Neuroscience

Laster et kalsiumfargestoff inn i froskens nerveender gjennom nervestubben: Kalsiumtransientregistrering i Frog Neuromuscular Junction

Published: July 8, 2017 doi: 10.3791/55122

Dmitry V. Samigullin^1,2,3, Eduard F. Khaziev^1,2,3, Nikita V. Zhilyakov^1,2, Ellya A. Bukharaeva^1,2, Eugeny E. Nikolsky^1,2,4

¹Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, ²Open Laboratory of Neuropharmacology, Kazan Federal University, ³Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, ⁴Department of Medical and Biological Physics, Kazan State Medical University

Summary

Her beskriver vi en metode for å legge et kalsiumsensitivt fargestoff gjennom frøens nervestub i nerveenden. Vi presenterer også en protokoll for opptak og analyse av hurtige kalsiumtransienter i perifere nerveender.

Abstract

En av de mest gjennomførbare metodene for å måle presynaptiske kalsiumnivåer i presynaptiske nerverminaler er optisk opptak. Det er basert på bruk av kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoffer som endrer sin utslippsintensitet eller bølgelengde, avhengig av konsentrasjonen av fritt kalsium i cellen. Det er flere metoder som brukes til å plette celler med kalsiumfarger. Mest vanlige er prosessene for å legge fargestoffene gjennom en mikropipett eller forinkubering med acetoksymetylesterformene av fargestoffene. Imidlertid er disse metodene ikke helt gjeldende for nevromuskulære veikryss (NMJ) på grunn av metodologiske problemer som oppstår. I denne artikkelen presenterer vi en metode for lasting av et kalsiumsensitivt fargestoff gjennom frosknervenstubben av frosknerven inn i nerveenden. Siden innføring av eksternt kalsium i nerverterminaler og den påfølgende bindingen til kalsiumfargestoffet forekommer innen millisekundskalaen, er det nødvendig å bruke et hurtigbildesystem for å registrere disse interaksjonenens. Her beskriver vi en protokoll for registrering av kalsiumtransienten med et raskt CCD-kamera.

Introduction

Kalsiumioner (Ca ²⁺ ) deltar i mange nevrale signaliseringsprosesser, inkludert initiering, vedlikehold og plastisitet av mediatorutgivelsen ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Ved ankomsten av handlingspotensialet går ekstracellulær Ca2 ⁺ inn i nerveterminalen og initierer frigivelse av nevrotransmitter. I noen synapser kan kalsiumstrømmen måles direkte ved hjelp av elektrofysiologiske metoder ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . I tilfelle av det nevromuskulære veikrysset (NMJ), kan man ikke bruke direkte patch clamp og to-elektrode spenningsklemme teknikker på grunn av minuttet størrelse av nerveender.

Opptak av innvendige Ca ²⁺ strømmer fra nerveender i NMJ kan gjøres ved indirekte elektrofyserIologiske metoder ⁹ ^, ¹⁰ . Imidlertid krever disse metodene forbehandling av synapset med natrium- og kaliumionkanalblokkere. Optiske metoder krever ikke den farmakologiske separasjonen av ionstrømmer i nerveterminalen og tillater opptak av Ca ²⁺ tilstrømning, utløst av virkningspotensialer og den etterfølgende forhøyning av Ca ^{2 +} -ioner i aksoplasma ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ . Disse metodene er basert på opptak av endringer i fluorescensen av bestemte Ca2 ⁺ -følsomme fargestoffer ved binding av frie Ca2 ⁺ -ioner ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ .

Ca ^{2 +} indikatorer kan lastes inn i cElls gjennom en rekke metoder, avhengig av formålet med eksperimentet. Forskere bruker badapplikasjon av membran-permeable fargestoff ²⁰ ^, ²¹ , lasting via patch pipette ²² eller mikroinjeksjon ²³ ^, ²⁴ ^, ²⁵ . Imidlertid har alle disse metodene noen begrensninger når det gjelder NMJ på grunn av sine særegenheter i synaptisk arkitektonikk. For NMJ er den mest hensiktsmessige og vellykkede metoden å laste fargestoffet gjennom nervestubben, en fremfyllingsmetode ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ²⁹ . Denne teknikken kan brukes til å laste forskjellige fluorescensfarger inn i perifere nerveender. Denne metoden ble vellykket brukt for Drosophila nerve terminaler ²⁸ , firbenet motor nerve²⁸ og froskmotorens nerve terminaler ¹⁷ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ³⁰ . Avhengig av objektet som er studert, kan metodiske detaljer variere. En glassmikro-pipette kan anvendes for små nerver fra larver ²⁸ . Flere forskere har beskrevet en metode ²⁷ ^, ²⁸ hvor en nykuttet ende av nerven som innerverer en muskel, er nedsenket i en brønn som er fulle av et fargestoff. Preparatet blir deretter igjen i flere timer for å suge fargestoffet. Fargen er fuktet opp av axonene og transporteres til nerve terminalene. I dette papiret beskriver vi en metode for å legge inn en fluorescensindikator i frømotorens nerve terminaler gjennom nervestubben. Vår protokoll bruker en plastpipettespiss for inkubering av vevet med et fargestoff. Vi beskriver også hvordan å anskaffe og analysere Ca ²⁺ fluorescens transients.

