. Firme o cérebro com pinças microdissecando e separe o hemisfério cerebral por provocando suavemente ao longo da fissura mediana com a ponta da pinça microdissecando.
    10. Transferir e descasque os córtices, deixando para trás a matéria branca e transferi-los para um prato de petri, previamente rotulado #2. Repita o procedimento para todos os cérebros, combinando todos os córtices dissecados no prato de petri rotulados #2.
    11. Retire o hipocampo de debaixo de cada córtex e descartá-lo
    12. Usar a pinça microdissecando e uma petri 60mm para descasque delicadamente as meninges de lóbulos corticais individuais e colocá-los no prato de petri rotulado #3.
  2. Dissociação de tecido: método de misturador homogeneizador
    1. despeje o saco estéril liquidificador suspensão de tecido/médio (córtices descascadas do cérebro) e adicionar suficiente médio para trazer o volume total no saco de 5 mL.
    2. Coloque o saco dentro o misturador homogeneizador, deixando aproximadamente 2 cm do saco visível acima da porta fechada. A dissociação de célula é feita durante 2,5 min em alta velocidade.
      Nota: Como alternativa, isso pode ser feito, fechando o saco e batendo-lo suavemente com um copo no bairro. Certifique-se de usar um pano entre o saco e o copo para evitar atritos.
    3. Despeje a suspensão de células em uma peneira de malha de número 60 e em seguida despeje o fluxo do filtrado através para a peneira de número 100, permitindo-lhe filtrar por gravidade.
    4. Usando 15 mL tubos, centrifugar a suspensão de célula x 200 g em uma centrífuga clínica (de preferência balanço balde rotor) 5 min.
    5. Decantar o sobrenadante em um copo, em seguida, usando uma pipeta sorológica, re-suspender e dissociar o pellet de células em um prazo máximo de 5 mL de mídia.
  3. Celular contando
    1. com uma micropipeta, coletar 100 µ l de suspensão de células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 100 µ l de azul trypan.
    2. Inserir 10 µ l da suspensão coletada no hemocytometer e contar todas as células que são viáveis nos quatro cantos da Praça.
    3. As fórmulas para o cálculo da densidade das células antes de preparar os frascos são:
      Equation 1
      Equation 2
    4. adicionar pelo menos 500.000 células por balão de 25 cm 2. Pipete até 5 mL de DMEM para cada balão. A mistura não deve alcançar o pescoço do balão. Colocá-los numa incubadora 37 ° C em 5% CO 2, por 3 dias e, em seguida, alterar a mídia.
  4. Técnicas de purificação de astrocyte: mídia alterar, mecânicas e químicas estratégias
    Nota: a taxa metabólica de astrócitos é elevada em comparação com outros tipos de células, portanto, em nutricionalmente sem condições, estas células apresentam taxas de sobrevivência baixa depois de alguns dias. Ao contrário de astrócitos, micróglia não são afetados pela privação nutricional e proliferam em tais ambientes, 18. Para manter um número reduzido de células microglial, os autores mudam os meios de cultura de células de Ralevic cada 3 dias. Esta mudança constante nos meios de comunicação celular também irá diminuir a população de microglial que pode crescer em cima a monocamada celular hamartomas no balão 19.
    1. Uso um Pasteur pipeta para aspirar a mídia com células não-aderentes microglial de cada um dos frascos. Lavagem de todos os resíduos deixados para trás usando PBS estéril filtrada a cada um dos frascos de forma gota a gota (5 mL/frasco).
    2. Adicionar o filtrado estéril DMEM (com soro bovino fetal e antibiótico) gota a gota a cada balão (5 mL/frasco). Agitar suavemente em movimentos circulares para cobrir toda a superfície.
    3. Lugar as células em um 37 ° C incubadora a 5% de CO 2 por 8-10 dias até os frascos alcançar confluência (> 95% de cobertura de chapa).
      Nota: Vários protocolos têm mostrado que, quando astrócitos alcançar confluência, métodos mecânicos, tais como a cultura de 2 a 24 h, a tremer conduz para o destacamento de células que se encontram em cima destes astrócitos, principalmente microglia e precursor de células 19 , 20.
    4. Células Non-hamartomas é reduzidos em cultura através da realização de agitação orbital a 180 rpm por 30 min. Depois de remover células no sobrenadante, mídia fresca é pipetada para o balão (~ 15 mL).
    5. Para eliminar as células progenitoras oligodendrocyte, aumentar a velocidade de agitação para 200 rpm para 6 h 21 , 22 , 23, aspirado de sobrenadante e pipetar fresco mídia.
      Nota: Para diminuir a presença de micróglia nas culturas, dois métodos químicos podem ser usados em sequência (não simultaneamente) na metodologia de cultura celular primária: citosina arabinosa (Ara-C) e L-leucina metil éster (LME) 24.
    6. Imediatamente quando células alcançar confluência (100%), 3-4 dias após a remoção mecânica de micróglia, estas células podem ser tratadas com 8 µM da antimitóticas citosina arabinosa composta (Ara-C) em DMEM por 5 dias (mudança diariamente ao fresco Ara-C em DMEM).
      Nota: Ponto para adicionar Ara-C de tempo é crítico, uma vez que este composto é uma droga antimitóticas, que reduz o número de células, dividindo rapidamente como micróglia 19 , 25 e fibroblastos 26 . Em contraste com microglia, quando confluentes, astrócitos param proliferando através de da inibição de contato 27.
    7. Permitir que 2 dias para as células para se recuperar do tratamento de Ara-C.
    8. Para reduzir ainda mais a contaminação microglial, depois que células alcançar confluência, usa a 50mm de éster metílico de L-leucina (LME) em DMEM fixado em pH 7,4, por 1h em 37 ˚ c.
      Nota: LME atravessa a membrana das células e organelas, e após ser hidrolisado, a L-leucina produzido acumula-se nos lisossomos dessas células. A acumulação deste aminoácido leva a um edema osmótica e ruptura dos lisossomos 28 , 29. LME é altamente eficaz em eliminar microglia, em comparação com outras células 20 , 30.

