Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/55112
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Introduction

السيطرة متعدية يبرز بوصفه خطوة هامة على حد سواء لتنظيم النسخي في التعبير الجيني، وخصوصا خلال فترات الإجهاد الخلوي 1. وهناك نقطة محورية في السيطرة الترجمة في الحد من معدل خطوة من الشروع حيث تتضمن الخطوات الأولى لتخليق البروتين الربط من حقيقيات النوى عامل بدء 4E (eIF4E) إلى methylguanosine 7 (م 7 GTP) 5 'السقف من من mRNAs 2 . eIF4E هو جزء من مجمع مثلوثي اسمه eIF4F يتضمن eIF4A، وهو هيليكاز RNA، وeIF4G، وهو بروتين السقالات اللازمة لتوظيف العوامل الترجمة الأخرى و40S الريبوسوم 3. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، ويتم تحويل الغالبية العظمى من من mRNAs عبر آلية تعتمد على كأب، ولكن في ظل فترات من التوتر الخلوي حوالي 10٪ من من mRNAs الإنسان يحتوي على 5 'UTRs والتي قد تسمح ترجمة مستقلة غطاء intiation 1،4. وكانت الترجمة التي تعتمد على غطاء مرادف تاريخياالأوس مع eIF4F، ومع ذلك، فقد أصبحت الاختلافات الإجهاد محددة من eIF4F موضوع تتجه 5-8.

الضغوط الخلوية المختلفة تسبب النشاط eIF4E إلى أن قمع عن طريق الهدف الثدييات من rapamycin مجمع 1 (mTORC1). هذا كيناز يصبح ضعف تحت الضغط، مما يؤدي إلى زيادة نشاط واحد من أهدافها، والبروتين 4E ملزم (4E-BP). غير فسفرته 4E-BP يربط eIF4E وكتل قدرتها على التفاعل مع eIF4G مما تسبب في القمع التي تعتمد على غطاء الترجمة 9،10. ومن المثير للاهتمام، وhomolog من eIF4E اسمه eIF4E2 (أو 4EHP) لها قابلية أقل بكثير عن 11 4E-BP، وربما السماح لها للتهرب من القمع بوساطة التوتر. في الواقع، يتميز في البداية باعتباره كاظمة الترجمة نظرا لعدم تفاعلها مع eIF4G 12، eIF4E2 يبدأ ترجمة مئات من mRNAs التي تحتوي على عناصر استجابة نقص الأكسجة الحمض النووي الريبي في بلدانهم UTR 3 أثناء الإجهاد ميتة 6،13. هذا التنشيط طق تحققت من خلال التفاعل مع eIF4G3، RNA ملزم البروتين عزر 4، ونقص الأكسجة عامل محرض (مؤسسة الحرمين) 2α تشكل مجمع eIF4F ميتة، أو eIF4F H 6،13. ونتيجة لكاظمة في ظل ظروف طبيعية، eIF4E2 يربط مع GIGYF2 وZNF598 14. تم، في جزء منه، حددت هذه المجمعات من خلال مرتبطة الاغاروز م 7 راتنجات GTP تقارب. هذا الأسلوب الكلاسيكي 15 هو المعيار في مجال الترجمة وهو المقايسات الأفضل والأكثر استخداما تقنية لعزل المجمعات ملزم الغطاء في المنسدلة وفي المختبر ملزمة 16-19. بوصفها الآلية الترجمة التي تعتمد على الغطاء يبرز بوصفه مرنة وقابلة للتكيف مع أجزاء المتغيرة بين 6-8،13، وهذا الأسلوب هو أداة قوية لتحديد بسرعة البروتينات ملزم غطاء رواية المشاركة في الاستجابة للضغط النفسي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاختلافات في eIF4F آثار واسعة كما تظهر عدة نظم نموذج حقيقية النواة لاستخدام homolog eIF4E2 لاستجابات التوتر مثل هذهكما A. thaliana 20، S. Pombe 21، D. البطن 22، وجيم ايليجانس 23.

تشير الدلائل إلى أن الاختلافات في eIF4F قد لا يكون مقتصرا فقط على ظروف عصيبة، ولكن أن تشارك في علم وظائف الأعضاء العادي 24. إمدادات الأوكسجين إلى الأنسجة (على طرفي الشعرية) أو داخل أنسجة (قياس عبر الميكروية) يختلف 2-6٪ في الدماغ 25، 3-12٪ في الرئتين 26، 3،5-6٪ في الأمعاء 27، 4٪ في الكبد 28، 7-12٪ في الكلى 29، 4٪ في العضلات 30، و6-7٪ في نخاع العظام (31). الخلايا والميتوكوندريا تحتوي على أقل من 1.3٪ أكسجين 32. هذه القيم هي أقرب إلى نقص الأكسجين من الهواء المحيط حيث الخلايا مثقف بشكل روتيني. وهذا يشير إلى أن ما كان يعتقد في السابق على أنها قد تكون العمليات الخلوية نقص الأكسجة محددة ذات صلة في إعداد الفسيولوجية. ومن المثير للاهتمام، eIF4F وeIF4F H 24. يدفع انخفاض الأكسجين أيضا نمو الجنين السليم 33 ولها خلايا عموما أعلى معدلات انتشار الأسلحة النووية، أعمار أطول، وأقل الحمض النووي من التلف وأقل استجابات التوتر العام في physioxia 34. لذلك، من المرجح eIF4F H عاملا أساسيا في التعبير عن جينات محددة في ظل الظروف الفسيولوجية.