Protocol

Eksperimenter ble utført på isolerte nervemuskulære preparater av musculus kutan pectoris fra Rana ridibunda frosken. Størrelsen på begge kjønnens dyr var ca. 5-9 cm. Forsøksprosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjene for bruk av laboratoriedyr fra Kazan Federal University og Kazan Medical University, i samsvar med NIHs guide for pleie og bruk av laboratoriedyr. Den eksperimentelle protokollen oppfylte kravene i Europarådets rådsdirektiv 86/609 / EØF og ble godkjent av etisk komité i Kazan Medical University.

1. Forberedelse av løsningene

Fremstilling av Ringers løsning.
1. Klargjør Ringers løsning: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03 og 1,8 mM CaCl2. Juster pH til 7,2-7,4.
2. Forbered Ringers løsning med lav Ca ²⁺ 2+ innhold: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHC03, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Juster pH til 7,2-7,4.
Fremstilling av fargestoffløsningen.
1. Forbered den vannbaserte oppløsningen som inneholder HEPES-Na ved 10 mM (pH 7,2-7,4).
2. Tilsett 14 μl av HEPES-oppløsningen til et hetteglass med fargestoffet ³⁰ .
  MERK: Ca ²⁺ -indikatorfargen kommer i et 500 μl hetteglass med 500 μg pulver.
3. Vortex og spinn ned for å blande grundig.
4. Fortynn løsningen for å bringe den endelige konsentrasjonen av Ca ²⁺ -indikatoren ned til 30 mM. Unngå eksponering for lys og lagre ved -20 ° C.

2. Fargestoffprosedyre

Dissect den kutane pectoris muskel med et stykke av pectoralis proprius nerve.
MERK: Disseksjonsprosedyren er tilgjengeligI en gratis nedlasting av papiret av Blioch et al. , 1968 ³¹ .
1. For disseksjonsprosedyren, bruk to fine tang og hornhinnen saks (se Materialetabellen ). Overfør det dissekerte vevet til en silisiumelastomert belagt petriskål, ferdigfylt med Ringers løsning, og fest vevet med fine rostfritt stålpinner slik at det er litt strukket i parabolen.
2. Påfyll Petri-tallerken med en ny del av Ringers løsning. Fjern bindevevet. Ikke skade nerven.
Klargjør fyllingspipetten: Bruk et knivblad, kutt ut et ~ 2 mm langt stykke av den koniske delen av en vanlig plast 10 μL pipettespiss.
Forbered et stykke modelleringsleir for å montere fyllingspipetten på petriskålen.
Koble baksiden av påfyllingspipetten til en plastikksprøyte via silikonrør og plastforbindelsesadaptere laget av pipettespisser.
Før dI lastingsprosedyren, fjern ringerens løsning fra petriskålen ved hjelp av en plastpipette. Tørk muskel-nervepreparatet ved hjelp av en fin sprøyte; Dette vil forhindre fortynning av Ca ²⁺ -fargen ved påfølgende fylling av fyllingspipetten.
Fjern Ca ²⁺ -hetteglasset fra fryseren og la det tine ved romtemperatur på et mørkt sted.
Under stereomikroskopkontroll med lav forstørrelse (10 ×), oppdag krysset mellom muskel og nerve. Med fine pincett og saks, kutt pectoralis propriusnerven nær muskeloverflaten (se trinn 2.1). La en nervestubbe være ca 2 mm lang.
Fest påfyllingspipetten festet til slangen og sprøyten på petriskålen ved hjelp av modelleringsleir.
Flytt pipettens spiss nær nervestubben.
Uten å klemme den, forsiktig aspirere nervestubben i spissen av fyllingspipetten.
Fjern sugeslangen fra blunkenT-enden av fyllingspipetten.
Fjern forsiktig løsningen fra fyllingspipetten ved hjelp av en sprøyte med en lang nål (se Materialebordet ). Ikke klem nervestubben.
Vertikalt løft toppen av fyllingspipetten litt, og hold nervestubben aspirert i spissen.
Isoler den aspirerte delen av nervestubben fra utsiden av fyllingspipettespissen ved hjelp av petroleumjell.
Tørk opp nervestubben som er isolert i fyllingspipetten om nødvendig: Sug forsiktig overflødig av løsningen fra fyllpipetten ved hjelp av en sprøyte med en lang nål.
Tegn 0,5 μL av fargestoffløsningen (se trinn 1) ved å bruke en pipette med en lang pipettespiss.
Sett forsiktig pipettespissen med påleggsoppløsningen i fyllepipetten. Skyll ut blandingen direkte på nervestubben.
Tapp den åpne enden av fyllingspipetten med petroleumjell.
Legg til en liten del av Ringers sOljing til Petri-tallerken for å holde preparatet vått.
Inkuber preparatet ved romtemperatur under mørke og våte forhold i 5 timer.
Fjern påfyllingspipetten med påleggsvæske, skyll preparatet med Ringers løsning, og hold det over natten i kjøleskapet ved 8 ° C.