4. Cultivando os astrócitos em placas boas 6

  1. revestimento lamelas com poli-lisina-D
    1. colocar uma lamela em cada prato de petri de 35 milímetros, em seguida adicionar 100 µ l da solução diluída para cada lamela poli-D-lisina e esperar 1 h.
    2. Remover o poli-D-lisina e lavar duas vezes com água estéril de 2 mL.
    3. Remover água e esperar por lamelas secar o interior do capô. Armazenar as lamelas a-20 ° C por até duas semanas.
      Nota: Congelar a solução diluída de poli-D-lisina; pode ser armazenado por até duas semanas.
  2. Trypsinization
    1. com uma pipeta Pasteur, Aspire o meio dos frascos. Adicionar 5 mL/frasco de PBS estéril filtrada para lavar delicadamente as células.
    2. Aspirado fora da PBS e em seguida, adicione 5 mL/frasco estéril filtrada 0,25% tripsina e 0,5 mM da solução de EDTA. Colocar o balão o ˚ c 37, 5% CO 2 incubadora durante 10 min.
      Nota: Enquanto as células estão incubando, aquecer 5 mL/frasco de fresco DMEM completa em 37 ° C.
    3. Após 10 min de incubação, agitar para certificar-se de todas as células são levantadas fora do frasco. Adicionar rapidamente a 5 mL de DMEM completa quente a cada balão, para neutralizar a tripsina.
    4. Pipetar suavemente as células acima e para baixo várias vezes para quebrar qualquer " grupos ". Transferência de células suspensas de dois balões para um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
    5. Centrifugar durante 5 min à x 200 g para coletar o centrifugado. Ressuspender o pellet em 500 µ l de meio e prosseguir para colocar as células em balões a.
      Nota: Exemplos de análises deve ser feita com células: 1) reação em cadeia do polymerase transcrição reversa (RT-PCR) para analisar a expressão do gene; 2) Western blot para avaliar a expressão de proteínas; 3) análise de citometria de fluxo de para quantificar o número de células progenitoras neurais e proteínas de interesse; 4) imunofluorescência para analisar a expressão da proteína e localização.
  3. a semeadura de astrócitos
    1. após o tratamento os astrócitos primários com tripsina (ver 4.2), coletar 100 μL da suspensão de células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 100 μL de 0,5% trypan azul.
    2. Adicionar 10 μL da suspensão coletada em trypan azul para o hemocytometer e contar todas as células que são viáveis.
    3. Use as fórmulas na etapa 3.3 para calcular a densidade das células antes de preparar os frascos.
    4. Preparar o poço de vários pratos, adicionando um estéril, poli-D-lisina revestido lamela a cada poço. Pipetar as 50.000 células e preencher o restante do volume em cada prato multi bem com meio fresco (cerca de 2 mL).
    5. Coloque os pratos multi bem dentro da incubadora 37 ˚ c a 5% de CO 2 e, depois de 5-7 dias, astrócitos podem crescer e cobrir toda a superfície das lamelas.