هنا، ونحن نقدم على بروتوكول لخلايا الثقافة في ظروف الأكسجين الفسيولوجية ثابتة أو في نطاق تذبذب الديناميكية التي من المرجح أكثر تمثيلا للmicroenvironments الأنسجة. ومن مزايا هذا الأسلوب هو أن الخلايا هي lysed داخل محطة نقص الأكسجة. انها ليست في كثير من الأحيان من الواضح كيف يتم تنفيذ عملية الانتقال من ثقافة خلية ميتة إلى تحلل الخلايا في البروتوكولات الأخرى. وغالبا ما يتم إزالة الخلايا الأولى من حاضنة نقص الأكسجة الصغيرة يكونالصدارة تحلل، ولكن هذا التعرض للأكسجين قد يؤثر على المسارات البيوكيميائية مثل استجابة الخلايا للأوكسجين سريعا (واحد أو اثنين دقيقة) 35. تتطلب بعض البروتينات ملزم سقف التفاعل مع قاعدة الثانية أو يمكن أن يتحلل من GTP م 7، لذلك قد يكون غاب بعض interactors سقف في عملية التنقية. قد تكون بديلا الاغاروز مرتبطة إلى النظير غطاء مقاومة إنزيمي في هذا البروتوكول. سوف استكشاف النشاط وتكوين eIF4F H والأشكال الأخرى من eIF4F من خلال الطريقة الموصوفة هنا تسليط الضوء على معقدة وآليات التعبير الجيني التي تستخدم الخلايا خلال الظروف الفسيولوجية أو استجابات التوتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحضير للثقافة خلية

  1. شراء الأسهم المتاحة تجاريا من الخلايا البشرية.
    ملاحظة: هذا البروتوكول يستخدم سرطان القولون والمستقيم HCT116 والخلايا الأولية الإنسان الكلى الداني أنبوبي الظهارية (HRPTEC).
  2. جعل 500 مل المتوسطة للثقافة HCT116: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) / عالية المتوسطة الجلوكوز تستكمل مع 7.5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (P / S).
  3. جعل 500 مل المتوسطة للثقافة HRPTEC: المتوسطة الخلايا الظهارية تستكمل مع 5٪ FBS، 1٪ تكملة نمو الخلايا الظهارية، و 1٪ P / S.
  4. إعداد 500 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS): 140 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 15 ملم KH 2 PO 4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وتعقيم بواسطة التعقيم لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.

2. بدء التثقيف خلية

  1. بعناية نضح المتوسطة من صحن متكدسة 80-90٪ من دون إزعاج رانه الخلايا.
  2. قسامة 3-5 مل من برنامج تلفزيوني 1X في صحن الثقافة، صخرة بلطف كل قارورة لمعطف منطقة سطح الطبق، وبعناية نضح في برنامج تلفزيوني 1X. أكرر للمرة الثانية غسل برنامج تلفزيوني 1X.
  3. قسامة 3 مل من 0.05٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) في كل طبق والثقافة، وبلطف تهز إلى بالتساوي معطف الخلايا مع التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة.
  4. نقل خلايا منفصلة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 90 ثانية.
  5. بيليه الخلية resuspend في 1 مل من DMEM كاملة.
  6. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم. حساب عدد غير مولد للحمى والبوليسترين 100 ملم خلية ثقافة الأطباق المطلوبة لتحقيق كثافة البذر الأولية لحوالي 2،500-5،000 الخلايا لكل سم 2.
  7. قبل دافئ الكامل مستنبت الخلية المحرز في خطوات 1.2 أو 1.3 في 37 ° C حمام الماء لمدة 30-45 دقيقة.
  8. تطهير زجاجة المتوسطة وقارورة زنزانة مع 70٪ من الإيثانول. من هذه النقطة كليجب أن يتم تنفيذ عمليات جو معقم و مطهر.
  9. قسامة 6 مل من DMEM الكامل إلى العديد من الأطباق ثقافة الخلية 100 ملم المطلوبة لاستخدام كامل حجم الخلايا المجمدة داخل كثافة البذر المذكورة في الخطوة 2.6.
  10. نقل حجم التعليق الخلية المحسوبة في الخطوة 2.6 إلى كل من أطباق ثقافة 100 ملم. صخرة كل لوحة يدويا لتوزيعها بالتساوي على خلايا على سطح اللوحة.
  11. وضع المصنف 100 ملم صحن زراعة الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. تسمح للخلايا لاحتضان لا يقل عن 24 ساعة قبل الخطوات المقبلة.