3. Klargjøre vevet for mikroskopi

Monter preparatet i silisiumelastomerbelagt kammer og fest det med stålmikronåler slik at den er litt strukket.
Skyll vevet med en alikvot av fersk Ringer-løsning.
Bruk en sugelektrode for å stimulere nerven; Konstruksjon av elektroden er tilgjengelig fra gratis nedlasting av papiret av Kazakov et al. , 2015 ³² . Plasser elektrodespissen i nærheten av den nede ende av nerveen og aspirer nervestubben inn i elektrodeåpningen.
Monter forberedelseskammeret på mikroskopetrinnet. PlacE temperaturføleren og innløps- og utløpsventilene i kammeret.
Koble strømledningen til Peltier-elementet.
For å overfylle preparatet, bruk et enkelt tyngdekraften-drevet system. For å fjerne overflødig løsning, slå på perfusjonssugepumpen.
Slå på termokontrollenheten.
Still temperaturkontrollen til 20 ° C.
Monter ultrafiolett beskyttelsesskjold.
Koble den stimulerende ledningselektroden til den elektriske stimulatoren og observere de muskulære sammentrekningene under mikroskopet med en 4x objektivlins.
Fyll perfusjonssystemet med Ringers løsning med lavt innhold av Ca ²⁺ og høy Mg ²⁺ .
MERK: Denne løsningen brukes til å forhindre muskelkontraksjoner. En reduksjon av konsentrasjonen av eksternt kalsium og en forhøyning av eksternt magnesium resulterer i reduksjon av amplituden av Ca2 ⁺ transienter. Imidlertid, basert på tidligere erfaring, 0,9 mM CaCl2 2+ transienter. Det er verdt å nevne at det finnes noen andre måter å redusere muskulære sammentrekninger uten å redusere Ca ²⁺ -konsentrasjonen. For eksempel vil bruken av d-tubocurarin eller alfa-bungarotoxin, spesifikke blokkere av nikotinacetylkolinreseptorer, helt eller delvis blokkere muskelforstyrrelser ¹⁷ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ^30. Men tillegget av disse toksinene kan også påvirke presynaptisk kalsiuminngang ³³ . For å unngå dette kan μ-konotoxin GIIIA brukes ²⁷ .
Slå på pumpen og start superfusjonen av preparatet med Ringers løsning med lav Ca ²⁺ og høy Mg ²⁺ .
Bytt til 40 × objektivlinsen på mikroskopet.
Slå på t Han monochromator (se Materialebordet ).
Velg en utslippsbølgelengde på 488 nm og en kontinuerlig belysningsfunksjon i monokromatorstyringsprogramvaren.
Under høy forstørrelse i fluorescensmodus, sørg for at nerve terminaler ble lastet med fargestoffet.

Figur 1
Figur 1 : Nerve og terminaler med lastet Ca ²⁺ indikator. ( A ) Nerve fylt med Ca ²⁺ indikator etter lastingsprosedyren. Skalestang = 200 μm. ( B ) Nerveendinger fylt med Ca ²⁺ indikator. Skalbjelke = 20 μm. ( C ) Ca ²⁺ -indikatorfluorescens er tydelig synlig i nerveenden. Skalbjelke = 20 μm._blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

La preparatet balansere i minst 30 minutter i lav-Ca ²⁺ og høy-Mg ²⁺ -oppløsningen.