5. OGH protocolo para astrócitos primário

  1. preparação média OGH
    1. Dulbecco suplemento ' s modificado águia ' glicose livre médio de s com 3,7 g/L de bicarbonato de sódio e 1% penicilina/estreptomicina. Ver os materiais na tabela 4.
    2. Purga 20 mL do meio livre de glicose por borbulhamento com 95% N 2 / 5% de CO 2 por 10 min a um caudal de 15 L/min (indicado com o medidor de fluxo) através da inserção de uma pipeta sorológica para o sistema de gás no meio de.
      Nota: Após a purga o meio de oxigênio, ajustar o pH em 7,4 (consulte a nota no passo 2.1).
    3. Filtrar o meio livre de glicose eliminado usando um sistema de filtro do tubo de 50 mL.
      Nota: Fazer meio OGH fresco para cada experimento, borbulhando com 95% N 2 / 5% de CO 2 antes de utilizar, para assegurar que as células estão expostas a um ambiente purificado de oxigênio.
  2. Procedimento experimental
    1. dentro do capô de cultura de tecidos, remover mídia astrocyte de lamelas previamente preparadas (consulte a etapa 4.3.5) e lavagem com PBS celular duas vezes para remover qualquer glicose nas células.
    2. Adicionar 2 mL da mídia OGH a cada bem e coloque os pratos multi bem dentro da câmara de hipóxia com folga suas tampas
    3. Conectar-se a mistura de gás para a válvula de entrada e deixar a válvula de saída aberta. Lave a câmara com a mistura de gás de 95% N 2 / 5% CO 2, a 15 L/min para 5 min.
    4. Parar o fluxo de gás e primeiro feche a fixação da válvula de saída, em seguida, feche a braçadeira do tubo de válvula de entrada de gás.
      Nota: Certifique-se de não há nenhum escapamento do gás, abrangendo o selo da câmara com água e sabão. Se o selo for seguro, sem bolhas formam.
    5. Coloque a câmara inteira dentro da incubadora de cultura de célula a 37 ° C por 1 h ou h 6 em OGH.
    6. Depois que acabou o tempo de incubação, aspirar a mídia OGH e cuidadosamente Pipetar 2 mL de DMEM completa para cada 4,67 cm 2 bem para o normoxic processar 24 h.

6. Protocolo para a preparação de imunofluorescência primário Astrocyte

Nota: para avaliar a pureza de astrocyte, células cerebrais diferentes tipos tais como os neurônios, oligodendrócitos e micróglia podem ser detectados por imunofluorescência utilizando marcadores de célula diferente. Marcadores de proliferação, PCNA e iodeto de propidium (PI) podem ser usados em astrócitos principais expostos a OGH seguido por normoxic condições. Ver os materiais na Tabela de materiais.