3. Subculturing

  1. عرض كل طبق زراعة الخلايا تحت المجهر لتحديد نسبة confluency الخلية (٪ الخلايا التي تغطي مساحة الطبق). عودة الخلايا الحاضنة والمتوسطة كاملة قبل الدافئ وبرنامج تلفزيوني 1X. انتقل إلى الخطوة التالية إذا كانت الخلايا 80-100٪ متموجة.
  2. بعناية نضح المتوسط ​​أمضى من دون إزعاجالخلايا في كل طبق الثقافة.
  3. قسامة 3-5 مل من برنامج تلفزيوني 1X في صحن الثقافة، صخرة بلطف كل قارورة لمعطف منطقة سطح الطبق، وبعناية نضح في برنامج تلفزيوني 1X. أكرر للمرة الثانية غسل برنامج تلفزيوني 1X.
  4. قسامة 3 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA في كل طبق والثقافة، وبلطف تهز إلى بالتساوي معطف الخلايا مع التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة.
  5. خلال هذه الحضانة، قسامة مطلوبة 10 مل من المتوسط الشامل في العديد من أطباق الثقافة للحصول على كثافة خلية من خلايا 2،500-5،000 لكل سم 2.
  6. عندما الخلايا قد فصل من لوحة، وبسرعة إضافة 3 مل من مثبطات التربسين 1X محددة ودوامة بلطف الطبق لمدة 1 دقيقة لضمان أن جميع التربسين- EDTA تم تحييدها.
  7. نقل خلايا منفصلة في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي وتوضع جانبا. إضافة 3 مل برنامج تلفزيوني 1X إلى الطبق لجمع أي الخلايا المتبقية، ونقل ذلك إلى نفسه 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
  8. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي 150 x جلمدة 5 دقائق.
  9. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 3 مل من المتوسط ​​الشامل.
  10. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا الدم والبذور أطباق ثقافة 150 ملم تحتوي على 15 مل من المتوسط كاملة للحصول على كثافة خلية من خلايا 2،500-5،000 لكل سم 2. استخدام اثنين من 150 ملم لكل فحص ملزم الغطاء.
    ملاحظة: الأوكسجين إلى خلايا نشر عبر وسائل الإعلام السائلة يعتمد على حجم 36. فمن المستحسن للحفاظ على حجم وسائل الإعلام متسقة بين التجارب ما إذا كان يتم استخدام خلايا ملتصقة أو الخلايا في تعليق. وسائل الإعلام يمكن أن تكون مشروطة مسبقا (المحتضنة في محطة العمل لمدة 24 ساعة كما هو مبين في المناقشة) لتجنب هذه المتغيرات في نشرها.
  11. ضع الأطباق المصنفة الثقافة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. تسمح للخلايا لاحتضان لا يقل عن 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

4. Physioxic التعرض

  1. عرض الخلايا تحت المجهر. لبيزالنتائج ر، وضمان أن الخلايا هي 70-80٪ متكدسة لتعرض 24 ساعة، 50-60٪ متموجة لتعرض 48 ساعة، و40-50٪ متموجة لتعرض 72 ساعة.
  2. وضع الخلايا في محطة نقص الأكسجين عن الوقت المطلوب (24، 48، أو 72 ساعة اعتمادا على التجربة).
  3. تعيين محطة العمل إلى physioxia مناسبا.
    ملاحظة: على سبيل المثال، سيرافق إعداد O 2 3٪ بنسبة 5٪ CO 2 و 92٪ N 2.
    ملاحظة: إذا رغبت تقلبات الأكسجين داخل النطاق الديناميكي على جدول زمني محدد، برنامج الجدول الزمني في الصك أو يدويا ضبط إعدادات الأكسجين في فترات المطلوب.
  4. تعيين الرطوبة إلى 60٪. الجو محطة جاف للغاية على الرغم من ذلك، وسوف سائل الإعلام تتبخر بشكل ملحوظ خلال تجارب طويلة (> 48 ساعة). الحفاظ على الاحتياطي وسائل الإعلام في قارورة الثقافة خلية داخل محطة العمل (بحيث يتم معايرتها وسائل الإعلام مع جو محطة عمل) لتجديد وسائل الإعلام في ديس ثقافة الخلية[هس].
    ملاحظة: أي حل من شأنه أن تتفاعل مع الخلايا السابقة للتحلل (مثل برنامج تلفزيوني والتربسين-EDTA) يجب أن تكون مشروطة مسبقا لمدة 24 ساعة قبل استخدامها داخل محطة نقص الأكسجين بحيث equilibrates الأكسجين الذائب مع الأكسجين في الغلاف الجوي 36.
  5. إبقاء الخلايا داخل محطة العمل حتى تحلل.

5. المخازن التحضير لفحص ملزم كاب

  1. إعداد مخزنة تريس 1X المالحة (TBS).
    1. في 800 مل من O 2 درهم، ويحل 8.76 جم كلوريد الصوديوم و6.05 ز تريس قاعدة.
    2. تقديم حل لدرجة الحموضة النهائية 7.4 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    3. جلب الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام درهم 2 O.
  2. إعداد العازلة تحلل عدم تغيير طبيعة. إعداد تحلل العازلة اليوم للمقايسة ملزم الغطاء. جعل العازلة تحلل اضافية لتغسل حبات الاغاروز فارغة وγ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 (الخطوات 7.9 و 7.13).
    1. في 7 مل من O 2 درهم، إضافة 160 ميكرولتر 5 M بريدالتر، 160 ميكرولتر 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 40 ميكرولتر 200 ملم ناف، 40 ميكرولتر 1 م MgCl 2، و 40 ميكرولتر 1 ملم orthovanadate الصوديوم.
    2. إضافة 40 ميكرولتر من Igepal إلى حل 7 مل. قطع رأس ماصة للمساعدة في استرداد Igepal كما هو لزج جدا.
    3. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، أو دوامة، الحل 7 مل حتى يتم حل جميع Igepal.
    4. رفع الحجم النهائي من الحل إلى 8 مل والحفاظ على الجليد.
  3. إعداد 4X الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) -PAGE عينة العازلة.
    1. في كوب، والجمع بين 16 مل 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 12.64 مل الجلسرين، و 8 مل dithiothreitol (DTT).
    2. إضافة 3.2 غرام من SDS و 0.16 غرام من برموفينول الأزرق. السماح مسحوق بحل بالكامل عن طريق خلط مع شريط مغناطيسي.
    3. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.