4. Videoopptak med det digitale CCD-kameraet

Merk: Detaljene for å fange fluorescenssignaler er spesifikke for hvert mikroskop og kameratype, men nøkkelhensikten er bildeopptakshastigheten.

Bruk 1 kHz som minstekrapsfrekvens for opptak av enkelt Ca ²⁺ transienter i NMJ.
MERK: Hurtige digitale CCD-kameraer er nødvendige for fluorescensbilder (se Materialebordet ). Datainnsamlingssystemet og programvaren (se Materialetabellen ) ble brukt her for synkronisering av kameraet, monochromatoren og stimulatoren. Kort sagt, tillater denne protokollen generering av synkroniseringsimpulser på digitale utdata av dataeneOppkjøpssystem for å åpne lukkeren, fange videosignalet og initiere stimulering. Alle tidsmessige parametere kan settes i protokollene og / eller på apparatene. En typisk protokoll er en serie på 500 rammer som er anskaffet ved 1 kHz (80 x 80 piksler). Belysning med eksitasjonslys kan blege ut Ca ²⁺ -indikatoren og fotodamere cellevevet. Dermed unngås lange eksponeringer til eksitasjonslys. I denne protokollen er lukkeren åpen kun for den tiden det trengs for å ta opp videoen. Oppnå tjue serier per spesifikk nerve terminal. Målet her er å overvåke de samme stedene i kontrollgruppen og etter legemiddellevering.
Under 4X objektivlinsen i et mikroskop, bruk lysstyringsregimet til å visualisere muskel- og nervegrenene.
Bytt til 40X objektivlinsen, og bruk epifluorescensregimet og en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm for å søke etter fargelastede nerveender. Identifiser en nerveendende region av interesse.
På trinokulært rør oF mikroskopet, velg lysbaneutvekslingsnivåene: 100% lys til kamera.
Start oppkjøpsprogramvaren for CCD-kameraet.
Under "Live" -modus, finn avkastningen og juster fokuset.
Velg menyen "Endre" innstillinger.
Bruk "Grunnkonfigurasjon" til 1000 bilder per sekund (fps), med en oppløsning på 80 x 80.
Angi antall inngangsrammer til 500.
Skriv inn navnet på eksperimentet.
Velg "Ekstern utløser".
Still inn pre-trigger-tiden til 10 ms.
Sett antall repetisjoner til 20.
I monochromator-kontrollprogramvaren velger du en utslippsbølgelengde på 488 nm og "ekstern utløserbelysning" -modus.
Kjør datainnsamlingsprogramvaren.
Last inn stimuleringsprotokollen.
Før du tar opp videoen, tar du opp den mørke rammen ved hjelp av videoopptaksprogramvaren.
Kjør stimuleringsprotokollen.
Velg avkastning og checK det innspillte signalet.

5. Dataanalyse

NoOTE: For data analyse, bruk CCD kamera programvare og ImageJ; Dataene er representert som en kurve i et regnearkprogram. I CCD-kameraprogramvaren gjentar gjennomsnittet 20 og eksporterer resultatene til en ImageJ-støttefil. I ImageJ velger du avkastning og bakgrunn. Trekk bakgrunnen fra avkastningen. Represent dataene som et forhold: (ΔF / F 0-1) x 100%, hvor er ΔF er intensiteten av fluorescens under stimulering og F0 er intensiteten av fluorescens i hvile.