  1. Preparação de imunofluorescência
    Nota: este é um protocolo geral de imunofluorescência, pequenas modificações podem ser executadas para alcançar uma óptima do sinal (por exemplo, longos períodos de incubação, temperatura de incubação). Cada marcador da tabela 1 pode ser usado de acordo com o fabricante ' protocolo s.
    1. Para avaliar a viabilidade celular, as células podem ser incubadas por 5 min a 37 ° C com PI (5 µM em DMEM completa) e lavar duas vezes com 2 mL de PBS para 5 min. de células que mostram coloração PI são menos viáveis.
      Nota: Uso as células tratadas na etapa 5.2.6.
    2. Corrigir células após coloração de PI, adicionar 2 mL de formol a 4% por 4,67 cm 2 bem, 20 minutos a 4 ˚ c. Para amostras rotuladas com PCNA, a solução preferida de fixação é metanol durante 10 minutos a 4 ˚ c.
      Atenção: Formol e metanol são tóxicos.
      Nota: Verifique sempre os protocolos de anticorpo específico de cada empresa.
    3. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 min e repita este passo 3 vezes.
    4. Incubar células em solução de bloqueio (tensoativo não-iônico de 0,5%, 10% FBS em PBS) por 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
    5. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 min, repetir a lavagem 3 vezes.
    6. Incubar a 4 ° C, durante a noite (16 h), com o anticorpo primário (PCNA, GFAP) em uma solução de 1% FBS em PBS.
    7. Remover a solução de anticorpo primário, lavam-se as células com 2 mL de PBS durante 5 min e repita este passo 3 vezes.
    8. Incubar com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo em uma solução de 1% FBS em PBS, por 1h, à temperatura ambiente.
    9. Lavar as células com 2 mL de PBS durante 5 minutos, repita este passo 3 vezes. Adicionar 1 µ g/mL de DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) por 5 min manchar o núcleo de células.
    10. Lavar as células com 2 mL de PBS 5 min, repetir esta etapa duas vezes e manter em PBS.
    11. Preparar as lamelas em uma corrediça do microscópio usando o meio de montagem.
  2. Microscópio confocal
    1. após a criação do microscópio, coloque o lado de lamela para baixo no palco microscópio.
    2. Usando o software, selecione um feixe de laser em 543nm para GFAP-Cy3 anticorpo conjugado.

7. Ensaio da viabilidade de células

  1. Trypsinize e quantificar astrócitos seguindo as etapas 4.3 e 4.4.
  2. Adicionar 1 x 10 4 células/poço para placas de 96 poços e cultivá-las a confluência.
  3. Usando a metodologia da etapa 5, expor culturas placas de 96 poços para quer normoxic 1h OGH ou 6 h OGH.
  4. OGH após tratamento, normoxic mídia é adicionada a todas as células para 24h e viabilidade é medida usando o ensaio de reagente MTT (usar como fabricante ' instruções s indicam).
  5. De uma solução MTT 5 mg/mL, adicionar 10% do volume total a cada poço e incubar durante 3 h a 37 ˚ c com o reagente MTT.
  6. Remover mídia e ressuspender cristais usando 200 µ l dimetil sulfóxido. Leia a placa em espectrofotómetro a 570 nm.
    Nota: Uma diminuição da absorvância em relação a células de controle será correlacionar com menor viabilidade.