6. تحلل الخلايا

  1. إعداد عدم تغيير طبيعة العازلة تحلل والحفاظ على الجليد يوم الخامسه فحص ملزمة للحد الأقصى.
  2. قبل دافئة برنامج تلفزيوني 1X والتربسين في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
  3. قسامة 980 ميكرولتر من تحلل العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لكل فحص ملزم غطاء يتم تنفيذها.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl فلوريد هيدروكلوريد و 10 ميكرولتر من 100X الكوكتيل مثبط البروتياز إلى 980 ميكرولتر من تحلل العازلة. الحفاظ على الجليد.
  5. تجاهل وسائل الإعلام من كل طبق 150 ملم في حاوية النفايات داخل محطة نقص الأكسجة.
  6. غسل الخلايا مع 3-4 مل من الحارة برنامج تلفزيوني 1X وتجاهل كل من السائل.
  7. إضافة 1 مل من الحارة 0.05٪ التربسين-EDTA إلى كل طبق واتركيه لمدة 2 دقيقة أو حتى لم يعد يتم الالتزام الخلايا إلى لوحة.
  8. باستخدام ماصة، ونقل الخلايا من لوحة واحدة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر حسب الحاجة بحيث يتم نقل كل لوحة من الخلايا إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge منفصلة.
  9. الطرد المركزي 1.5 مل أنابيب microcentrifuge في 6000 x ج لمدة 90 ثانية رس بيليه الخلايا.
  10. نضح التربسين باستخدام ماصة دون الإخلال بيليه. إذا تشعر بالانزعاج بيليه، وإعادة الطرد المركزي في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل في 6000 x ج لمدة 90 ثانية.
  11. غسل الخلايا مع دافئ برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting بلطف 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب فقط فوق بيليه. إعادة الطرد المركزي إذا حدث اضطراب بيليه.
  12. نضح في برنامج تلفزيوني من دون إزعاج بيليه.
  13. أعدت ماصة 500 ميكرولتر من 1 مل من محلول تحلل العازلة على أول بيليه الخلوية. resuspend الكرية بالكامل من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  14. الجمع بين الخلايا معلق مع بيليه الخلية الثانية و resuspend بيليه الثاني قبل pipetting صعودا وهبوطا. كرر هذه العملية حتى يتم الجمع بين كل الكريات ومعلق لكل عينة.
  15. الجمع بين المحللة مع 500 ميكرولتر المتبقية من تحلل العازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  16. إزالة عينات من محطة العمل نقص الأكسجة.
    ملاحظة: بعد إضافة العازلة تحلل، لهي التي يتعين القيام بها في الهواء المحيط كما تم تعيين محطة نقص الأكسجين إلى 37 درجة مئوية، والخطوات التالية التي يتعين القيام بها الباردة (4 درجات مئوية أو على الجليد) الخطوات اللاحقة ليرة لبنانية.
  17. ليز الخلايا باستخدام الإثارة لطيف عن طريق تناوب العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.
  18. الطرد المركزي الخلايا هي lysed في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
  19. نقل المحللة إلى أنبوب جديد microcentrifuge ل1.5 مل وتجاهل بيليه.
  20. حجز جزء (5-10٪) من طاف لاستخدامها كعنصر تحكم إدخال خلية المحللة كاملة للتحليل لطخة غربية في المستقبل.

7. الفحص ملزم كاب

  1. لكل عينة، ونقل 50 ميكرولتر من فارغة الاغاروز الطين السيطرة حبة و 50 ميكرولتر من الطين حبة المرتبطة C10 γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز لفصل 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. استخدام المقص لإزالة غيض من ماصة لتسهيل جمع من الطين حبة.
  2. بيليه حبات بذ الطرد المركزي الطين في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  3. إزالة طاف بعناية و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من TBS.
  4. كرر الخطوات من 7.2 و 7.3. بيليه الخرز في 500 x ج لمدة 30 ثانية، وإزالة طاف.
  5. نقل طاف تحتوي على المحللة من الخطوة 6.19 إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على حبات الاغاروز فارغة.
    ملاحظة: الخرز agarose فارغة بمثابة خطوة قبل إزالة لإزالة البروتينات من المحللة التي تتفاعل غير تحديدا مع حبة.
  6. احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  7. بيليه حبات الاغاروز فارغة بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  8. نقل المحللة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10.
  9. تغسل حبات الاغاروز فارغة عن طريق إعادة التعليق الخرز في 500 ميكرولتر من تحلل العازلة، التكوير حبات بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية، والتخلص من supernaتانت. تكرار ذلك أربع مرات ليصبح المجموع خمسة يغسل.
  10. resuspend والخرز agarose فارغة في عينة العازلة 1X SDS-PAGE، وتغلى حبات لمدة 90 ثانية في 95 درجة مئوية. مخزن في -20 درجة مئوية لمدة تحليل لطخة الغربي في المستقبل لمراقبة ما إذا كان البروتين ذات الاهتمام بربط غير خصيصا لحبة.
  11. احتضان المحللة مع حبات المرتبطة C10 γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية لالتقاط البروتينات ملزم الغطاء.
  12. بيليه γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية. تجاهل طاف.
  13. غسل γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بتكرار الخطوة 7.9.
  14. resuspend والخرز في 600 ميكرولتر من تحلل العازلة.
  15. إضافة GTP إلى تركيز النهائي من 1 ملم.
  16. احتضان γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز المرتبطة C10 حبات + 1 ملي GTP مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. ملاحظة: هذاسوف تنأى البروتينات التي تتفاعل غير تحديدا مع م 7 GTP (أي التفاعل أيضا مع GTP غير الميثيلي).
  17. بيليه γ-aminophenyl م 7 GTP الاغاروز حبات المرتبطة C10 بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 30 ثانية.
  18. طاف لنقل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد وإضافة 200 ميكرولتر من 4X عينة العازلة SDS-PAGE (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي DTT و 2٪ SDS، 0.1٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ الجلسرين). تخزين العينة الضابطة GTP في -20 درجة مئوية لمدة المستقبل تحليل لطخة غربية 37. تغسل حبات بتكرار الخطوة 7.9.
  19. resuspend والخرز في 1X العازلة عينة SDS-PAGE (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 100 ملي DTT و 2٪ SDS، 0.1٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ الجلسرين)، ويغلي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. تخزين م جزء متجهة الى GTP 7 في -20 درجة مئوية لمدة المستقبل تحليل لطخة غربية 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل القدرة ملزم كاب ردا على الأكسجين من eIF4E وeIF4E2 في م 7 GTP الانجذاب العمود