I oppkjøpsprogramvaren for CCD-kameraet, klikk på Fil> Gjennomsnittlige filer. Velg filene og gjennomsnitts dem.
Lagre gjennomsnittsfilen som en .fit-fil ved å klikke "Lagre som passordfil".
Kjør ImageJ-programvaren. Utfør følgende trinn:
Klikk på Bilde> juster> lysstyrke / kontrast.
Klikk på Bilde> Stabler> Verktøy>; Stakk sorterer.
Klikk Analyse> verktøy> Avkastningsbehandler.
Dra og slipp den gjennomsnittlige .fit-filen i ImageJ-vinduet.
Zoom inn på vinduet for en bedre visning.
Ved å flytte markøren, velg den siste rammen og slett den (dette er den mørke rammen)
Velg en rektangulær avkastning over området som antas å være bakgrunnen. Legg det til avkastningsbehandleren
Mål bakgrunnen ved å klikke på Mer> Multi Measure. Legg merke til MEAN. Kopier dataene, eksporter den til et regnearkprogram, og beregne gjennomsnittsverdien av terskelen for et forhold.
Trekk terskelen fra stablene ved å klikke på Prosess> Hoved> Trekke fra. Angi gjennomsnittsverdien av terskelen.
Velg en rektangulær avkastning rundt en nerve terminal. Legg det til avkastningsbehandleren.
Mål ved å klikke på Mer> Multi Measure. Legg merke til MEAN. Kopier og eksporter den til et regnearkprogram.
Gjennomsnittlig offset av signalene.
MERK: BrukFørst flere dusin poeng viser basfargestoff fluorescens uten stimulering; Dette er fluorescens i ro.
Del signalene ved fluorescens i hvile.
Trekk "1" og multipliser med 100%.
Plot signalet og beregne amplituden til Ca ²⁺ forbigående.

Representative Results

Etter fargestoffbelastningen og ved motorens nervestimulering kan en økning i amplitude av det fluorescerende signalet (Ca ²⁺ forbigående) detekteres i nerve terminaler (se figur 2 ). Parametre for Ca ²⁺ transienter er presentert i tabell 1 . Kvantitativt er parametrene for Ca ²⁺ transientene målt i vår studie nær dataene fra andre forskere ved synapser av kaldblodige dyr ¹⁵ ^, ³⁴ . Parametrene for Ca2 ⁺ -transientene avhenger av bindingshastigheten av Ca2 ⁺ med fargestoffet og den påfølgende dissosiasjon. Inntakshastigheten for Ca ²⁺ i nerveenden, interaksjon med fargestoffet og diffusjon i cytoplasma påvirker alle stigningstiden for Ca ²⁺ forbigående. Forfallstidspunktet for det fluorescerende signalet avhenger av fargestoffets affinitet,Hastigheten på Ca ²⁺ -interaksjonen med intracellulære buffere og fjerning av ionpumper ³⁵ . Amplitudanalysen av Ca ²⁺ transienter kan brukes til å studere innflytelsen av forskjellige stoffer på kalsiuminngangen som deltar i nevrotransmitterfrigivelse ³³ .

Figur 2
Figur 2 : Den gjennomsnittlige Ca ²⁺ Forbigående målt i frosken NMJ. Ca ²⁺ forbigående ble beregnet ut fra gjennomsnittet av signaler fra 13 frosk NMJs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

ToppΔF / F (%)	Stigningstid 20% -80% (ms)	T (ms)
12,6 ± 1,1 (n = 13)	4,6 ± 0,5 (n = 13)	115,3 ± 8,3 (n = 13)

Tabell 1: De gjennomsnittlige parametrene for Ca ²⁺ forbigående. Dataene presenteres som gjennomsnittet ± SE; N er antall målinger i forskjellige NMJer. Høyden ΔF / F er den gjennomsnittlige amplituden av ΔF / F.

Discussion

I dette papiret presenterte vi metoden for å utføre Ca ²⁺ -følsom fargestoffpåføring i frøenes nerveender gjennom nervestubben. Ved slutten av lastingsprosedyren har alle terminaler i den proximale delen av nerve betydelige fluorescensnivåer. Det har blitt anslått at den intra-terminale konsentrasjonen av sonden varierer mellom 40 og 150 uM ¹⁷ .

Inkubasjonsprosedyren utføres i to trinn: ved romtemperatur og deretter ved lavere temperatur i kjøleskap. Det er viktig å kontrollere tiden for vevsinkubasjon med fargestoffet ved romtemperatur. Avhengig av den faktiske lengden på nervestubben, det spesifikke fargestoffet og temperaturen, kan inkubasjonstiden variere. Hvis overeksponert, kan terminaler i proksimale deler nær nervestubben overbelastes. Imidlertid er det i midten av nerven fortsatt mulig å finne terminaler som er tilfredsstillende lastet. Under thEn lang inkubasjon i kjøleskapet, fargestoffet er jevnt fordelt over nerveenden.

Våre egne observasjoner ³³ ^, ³⁵ , samt data fra andre forskere ³⁰ , viser mangelen på noen vesentlig innflytelse av belastningsprosedyren på amplituden til den postsynaptiske responsen eller på hyppigheten av miniatyrplattformpotensialer. God levetid ble dokumentert i de lastede forberedelsene. Det er noen viktige poeng vi ønsker å trekke oppmerksomhet på. Det er svært viktig å plassere nervestubben i fargestoff-oppløsningen i løpet av minutter etter eksisisjon for å muliggjøre at fargestoffet kommer inn i aksen av kuttnerven; Forsinkelser kan forårsake ineffektiv belastning, antagelig på grunn av tilbakestilling av nerveaksoner ²⁷ ^, ³⁶ . Noen undersøkere nedsetter nervestubben i 100 mM EDTA (en Ca ²⁺ - og Mg ²⁺ -chelator) Umiddelbart etter ekskreksjon av nerve for å hindre at kuttaksonene fjernes. Bufferen fjernes etter 1-2 minutter og erstattes med en fargestoffløsning ³⁷ . Bruken av en petroleumsjelksbrønn i stedet for plastrør for lastingsprosessen tillater bruken av en kortere nervestubbe. Ved bruk av denne tilnærmingen kuttes nerveen etter at den er nedsenket i HEPES-løsningen med fargestoff, og axonene fortar ikke på grunn av mangelen på divalente ioner i fargeløsningen ²⁷ ^, ²⁸ .

I vår studie brukte vi den vannløselige saltformen av Ca ²⁺ -indikatoren i stedet for dextran. Dextran-konjugatene diffundere i axonen langsommere enn saltformene. Bruken av dextran-konjugatet reduserer imidlertid fargekammerjonalisering og håndtering av nerve og NMJ. Kalsiumgrønn 1-3000 MW dextran-konjugat har en god diffusjonshastighet og demonstrerer redusert compartmentalisering Opp klasse = "xref"> 38.

Det er veldig viktig å unngå en lang periode med fluorescerende belysning av vevet, fordi dette påvirker helsen og overlevelse. Vi bruker Nomarski optikk i synlig lys kanal for å søke etter nerve terminaler. Under opptaket begrenser vi det opplyste feltet ved hjelp av en membran.

Det er bemerkelsesverdig at denne belastningsmetoden kun er egnet for preparater som tåler lange inkubasjoner. For å redusere fargestofftiden når studier utføres på mer skjøre vev ( f.eks. Synapser av varmblodige dyr), er det nødvendig å nedskalere nervestumplengden og bruke mikropipetter for å legge ²⁹ ^, ³⁹ .

Denne belastningsteknikken er godt egnet for bildebehandlingendringer i cytosolisk Ca ²⁺ , med fluorescerende indikatorer under både enkeltnervenstimulering og rytmisk synaptisk aktivitetEf "> 17 ^, ²⁷ ^, ^35. Analysen av Ca ²⁺ -transientamplituden kan brukes til å studere påvirkning av forskjellige stoffer på kalsiuminngangen som deltar i nevrotransmitterfrigivelse ³³ .

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne undersøkelsen ble utført under den russiske regjeringens program for konkurransedyktig vekst av Kazan Federal University og et tilskudd fra Russian Foundation for Basic Research (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Vi takker fire anonyme anmeldere for å gi nyttige kommentarer til tidligere utkast til manuskriptet. Vi uttrykker vår takknemlighet til Yuliya Aratskaya for stemmeopptaket. Vi er takknemlige for Dr. Victor Ilyin for de mange nyttige kommentarene og hjelpen med manuell redigering av manuskriptet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca2+ indicator	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806	500 μg
Silicone Elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184 elastomer
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
Pipette tip	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10µL
Razor Blade	Fisher Scientific, USA	12-640
Minutien Pins	Fine scince tools, Canada	26002-20
Corneal Mini-Scissors	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
Modelling clay	local producer		can be replaced by any local producer
Petroleum jelly	local producer		can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400	Biosan, Latva	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latva	BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40mm
Syrynge	local producer		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100ml
Microscope, BX51	Olympus, Japan
Data acquisition system	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
software	Molecular Devices, USA	pClamp software, Version 10	protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler	Experimental Builder		can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/
Monochromator	Till Photonics, Germany	Polychrome V	no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm
monochromator control software	Till Photonics, Germany	Polycon
Digital CCD camera	Redshirt imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera	Redshirt imaging, USA	Turbo SM software
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).
Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).
Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Neuroscience

Laster et kalsiumfargestoff inn i froskens nerveender gjennom nervestubben: Kalsiumtransientregistrering i Frog Neuromuscular Junction

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.