Representative Results

Uma das principais preocupações da cultura hamartomas primária é a presença de outras células, como neurônios, oligodendrócitos, micróglia e fibroblastos. Na Figura 1, células isoladas de córtices rato tinham alterações de mídia a cada 3 dias em foram ou não tratada ou tratada com adicionado LME para 1 h. 24 horas mais tarde, as células foram immunostained para GFAP e counterstained com DAPI. Células não tratadas mostraram uma média de 39% não-GFAP células positivas, enquanto células tratadas LME mostraram 8%. Esses resultados mostram como mídia e tratamento de LME alterar células positivas não-GFAP efetivamente diminuída por 4,75 dobra, produzindo uma cultura enriquecida-astrocyte. Para determinar se 1 h ou h 6 OGH afeta a viabilidade de astrocyte após essa metodologia, a Figura 2 mostra um ensaio de MTT das culturas astrocyte, 24h após o insulto. Nenhuma diferença significativa na viabilidade foi encontrada em qualquer condição, mostrando que ambas as vezes pode ser usado para estudar a reatividade astrocyte. Proliferação celular é um dos efeitos provocados OGH em astrócitos. Proliferação celular antígeno nuclear (PCNA na Figura 3) aumentou de 10% nas células normoxic, para 30% após 1 h OGH, mostrando o esperado na vivo hamartomas resposta15. Finalmente, astrócitos foram expostos à 6 h de OGH seguido por condições de normoxic 24 h. Após este período de tempo, realizou-se a imunofluorescência contra GFAP. As células expostas OGH foram comparadas com astrócitos normoxic condições. Astrócitos sem OGH mostram a morfologia estrelada tradicional (Figura 4A) enquanto as células que foram submetidos a OGH apresentam claramente a característica hipertrofia de astrócitos reativos (Figura 4B). Essa hipertrofia pode ser visualizada na imagem de contraste (DIC) de interferência diferencial correspondente de astrócitos corticais rato normoxic e OGH condições (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 . Imunofluorescência para validar a pureza de cultura de astrócitos de ratos cortical primária com GFAP e DAPI. Células de células (vermelho), o painel do meio mostra núcleos (DAPI, azul), e o painel direito mostra imagens mescladas de LME não-tratados (painel superior) e tratados com LME (painel inferior) (A), o painel esquerdo representa GFAP positivo. Setas brancas mostram não-GFAP-positivo manchadas de células. (B) quantificação de núcleos positivos de não-GFAP na LME e não-LME tratados células. Realizou-se um teste-t não pareado (p < 0,0001) e as barras de erro representam a média com representam barras de SEM. escala 50 mícrons e fotos foram tiradas em ampliação de 20 x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Ensaio da viabilidade de astrócitos com exposição de 24 h a OGH. Astrócitos foram cultivados em placas de 96 poços e expostos a condições de OGH quer normoxic, 1h OGH ou 6 h. Após o tratamento, as células foram adicionadas ao normoxic mídia para 24h e viabilidade foi medida utilizando o ensaio de MTT. Absorvância a 570 nm mostra a viabilidade celular de células OGH-expostos na cultura quando comparado com as células em condições normoxic. Dados foram analisados com ANOVA One-Way (p = 0.9669) e apresentado com barras de erro representam a média com SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Proliferação de astrócitos de ratos aumenta após exposição à privação de oxigênio e glicose e pode ser detectada usando PCNA como um marcador. (A), o painel esquerdo representa células positivas PCNA (verde), o painel do meio mostra núcleos (DAPI, azul) e o painel direito mostra imagens mescladas de células normoxic (painel superior) e 1 h OGH tratados células (painel inferior). (B) % de células positivas PCNA em normoxic versus OGH tratados células. Realizou-se um teste pareado (p < 0,0001) e as barras de erro representam a média com representam barras de SEM. escala 50 mícrons e fotos foram tiradas em ampliação de 20 x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Expressão de Glial fibrilar ácida proteína (GFAP) conjugados com Cy3 em cultura de astrocyte cortical primária rato. (A) astrócitos em um show de ambiente normoxic a morfologia característica estrelada. As proteínas de filamento intermediário, GFAP, preenche os corpos celulares e se estende até os processos citoplasmáticos finos. (B) após 6 h de OGH astrócitos de exposição adoptado uma morfologia hipertrófica. Escalas representam 20 mícrons e fotos foram tiradas em ampliação de x 40 em um microscópio confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Astrócitos corticais rato sob privação normoxic e oxigênio-glicose. Imunofluorescência de astrócitos sob condições normoxic (painel esquerdo superior) ou 6 h OGH (painel inferior esquerdo), manchada usando um anticorpo conjugado Cy3 contra GFAP. A imagem de contraste (DIC) de interferência diferencial correspondente é exibida no painel direito. Barra de escala representa 20 mícrons e fotos foram tiradas em ampliação de 20 x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Finalidade Anticorpo/marcador Descrição
Validação de cultura astrocyte IBA-1 Detecta pilhas microglial
NeuN Identifica neurônios maduros
Olig1 Detecta os oligodendrócitos maduros
Olig2, NG2 Detecta as células precursoras do oligodendrocyte
GalC Identifica os oligodendrócitos imaturos ou maduros
Proliferação PCNA Vincula a proteína p36, expressada em níveis elevados nas células em proliferação
Viabilidade celular Iodeto de propidium (PI) Liga ao DNA, este marcador indica falta de viabilidade celular
TR > MTT Medidas de funcionalidade mitocondrial Reatividade GFAP Indicador de reatividade astrocyte