أرقام 1 و 2 تمثل البقع الغربية النموذجية م 7 GTP تنقية تقارب من اثنين من البروتينات الرئيسية ملزم الغطاء في استجابة لتقلبات الأكسجين في اثنين من خطوط الخلايا البشرية: الكلوية القريبة الخلايا الأولية الإنسان أنبوبي الظهارية (HRPTEC) في F igure 1 والقولون والمستقيم سرطان ( HCT116) في الشكل رقم 2. تتم المحافظة على الخلايا في توافر الأكسجين المحددة لمدة 24 ساعة للتأكد من أن الأكسجين الذائب في وسائل الإعلام السائلة تمت معايرتها مع الهواء داخل محطة نقص الأكسجة. حارة الإدخال (IN) يمثل 10٪ من الخلايا المحللة كله قبل م تم إضافة 7 حبات الاغاروز GTP مرتبطة لالتقاط البروتينات ملزم الغطاء. ويستخدم هذا الممر المدخلات كأساس لقياس تخصيبمن البروتين المستهدف في GTP المنسدلة م 7. حارة GTP هو شطافة من م 7 GTP الخرز التي كانت أزل مع 1 ملي GTP. هذه الخطوة تتيح للكشف عن البروتينات التي تعترف أيضا GTP غير الميثيلي. البروتينات ملزم سقف eIF4E وeIF4E2 تعترف م 7 GTP على وجه التحديد، ولكن homolog على eIF4E3 (غير مبينة هنا) يرتبط أيضا إلى GTP غير الميثيلي. قدرة eIF4E وeIF4E2 لربط 5 'مرنا هيكل سقف (م 7 GTP) يمكن قياسها من خلال مقارنة شدة قضبانها في م 7 عمود GTP نسبة إلى كثافة في حارة الإدخال (مجموع توافر حمام سباحة).

هذا الكمي لا يمكن أن يؤديها عن طريق قياس كثافة بكسل من العصابات البروتين لمدة ثلاثة مكررات البيولوجية مع صورة برامج التحليل مثل يماغيج. يتم التعبير عن النتائج كوسيلة النسبية للوحدات الكثافة (RDU) ± الخطأ المعياري للمتوسط. القيم الخام قبل التطبيعمن كل من التجريبية والضابطة عينات قورنت التي كتبها t-اختبار أونبايريد الذيل يومين الطالب. P <0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. وتبين هذه التجربة التمثيلية أن خطوط الخلايا هما نطاقات مختلفة من الأكسجين لمن eIF4E وeIF4E2 الاستخدام. ويبين الشكل (1) التي في HRPTEC eIF4E فقط يربط بقوة إلى m 7 GTP بنسبة 8٪ O 2 (الشكل 1A)، أن كلا من eIF4E وeIF4E2 ترتبط بشكل كبير مع م 7 GTP 3-5٪ O 2 (الشكل 1B - C)، وما ذاك إلا eIF4E2 يربط بقوة إلى m 7 GTP بنسبة 1٪ O 2 (1D الشكل). في الشكل 2، في خلايا HCT116، استخدام تعتمد على الأكسجين من هذه البروتينات ملزم الحد الأقصى هو مختلف: فقط eIF4E يربط بشكل كبير إلى m 7 GTP في 12٪ O 2 (الشكل 2A)، وكلاهما البروتينات ملزم سقف ربط بشكل كبير إلى m 7 GTP في 5-8٪ O 2 مجموعة(الشكل 2B - C)، وفقط eIF4E2 يربط بشكل كبير إلى m 7 GTP بنسبة 3٪ O 2 (الشكل 2D). ويبين غياب شطف من العمود GTP م 7 مع GTP أن eIF4E وeIF4E2 هي محددة لم 7 GTP ولا تعترف GTP غير الميثيلي. وتمثل الرسوم البيانية الكمي ثلاثة مكررات البيولوجية باستخدام يماغيج. نتائجنا تظهر أن اثنين من البروتينات ملزم سقف الكبرى، eIF4E وeIF4E2، تختلف في قدرتها على ربط مرنا م 7 GTP هيكل سقف بطريقة تعتمد على الأكسجين.