Tabela 1. Lista dos reagentes usados para manchar a vários tipos de células e processos celulares

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de rato. Neste método, é fundamental para diminuir a contaminação com outros tipos celulares como fibroblasto, oligodendrócitos e micróglia. Para reduzir o número de micróglia, várias medidas podem ser tomadas: mudando a mídia, orbital tremendo e tratamentos químicos. Uma vez que a pureza da cultura é confirmada por imunofluorescência usando marcadores celulares seletivas ou para os contaminantes mais proeminentes de célula, experiências podem ser executadas. Por exemplo, o anticorpo contra molécula de adaptador de ligação de cálcio ionizado 1 (Iba-1) pode ser usado para detectar microglia. Morte neuronal começa cedo na cultura e essas células são eliminadas juntamente com células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) depois da batida de balão e mídia muda no 3º dia31. Células precursoras oligodendrocytic podem ser identificadas usando anticorpos como olig2 ou NG2. GalC pode ser usado para identificar oligodendrócitos imaturos ou maduros, mas nesta fase da cultura, estas são susceptíveis de ser encontrado. Como alternativa, células positivas GFAP não podem ser quantificadas e contaminantes podem ser estimados. Esta última metodologia não discernir entre as células específicas, mas será uma mais rápida e mais econômica metodologia para determinar a percentagem de células não-hamartomas na cultura.

Uma vez que é produzida uma cultura de astrocyte enriquecido, OGH experimentos podem ser conduzidos para estudar a reatividade astrocyte. Purga de uma solução com nitrogênio por borbulhamento para substituir o oxigênio é um protocolo comumente usado32. Em nossa metodologia, usamos o método de propagação para purgar o oxigênio com o gás nitrogênio (95% N2, 5% CO2) para a mídia livre de glicose com um caudal de 15 L/min, durante 10 minutos, para um volume total de 0,025 L. Para confirmar que o oxigênio é purgado, medimos a concentração de oxigênio restante na mídia usando um medidor de oxigênio para líquidos e ar. A concentração de oxigênio restante na mídia após a purga para 10 min diminuiu de 7,9 mg/L de 0,3 mg/L. Para determinar quanto tempo a câmara deve ser purgada para substituir o oxigênio, purga com N2 foi realizada usando nada menos do que a sugestão do fabricante câmara (20 L/min, 2-5 min). Depois de 5 min de purga a 15 L/min, a concentração de oxigênio restante na câmara foi de 0%. Outras metodologias utilizando câmaras semelhantes têm removido em uma taxa de fluxo de 8-20 L/min e vezes de 5-10 min para substituir o oxigênio do ar com nitrogênio33,34.

Como outros modelos de celulares, a OGH tem limitações e resultados devem ser interpretados com cuidado. O OGH pode ser prejudicial para os neurônios, no entanto, astrócitos podem suportar estas condições por até 24 h35. Outra limitação é que os astrócitos são isolados neste sistema, falta de sinalização de outras células. Uma maneira de superar essa limitação é usar mídias condicionadas de outras células sob as mesmas condições isquêmicas, como. Alternativamente, citocinas ou outros fatores podem ser adicionados à mídia após OGH36.

Um método alternativo para estudar os efeitos da deficiência de energia nas células, é adicionar Ouabaína aos meios de comunicação.  Este composto, principalmente, inibe a bomba de sódio/potássio, que esgota a produção intracelular de ATP, semelhante aos efeitos do OGH37,38. No entanto, este método tem a desvantagem de que todos os seus mecanismos não são totalmente compreendidos e induz efeitos fora do alvo, que introduz variáveis que constituem um cenário de acidente vascular cerebral isquêmico irrealista.

Em resumo, o método OGH é um sistema de células isoladas que permite-nos testar diretamente os efeitos da droga hamartomas diferentes alvos em vitro que poderiam contribuir ainda mais para neuroproteção. Ele também fornece uma ferramenta para estudar biologia básica astrocyte. Este modelo pode criar uma forte base de evidência para justificar condições experimentais para o desenvolvimento de drogas usando um modelo in vivo de acidente vascular cerebral.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores querem agradecer Paola López Pieraldi pela assistência técnica. A.H.M é grato para o 8G12MD007600 de subsídios e U54-NS083924 que suporte esta publicação. Agradecemos a subvenção de NIH-NIMHD-G12-MD007583 para o suporte de instalação. D.E.R.A. é grato para a bolsa fornecida pelo NIHNIGMS-R25GM110513. Estamos gratos pelo uso da área comum de instrumentação e a ajuda do Dr. Priscila Sanabria para o uso da instalação de imagem óptico do programa RCMI por conceder G12MD007583. Além disso, queremos agradecer seu papel proeminente em filmagem e edição do protocolo visual Jose Padilla.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments for Surgery - Step 1
Operating scissor 5.5” Roboz Company RS-6812 Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”  Roboz Company RS-5271 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”  Roboz Company RS-5882 Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp  Roboz Company RS-5095 Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 Roboz Company RS-5135 Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers Roboz Company RS-4972 Peels brain meninges.
Dissection microscope Olympus SZX16 Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation - step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GibCo. Company 11995-065 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore Corning 431098
Astrocyte culture - step 3
Serological pipets 5mL VWR 89130-896 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL VWR 89130-898 To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL VWR 89130-900 To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL Santa Cruz Biotechnology sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL Eppendorf 022363204
Barrier Tips 200 uL Santa Cruz Biotechnology sc-201725
Barrier Tips 1 mL Santa Cruz Biotechnology sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19" VWR 14220-048
60mm petri dishes Falcon 351007
Sterile gauze pads Honeywell Safety 89133-086
Stomacher 80 Biomaster Sewar Lab System 030010019 Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags Sewar Lab System BA6040 Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL Pyrex 1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60  Sigma-Aldrich Company S1020 To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 Sigma-Aldrich Company S3895 To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope Nikon Eclypse Ti-S Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks Falcon 353136
Multi-well plate Falcon 353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round VWR 48380-046
Bright-Line hemacytometer Sigma-Aldrich Company Z359629
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
Ethyl alcohol  Sigma-Aldrich Company E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) Sigma-Aldrich Company L1002 Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich Company C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 Sigma-Aldrich Company P0899
Trypsin/EDTA GibCo. Company 15400-054
Trypan Blue Sigma-Aldrich Company T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Sterile Water Sigma-Aldrich Company W3500
 OGD Medium Preparation - step 5
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose Sigma-Aldrich Company D5030 Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Company S7277 Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin  GibCo. Company 15140-148 Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine  GibCo. Company 25030-081 Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Filter System 50mL with 0.22um pore Corning 430320
Centrifuge conical tube 50 mL VWR 89039-658
Single Flow Meter  Billups-Rothenberg SMF3001 Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber  StemCell 27310 Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter VWR 21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture Linde Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets Calbiochem 524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10% Sigma-Aldrich HT501128 Solution used to fix cells.
Methanol  Fisher A4544 Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100) Sigma-Aldrich T8787
Fetal bovine serum (FBS) GibCo. Company 10437-010 Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN Cell Signaling 24307 Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA Cell Signaling 2586 Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI) Sigma-Aldrich Company P4170 Apoptosis staining.
Anti-Olig1 Abcam AB68105 Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+ Wako 016-20001 Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3  Sigma-Aldrich Company C9205 Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488 Molecular Probe Life Technology A1101 Anti-Mouse Secondary Antibody.
Alexa Fluor 555 Molecular Probe Life Technology A21428 Anti-Rabbit Secondary Antibody.
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma-Aldrich Company D9542 Nuclear staining.
Confocal microscope Olympus

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Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação <em>in Vitro</em> sob condições isquêmicas
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Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).More

Ferrer-Acosta, Y., Gonzalez-Vega, M. N., Rivera-Aponte, D. E., Martinez-Jimenez, S. M., Martins, A. H. Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions. J. Vis. Exp. (128), e55108, doi:10.3791/55108 (2017).

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