وبناء على الدراسات السابقة أن هذه البروتينات اثنين الشروع في ترجمة فصول فريدة من من mRNAs، يمكن لهذا التحول في النشاط ملزم غطاء يؤدي في proteomes مختلفة ولدت على التكيف مع التغيرات في توافر الأكسجين. هذه التقنية يمكن استخدامها لتوصيف العوامل الترجمة بدء الرواية التي تتفاعل مع 'كاب 5 مرنا(أو مع البروتينات ملزم الحد الأقصى) من خلال نهج لطخة غربية المستهدفة أو نهج واسع النطاق مثل تحليل الطيف الكتلي لGTP شطافة م 7.

شكل 1
تتداخل eIF4E وeIF4E2 الأنشطة خلال physioxia في HRPTEC 3-5٪ O 2: الشكل 1. المقايسات التقاط باستخدام م 7 GTP حبات في الخلايا القريبة الكلى البشرية أنبوبي الظهارية (HRPTEC) لست] تتعرض ل(A) 8٪، (ب) 5٪ (C) 3٪ أو (D) 1٪ O 2 لمدة 24 ساعة. GTP، وغسل GTP لقياس خصوصية لم 7 GTP. م 7 GTP والبروتينات بد أن م 7 حبات GTP بعد غسل GTP. وتظهر البقع الغربية التمثيلية وكان كميا البيانات من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة من قبل يماغيج وأعرب عن وحدات الكثافة النسبية (RDU) نسبة إلى 10٪ مساهمة (IN) من الخلايا المحللة كله. * اعتبرت P <0.05 (أونبايريد ثنائي الطرف الطالب اختبار t) تغييرا كبيرا عند مقارنة إثراء eIF4E أو eIF4E2 في جزء محدد الغطاء (م 7 GTP) إلى IN. البيانات، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. الطبل، S. وUniacke، خلايا J. الإنسان المثقف تحت الأكسجين الفسيولوجية تستخدم اثنين من البروتينات ملزم غطاء لتجنيد من mRNAs مميزة للترجمة. 2016؛ 291 (20): 10772-82 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. eIF4E والأنشطة eIF4E2 تتداخل أثناء physioxia في HCT116 5-8٪ O 2. القبض على فحوصات باستخدام م 7 GTP الخرز في HCT116 القولون البشري لست] سرطان تتعرض ل(A) 12٪، (ب) 8٪، (ج) 5٪ أو (D) 3٪ O 2 لمدة 24 ساعة. GTP، وغسل GTP لقياس خصوصية لم 7 GTP. م 7 GTP والبروتينات بد أن م 7 حبات GTP بعد غسل GTP. وتظهر البقع الغربية التمثيلية وكذلك تم تعيين كمية البيانات من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة من قبل يماغيج وأعرب وحدات الكثافة النسبية (RDU) نسبة إلى 10٪ مساهمة (IN) من الخلايا المحللة كله. * اعتبرت P <0.05 (أونبايريد ثنائي الطرف الطالب اختبار t) تغييرا كبيرا عند مقارنة إثراء eIF4E أو eIF4E2 في جزء محدد الغطاء (م 7 GTP) إلى IN. البيانات، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) من ثلاث تجارب مستقلة. وقد نشر هذا البحث أصلا في مجلة الكيمياء البيولوجية. TIMPالشرج، S. وUniacke، خلايا J. الإنسان المثقف تحت الأكسجين الفسيولوجية تستخدم اثنين من البروتينات ملزم غطاء لتجنيد من mRNAs مميزة للترجمة. 2016؛ 291 (20): 10772-82 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل البروتينات ملزم الغطاء في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأكسجين الفسيولوجية يمكن أن تسمح لتحديد العوامل الترجمة بدء التنظيم الأكسجين جديدة. تقارب من هذه العوامل لغطاء 5 'من مرنا أو غيرها من البروتينات المرتبطة سقف يمكن قياس قوة ارتباطهم إلى m 7 GTP مرتبطة الخرز الاغاروز. التحذير واحدة من هذه التقنية هو أنه يقيس القدرة ملزم غطاء من البروتينات بعد تحلل، ولكن يتم تنفيذ ذلك في ظل ظروف غير تغيير طبيعة التي تحافظ على تفاعلات البروتين البروتين والتعديلات بعد متعدية (PTMs). عدة تفاعلات البروتين البروتين توسط في ربط الأسرة eIF4E إلى الحد الأقصى 5 '. و4E-BP يربط ويقمع eIF4E من خلال منع تفاعلها مع eIF4G ومنع تجنيد من 43S قبل بدء المعقدة 38. يبقى المجمع eIF4E / 4E-BP منضمة إلى "الحد الأقصى 5 مرنا، ومنع أي بدء من أن النص، ويمكنأن تستخدم كعلامة لتثبيط eIF4E في م 7 أعمدة GTP تقارب. على العكس من ذلك، يمكن للتفاعل مع eIF4E eIF4G على م 7 أعمدة GTP يكون مؤشرا لبدء ترجمة نشطة. PTMs هي طريقة أخرى لتنظيم النشاط من العوامل الترجمة بدء. على سبيل المثال، يمكن أن الفسفرة من eIF4E التي كتبها Mnk1 زيادة تقارب من أجل مرنا 5 'قبعة 39. المعدل البروتين المشفرة بواسطة الانترفيرون بتنشيط جين 15 (ISG15) هو PTM الذي يزيد من نشاط ملزم غطاء من eIF4E2 ردا على تحريض فيروسات عن طريق العدوى الممرض 40. يحتوي على الجينات ISG15 عنصر استجابة نقص الأكسجين في المروج لها مما يدل على أن هذا النظام يمكن أن تنظم eIF4E2 في انخفاض الأكسجين. القليل جدا هو معروف حول كيفية PTMs قد تغير النشاط من البروتينات ملزم غطاء خلال ظروف الأكسجين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هذا الأسلوب يتبعه تحليل الطيف الكتلي يمكن أن تكشف عن التنظيم الأكسجين وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية PTMs رواية عشرفي التوسط في النشاط من العوامل الترجمة بدء.

ان طريقة بديلة لالتقاط مع م 7 GTP سقف التناظرية هو immunoprecipitate معروف ملزم غطاء البروتين مثل eIF4E أو eIF4G وتنفيذ الطيف الكتلي لتحديد البروتينات المرتبطة بها. وجود قيود على هذه الاستراتيجية هو أن البروتينات ملزمة سقف غالبا ما يكون الأدوار الخلوية بديلة مثل داخل الإجهاد حبيبات 41 أو في المستقل سقف الترجمة 1،4. لذلك، وذلك باستخدام م 7 النظير كاب GTP هو أفضل طريقة، الأكثر موثوقية لعزل البروتينات الملزمة كأب، وخاصة عند التحقيق البروتينات المرتبطة سقف الرواية. وجود قيود على استخدام وم 7 غطاء GTP التناظرية هو أن بعض البروتينات ملزم غطاء مثل زبال decapping انزيم منصة لجمع البيانات لا تتفاعل فقط مع م 7 غطاء GTP مرنا، ولكن أيضا تتطلب قاعدة ثانية لربط 42. وعلاوة على ذلك، decapping الانزيمات بشكل عام، مثل مجمع Dcp1 / Dcp2، يمكن HYDRolyze م 7 GTP وتقلل بشكل فعال قدرة الراتنج. لذلك، قد تفقد بعض البروتينات ملزم سقف في هذا التحليل. لتجاوز هذه المحاذير، ويمكن استخدام المقاومة إنزيمي النظير كاب مرنا. وقد تبين أن اثنين النظير كاب غير hydrolyzable، النوكليوتيد م 7 GpCH2pp أو ثنائي النوكليوتيد 7 GpCH2ppA م للقبض على منصة لجمع البيانات، Dcp1، وDcp2 43. هذه النظير كاب مرنا غير متوفرة تجاريا، ولكن يجب تصنيعه كيميائيا من جديد. الحد آخر من هذا البروتوكول هو أن فقط البروتينات أو البروتينات التفاعل مع بروتينات ملزمة الحد الأقصى عبر "حمل مركبة" ملزم سقف سيتم القبض عليه. بينما يعتمد الحد الأقصى للبدء الترجمة هو الشكل الرئيسي للبدء، وآليات مستقلة ذات القيمة السوقية هي السائدة وخاصة في ظروف التوتر الخلوي 1. ومع ذلك، في سياق هذه التقنية والاتجاهات الناشئة في مجال الترجمة بدء 6-8،24، وتحديد العوامل الجديدة التي يسببها الإجهاد الذي سنوياrticipate في بدء تعتمد على الحد الأقصى هي منطقة واعدة للبحث.

عامل آخر للنظر في هذا البروتوكول هو الأكسجين في وسائل الإعلام. زراعة الخلايا في الوسط السائل يوفر حاجزا بين الخلايا والغلاف الجوي. ولقد ثبت أن وسائل الإعلام السائلة يمكن أن تصل إلى 24 ساعة لكي تتوازن مع الغلاف الجوي تكوين الغاز 36. لذلك، يجب أن تكون مثقف الخلايا لمدة 24 ساعة في توافر الأكسجين المطلوب قبل تحلل، أو يمكن أن تكون مشروطة قبل وسائل الإعلام إذا كانت هناك حاجة حضانات أقصر. يتضمن تكييف قبل الحفاظ على وسائل الاعلام في محطة نقص الأكسجة لا يقل عن 24 ساعة في قارورة الثقافة العقيمة التي تتيح تبادل الغازات. أي حل المؤكسج التي أدخلت على الخلايا داخل محطة نقص الأكسجة قد يغير بسرعة مسارات الإشارات الخلوية مثل بدء الترجمة التي تعتمد على الغطاء الذي يتم فحصها في هذا البروتوكول. نظرا لحساسية الممرات الاستشعار الأوكسجين في الخلايا، أي الحل الذي سوفالتفاعل مع الخلايا السابقة للتحلل مثل برنامج تلفزيوني والتربسين-EDTA يجب أن تكون مشروطة مسبقا أيضا لا يقل عن 24 ساعة. يجب استخدام تحلل وغسل ما بعد تحلل المخازن الباردة وبالتالي فهي ليست مشروطة مسبقا في ال 37 درجة مئوية نقص الأكسجة محطة العمل. في حين أن بعض التعديلات التي تعتمد على الأكسجين إلى البروتينات يمكن أن تكون نشطة بعد تحلل، يطلب من المخازن الباردة للحد من الأنشطة الإنزيمية و "خلط" مجمعات البروتين البروتين أو بروتين-RNA التي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية. وهناك تعديل على هذا البروتوكول إلى زيادة التشدد قد يكون ما قبل حالة تحلل وغسل ما بعد تحلل المخازن لمدة 24 ساعة ثم احتضان لهم على الجليد داخل محطة العمل قبل الاستخدام. لا ينبغي أن تظل وسائل الإعلام ومخازن في محطة نقص الأكسجين لأكثر من ثلاثة أيام لأن هذه الحلول سوف يركز المقرر أن تبخر المياه. للدراسات على المدى الطويل (> 3 أيام)، ومبلغ أولي قدره خلايا المصنف يجب أن تدرس بعناية. كما انقسام الخلايا ومساحة سطح الطبق يصبح مزدحما،ضغوط أخرى مثل تحمض سائل الإعلام يمكن أن يؤثر على نشاط البروتينات ملزم الغطاء. في اليوم الأخير من التجربة، يجب أن يكون خلايا confluency من 80-90٪.

هناك أربع خطوات حاسمة في هذا البروتوكول: الحفاظ على الخلايا في محطة نقص الأكسجة حتى تحلل، وكمية من الخلايا المستخدمة، وغسل الخرز، والسيطرة غير ميثليته GTP. 1) هناك عدة طرق للحفاظ على الخلايا في انخفاض الأكسجين. معظم هذه تشمل غرف صغيرة التي يمكن أن تعقد أطباق زراعة الخلايا الوحيدة، ولكن يجب أن يتم تنفيذ أي تلاعب أو خلية تحلل خارج قاعات في الهواء المحيط. يتم تنشيط مكونات آلات الاستشعار الاوكسجين مثل العوامل نقص الأكسجين محرض أو المعطل في غضون دقيقة أو اثنتين 35. لذلك، وكما ذكر سابقا، الناشر الخلايا في محطة نقص الأكسجة أمر بالغ الأهمية لضمان نشاط البروتينات ملزم سقف يرتبط مع توافر الأكسجين منها. 2) عدد الخلاياواقترح في هذا البروتوكول (اثنان 150 أطباق ملم) غير كافية لم قوي 7 GTP interactors مثل الأسرة eIF4E أو أعضاء eIF4F مجمع (eIF4A وeIF4G). المزيد من الخلايا، ما لا يقل عن خمسة 150 أطباق ملم، يمكن أن تكون هناك حاجة للكشف عن البروتينات مع التفاعلات عابرة أو أن الزميلة الوحيد مع م 7 غطاء GTP مرنا خلال eIF4F. 3) غسل حبات بعد تفرخ لهم مع المحللة الخلية لا يمكن أن يؤديها بطريقة صارمة وأقل صرامة. بروتوكول المعروضة هنا يقدم خيار صارمة حيث يتم استخدام تحلل العازلة لتغسل حبات خمس مرات. إذا البروتينات مع التفاعلات الضعيفة لسقف ملزم البروتينات من الفائدة، يمكن للمرء أن أداء أقل يغسل والاستفادة مخزنة المالحة تريس، بدلا من تحلل العازلة. 4) في حين أنه من المهم قبل مسح الخلايا المحللة مع اللامقترن الاغاروز لإزالة البروتينات التي تتفاعل غير تحديدا مع حبة، بعض البروتينات ملزم سقف لا يمكن التفريق بين هيكل سقف مرنا صحيح، GTP الميثيلي (م7 GTP)، وGTP غير ميثليته. واحدة من هذه البروتينات هو eIF4E نديد eIF4E3 44. سوف يبلغ حجمه حبات مع GTP طرد أي البروتين الذي يعترف أيضا GTP غير الميثيلي، والتي يمكن أن تكون ذات فائدة. أهمية بيولوجية من البروتينات التي تعترف كل من م 7 GTP ولها GTP بعد أن توضح تماما. وأكد ذلك من خلال عدد قليل من المنشورات التي تنطوي على eIF4E3 (وهو حسن النية ملزم غطاء البروتين مع مجال ملزم غطاء الحفاظ) نسبة إلى البروتينات eIF4E وeIF4E2، والتي لا تعترف م 7 GTP من GTP غير ميثليته.

هذه التقنية، كما وردت، لا يمكن أن يؤديها كنهج المستهدفة لتحديد م 7 interactors GTP من الفائدة أو نهج واسع من خلال تحليل GTP شطافة م 7 عن طريق قياس الطيف الكتلي. يمكن أن العديد من التقنيات الأخرى تتبع التعرض physioxic (بروتوكول 4) لتحليل النشاط ملزمة غطاء مثل تجزئة التحت خلوية، المناعي، وشارك في مناعي، لتحليل polysome الثانية. السيطرة متعدية يبرز بوصفه مساهما يساوي التعبير الجيني كما النسخ. باستخدام هذه التقنية لتحقيق النشاط وتكوين المجمعات ملزم سقف وتسليط الضوء على كيفية تنظيم يتوقف الحد الأقصى للبدء الترجمة في استجابة لانخفاض الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  3. Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
  4. Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
  5. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
  6. Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
  7. Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
  8. Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
  9. Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
  10. Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
  11. Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
  12. Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
  13. Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
  14. Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
  15. Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).
  16. Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
  17. Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
  18. Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
  19. Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
  20. Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
  21. Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
  22. Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
  23. Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
  24. Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
  25. Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
  26. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
  27. Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
  28. Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
  29. Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
  30. Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
  31. Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
  32. Gleadle, J., Ratcliffe, P. Hypoxia. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).
  33. Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
  34. Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
  35. Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
  36. Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
  39. Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
  40. Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
  41. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  42. Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
  43. Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
  44. Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).

Tags

علم الوراثة، العدد 118، الترجمة، مرنا، م
تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, … More

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter