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Neuroscience

कैल्शियम डाई में मेंढक तंत्रिका अंत में तंत्रिका स्टंप के माध्यम से लोड करना: मेंढक न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में कैल्शियम क्षणिक पंजीकरण

Published: July 8, 2017 doi: 10.3791/55122
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, 2Open Laboratory of Neuropharmacology, Kazan Federal University, 3Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, 4Department of Medical and Biological Physics, Kazan State Medical University

Summary

यहां, हम तंत्रिका अंत में मेंढक तंत्रिका स्टंप के माध्यम से एक कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम परिधीय तंत्रिका अंत में तेजी से कैल्शियम यात्रियों के रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

प्रीसीनेप्टिक तंत्रिका टर्मिनलों में प्रीसीनप्टिक कैल्शियम स्तर को मापने के सबसे व्यवहार्य तरीकों में से एक ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग है। यह सेल में कैल्शियम मुक्त कैल्शियम की एकाग्रता के आधार पर कैल्शियम-संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करने पर आधारित है जो कि उनके उत्सर्जन की तीव्रता या तरंग दैर्ध्य को बदलते हैं। कैल्शियम रंगों के साथ कोशिकाओं को दाग करने के कई तरीके हैं। सबसे आम एक सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से रंगों को लोड करने की प्रक्रिया है या डाईस के एटेटोक्सीमाइथाइल एस्टर रूपों के साथ पूर्व-इनक्यूबेटिंग। हालांकि, उत्पन्न होने वाली विधि संबंधी समस्याओं के कारण इन विधियों को न्यूरोस्कुल्युलर जंक्शनों (एनएमजे) पर काफी लागू नहीं होता है। इस लेख में, हम तंत्रिका अंत में मेंढक तंत्रिका के मेंढक तंत्रिका के माध्यम से एक कैल्शियम-संवेदनशील डाई लोड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। तंत्रिका टर्मिनलों में बाह्य कैल्शियम के प्रवेश और कैल्शियम डाई के बाद बाध्य होने के बाद मिलीसेकंड समय-पैमाने के भीतर होते हैं, इसलिए इन इंटरैक्शन को रिकॉर्ड करने के लिए एक त्वरित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करना आवश्यक हैएनएस। यहां, हम एक तेज सीसीडी कैमरे के साथ कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्ड करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Introduction

कैल्शियम आयन (सीए 2 + ) मध्यस्थ रिहाई 1 , 2 , 3 , 4 , 5 की दीक्षा, रखरखाव और प्लास्टिक सहित कई न्यूरॉनल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं। कार्रवाई की क्षमता के आगमन पर, बाह्य Ca 2 + तंत्रिका टर्मिनल में प्रवेश करती है और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज शुरू करती है। कुछ अन्तर्ग्रंथियों में, कैल्शियम की वर्तमानता इलेक्ट्रोफिजिकल तरीके 6 , 7 , 8 द्वारा सीधे मापा जा सकता है। न्यूरोमस्क्युलर जंक्शन (एनएमजे) के मामले में, तंत्रिका अंत के मिनट के आकार के कारण किसी प्रत्यक्ष पैच क्लैंप और दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप तकनीक का उपयोग नहीं कर सकता।

एनएमजे में तंत्रिका अंत से आवक सीए 2 + धाराओं के रिकॉर्डिंग अप्रत्यक्ष इलेक्ट्रोफिज़ द्वारा की जा सकती हैंआईोलोलॉजिकल तरीके 9 , 10 हालांकि, इन विधियों के लिए सोडियम और पोटेशियम आयन चैनल ब्लॉकर्स द्वारा संकुचन के प्रीटाएमेंट की आवश्यकता होती है। ऑप्टिकल विधियों को न्यूर टर्मिनल में आयनिक धाराओं के औषधीय पृथक्करण की आवश्यकता नहीं होती है और सीए 2 + इन्वेक्स की अनुमति के लिए रिकॉर्डिंग की अनुमति होती है, जो ऐक्शन पोटेंशिअल से उत्पन्न होती है, और एक्सओप्लाज्म 11 , 12 , 13 , 14 में सीए 2+ आयनों की बाद की ऊंचाई। इन विधियों पर सीए 2 + -सेंटिव डायरेस के प्रतिदीप्ति में सीए 2 + आयनों 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 के बंधन पर परिवर्तन की रिकॉर्डिंग पर आधारित हैं।

सी 2 + संकेतक सी में लोड हो सकते हैंप्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न तरीकों के माध्यम से, शोधकर्ता झिल्ली-पारगम्य डाई फॉर्म 20 , 21 के स्नान अनुप्रयोग का प्रयोग करते हैं , पैच विंदुक 22 या माइक्रोिनजेक्शन 23 , 24 , 25 के माध्यम से लोड करते हैं। हालांकि, इन सभी विधियों में एनएमजे के मामले में कुछ सीमाएं हैं, जो अन्तर्ग्रथनी आर्किटेक्टोनिक्स में अपनी विशेषताओं के कारण हैं। एनएमजे के लिए, सबसे सुविधाजनक और सफल तरीका तंत्रिका स्टंप के माध्यम से डाई को लोड करना है, एक आगे-भरने की विधि 26 , 27 , 28 , 2 9 । परिधीय तंत्रिका अंत में विभिन्न प्रतिदीप्ति रंगों को लोड करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रोसोफिला तंत्रिका टर्मिनलों 28 , छिपकली मोटर तंत्रिका के लिए इस पद्धति का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया था28 , और मेंढक मोटर तंत्रिका टर्मिनल 17 , 26 , 27 , 30 अध्ययन के तहत वस्तु के आधार पर, व्यवस्थित विवरण भिन्न हो सकते हैं। लार्वा 28 से छोटी नसों के लिए ग्लास सूक्ष्म विंदुक का इस्तेमाल किया जा सकता है कई शोधकर्ताओं ने एक विधि 27 , 28 में वर्णित किया है जिसमें एक मांसपेशियों के तंत्रिका के तंत्रिका के एक नए कटौती के अंत में डाई से भली भांति भरी हुई है। तैयार करने के बाद डाई को भिगोने के लिए कई घंटों के लिए छोड़ दिया जाता है। डाई एक्सॉन द्वारा भिगोती है और तंत्रिका टर्मिनलों में ले जाया जाता है। इस पत्र में, हम तंत्रिका स्टंप के माध्यम से मेंढक मोटर तंत्रिका टर्मिनलों में प्रतिदीप्ति सूचक को लोड करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल एक डाई के साथ ऊतक के ऊष्मायन के लिए एक प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग करता है हम यह भी वर्णन करते हैं कि सीए 2 + फ्लोरोसेंटेंस ट्रे का अधिग्रहण और विश्लेषण कैसे करेंnsients।

Protocol

राणा रबीबुंडा मेंढक से मस्तिष्क क्यूटिक पेक्टोरिस के पृथक तंत्रिका-मांसपेशियों की तैयारी पर प्रयोग किया गया। दोनों लिंगों के पशुओं का आकार लगभग 5- 9 सेंटीमीटर था। प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं कज़ान संघीय विश्वविद्यालय और कज़ान मेडिकल विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार निष्पादित की गईं, प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुपालन में। प्रायोगिक प्रोटोकॉल ने यूरोपीय समुदाय परिषद 86/60 9 / ईईसी की आवश्यकताओं को पूरा किया और इसे कज़ान मेडिकल विश्वविद्यालय की एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. समाधान की तैयारी

  1. घंटी के समाधान की तैयारी
    1. घंटी के समाधान को तैयार करें: 113.0 मिमी NaCl, 2.5 मिमी का केएल, 3.0 मिमी 3 NaHCO 3 , और 1.8 मिमी CaCl 2 पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें।
    2. कम सीए 2+ के साथ घंटी के समाधान को तैयार करें 2+ सामग्री: 113.0 एमएम नाओक्ल, 2.5 एमएम केएलएल, 3.0 एमएम एनएचओओ 3 , 6.0 एमएम एमजीसीएल 2 , 0.9 एमएम CaCl 2 । पीएच को 7.2-7.4 में समायोजित करें।
  2. डाई लोडिंग समाधान की तैयारी
    1. 10 एमएम (पीएच 7.2-7.4) में हे-पीईएस-ना युक्त पानी आधारित समाधान तैयार करें।
    2. डाई 30 के साथ एक शीशी के लिए HEPES समाधान के 14 μL जोड़ें
      नोट: सीए 2 + इंडिकेटर डाई 500 μL शीशे में 500 ग्राम पाउडर के साथ आता है।
    3. भंवर और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए नीचे स्पिन।
    4. सीए 2 + इंडिकेटर की अंतिम एकाग्रता को 30 मिमी तक लाने के लिए समाधान को पतला करें -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और स्टोर के जोखिम से बचें

2. डाई-लोडिंग प्रक्रिया

  1. पेक्टोरेलिस प्रोप्रिएस तंत्रिका के एक टुकड़े के साथ चमड़े के पेक्टोरिस पेशी काटना।
    नोट: विच्छेदन प्रक्रिया उपलब्ध हैब्लियोक एट अल द्वारा पेपर के मुफ्त डाउनलोड में , 1 9 68 31
    1. विच्छेदन प्रक्रिया के लिए, दो ठीक संदंश और कॉर्नियल कैंची का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) विच्छेदित ऊतक को एक सिलिकॉन इलास्टोमेर-लेपित पेट्री डिश में रिंगर के समाधान से पहले से भरे स्थान में ट्रांसफर करें और ठीक स्टेनलेस स्टील पिन के साथ ऊतक को ठीक करें जैसे कि यह डिश में थोड़ा फैला है।
    2. रिंगर के समाधान के एक ताजा विभाज्य के साथ पेट्री डिश को फिर से भरें। संयोजी ऊतक निकालें तंत्रिका को नुकसान न करें
  2. भरने विंदुक तैयार करें: एक रेज़र ब्लेड का उपयोग करके, एक मानक प्लास्टिक 10 μL विंदुक टिप के शंक्वाकार भाग का ~ 2 मिमी-लंबा टुकड़ा कट।
  3. पेट्री डिश पर भरने विंदुक माउंट करने के लिए मॉडलिंग की मिट्टी का एक टुकड़ा तैयार करें।
  4. सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से एक प्लास्टिक सिरिंज को भरने विंदुक के पीछे और विंदुक युक्तियों से बने प्लास्टर को जोड़ने वाले एडाप्टर से कनेक्ट करें।
  5. डी से पहलेतु लोड प्रक्रिया, एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग पेट्री डिश से घंटी के समाधान को हटा दें। एक ठीक सिरिंज का उपयोग कर मांसपेशी तंत्रिका तैयारी सूखी; यह भरने विंदुक के बाद लोडिंग पर Ca 2+ डाई के कमजोर पड़ने को रोकेगा।
  6. फ्रीज़र से सीए 2 + इंडिकेटर शीयल निकालें और इसे अंधेरे जगह में कमरे के तापमान पर पिघलना करने दें।
  7. कम बढ़ाई (10 ×) के साथ स्टेरिओमोरिक्रोस्कोप नियंत्रण के तहत, मांसपेशियों और तंत्रिका के बीच का जंक्शन पता लगाता है। ठीक चिमटी और कैंची के साथ, मांसपेशियों की सतह के करीब पेक्टोरेलिस प्रोप्रिएस तंत्रिका काट (चरण 2.1 देखें)। 2 मिमी लंबे समय के बारे में एक तंत्रिका स्टंप छोड़ दें
  8. मॉडलिंग मिट्टी का उपयोग करके पेटी डिश पर टयूबिंग और सिरिंज से जुड़ी भरने वाली विंदुक को ठीक करें
  9. तंत्रिका स्टंप के करीब विंदुक की नोक को स्थानांतरित करें
  10. इसे छिड़कने के बिना, धीरे-धीरे भंग विंदुक के टिप में तंत्रिका स्टंप को महाप्राणित करना।
  11. धुंध से चूषण ट्यूबिंग निकालेंभरने विंदुक के टी अंत
  12. लंबी सुई ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके भरने वाली पिपेट से अतिरिक्त समाधान को ध्यान से हटा दें। नर्व स्टंप को चुटकी न दें
  13. ऊर्ध्वाधर रूप से टिप में aspirated तंत्रिका स्टंप रखने, थोड़ा भरने विंदुक की नोक उठाना।
  14. पेट्रोलियम जेली का उपयोग करते हुए भरने विंदुक टिप के बाहर से तंत्रिका स्टंप के महत्वाकांक्षी भाग को पृथक करें।
  15. यदि आवश्यक हो तो भरने विंदुक में पृथक तंत्रिका स्ट्रीप को सूखें: धीरे से एक लंबी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके भरने विंदुक से समाधान से अधिक की aspirate।
  16. लंबे विंदुक टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग करके डाई-लोडिंग समाधान के 0.5 μL (चरण 1 देखें) ड्रा।
  17. धीरे भरने विंदुक में समाधान लोड करने के साथ विंदुक टिप डालें। मिश्रण तंत्रिका स्टंप पर सीधे निकाल दें
  18. पेट्रोलियम जेली के साथ भरने वाली विंदुक के खुले अंत को सील करें।
  19. रिंगर के एस के एक छोटे से विभाज्य को जोड़ेंपेट्री डिश के लिए तैयारी गीला तैयारी रखने के लिए
  20. 5 घंटे के लिए अंधेरे और गीली स्थितियों के तहत कमरे के तापमान पर तैयारी को सेते हैं।
  21. लोडिंग समाधान के साथ भरने वाली पिपेट निकालें, घंटी के समाधान के साथ तैयारी को कुल्ला, और 8 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में इसे रात भर रखें।

3. माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक की तैयारी

  1. तैयारी सिलिकॉन इलास्टोमेर-लेपित कक्ष में माउंट करें और इसे स्टील सूक्ष्म सुई के साथ ठीक करें जैसे कि यह थोड़ी फैली हुई है।
  2. ताजा घंटी के समाधान के एक विभाज्य के साथ ऊतक को कुल्ला।
  3. तंत्रिका को प्रोत्साहित करने के लिए एक चूषण इलेक्ट्रोड का उपयोग करें; इलेक्ट्रोड का निर्माण कजाकोव एट अल द्वारा कागज के मुफ्त डाउनलोड से उपलब्ध है , 2015 32 तंत्रिका के कटौती के अंत के करीब इलेक्ट्रोड टिप की स्थिति और इलेक्ट्रोड छिद्र में तंत्रिका स्टंप को महाप्राणु बनाना।
  4. माइक्रोस्कोप मंच पर तैयारी कक्ष को माउंट करें। प्लेसमेंटकक्ष में तापमान जांच और प्रवेश और आउटलेट फायरिंग।
  5. Peltier तत्व को पावर कॉर्ड से कनेक्ट करें
  6. तैयारी को बेहतर बनाने के लिए, एक सरल गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्रणाली का उपयोग करें। अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए, छिड़काव चूषण पंप को चालू करें।
  7. थर्मामीटरों-नियंत्रक इकाई पर स्विच करें।
  8. तापमान नियंत्रण को 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें
  9. पराबैंगनी संरक्षण ढाल माउंट
  10. उत्तेजक तार इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रिक उत्तेजनाकार से कनेक्ट करें और एक 4x उद्देश्य लेंस के साथ माइक्रोस्कोप के तहत पेशी के संकुचन का निरीक्षण करें।
  11. कम-सीए 2+ और उच्च-एमजी 2+ सामग्री के साथ घंटी के समाधान के साथ छिड़काव प्रणाली को भरें।
    नोट: यह समाधान पेशी के संकुचन को रोकने के लिए किया जाता है। बाहरी कैल्शियम की एकाग्रता और सीए 2 + आयामों के आयाम में कमी के परिणामस्वरूप बाहरी मैग्नीशियम के परिणाम की वृद्धि। हालांकि, पिछले अनुभव के आधार पर, 0.9 एमएम CaCl 2 अभी भी सीए 2 + ट्रांसलेटर के आयाम को मज़बूती से हल करने के लिए पर्याप्त हैं। यह उल्लेखनीय है कि सीए 2 + एकाग्रता को कम करने के बिना पेशी के संकुचन को कम करने के कुछ अन्य तरीके मौजूद हैं.उदाहरण के लिए, डी-ट्यूबोकुररिन या अल्फा-बंगारोटॉक्सिन का उपयोग, निकोटीनिक एसिटिलकोलीन रिसेप्टर्स के विशिष्ट ब्लॉकर्स, पूरी तरह या आंशिक रूप से मांसपेशियों के मुड़ें 17 , 27 , 28 , 30। हालांकि, इन विषों के अलावा प्रीस्कैनाप्टिक कैल्शियम एंट्री को भी प्रभावित कर सकते हैं 33 । इस से बचने के लिए, μ-conotoxin जीआईआईआईए 27 का इस्तेमाल किया जा सकता है
  12. पंप पर स्विच करें और कम सीए 2+ और उच्च एमजी 2+ के साथ रिंगर के समाधान के साथ तैयार करने का सुपरफ़ायशन शुरू करें।
  13. सूक्ष्मदर्शी पर 40 × उद्देश्य लेंस पर स्विच करें।
  14. टी पर स्विच करें वह मोनोक्रोमेटर ( सामग्री की सारणी देखें)
  15. 488 एनएम के एक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य और मोनोक्रोमेटर कंट्रोल सॉफ़्टवेयर में रोशनी का एक निरंतर मोड चुनें।
  16. प्रतिदीप्ति मोड में उच्च बढ़ाई के तहत, सुनिश्चित करें कि तंत्रिका टर्मिनल डाई के साथ भरी हुई थी।

आकृति 1
चित्रा 1 : भारित Ca 2+ संकेतक के साथ तंत्रिका और टर्मिनल। ( ए ) लोडिंग प्रक्रिया के बाद सीए 2 + इंडिकेटर से भरा तंत्रिका स्केल बार = 200 माइक्रोन ( बी ) Ca 2+ संकेतक से भरा तंत्रिका अंत स्केल बार = 20 माइक्रोन ( सी ) सीए 2+ -इंडिकेटर प्रतिदीप्ति तंत्रिका समापन में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। स्केल बार = 20 माइक्रोन_blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. तैयारी को कम-सीए 2+ और उच्च-एमजी 2 + समाधान में कम से कम 30 मिनट तक संतुलित करने की अनुमति दें।

4. डिजिटल सीसीडी कैमरा के साथ वीडियो कैप्चर

नोट: प्रतिदीप्ति संकेतों को कैप्चर करने के विवरण प्रत्येक माइक्रोस्कोप और कैमेरा प्रकार के लिए विशिष्ट हैं, लेकिन महत्वपूर्ण विचार छवि कैप्चरिंग स्पीड है।

  1. एनएमजे में सिंगल सीए 2+ ट्रांजिन्टरों की रिकॉर्डिंग के लिए न्यूनतम कैप्चर आवृत्ति के रूप में 1 kHz का उपयोग करें।
    नोट: प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए फास्ट डिजिटल सीसीडी कैमरे आवश्यक हैं ( सामग्री की तालिका देखें) डेटा अधिग्रहण प्रणाली और सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग यहां कैमरे, मोनोक्रोमेटर, और उत्तेजक औजार के सिंक्रनाइज़ेशन के लिए किया गया था। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल डेटा के डिजिटल आउटपुट पर सिंक्रनाइज़ेशन दालों की पीढ़ी की अनुमति देता हैशटर खोलने के लिए अधिग्रहण प्रणाली, वीडियो संकेत कैप्चर करें, और उत्तेजना आरंभ करें। सभी अस्थायी मापदंडों को प्रोटोकॉल और / या उपकरण पर सेट किया जा सकता है। एक विशिष्ट प्रोटोकॉल 1 kHz (80 x 80 पिक्सल) में प्राप्त 500 फ़्रेमों की एक श्रृंखला है। उत्तेजना के प्रकाश के साथ रोशनी Ca 2+ सूचक को बाहर ब्लीच कर सकते हैं और सेल ऊतक को फोटोडैमेज कर सकते हैं। इस प्रकार, उत्तेजना प्रकाश के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचें। इस प्रोटोकॉल में, शटर केवल वीडियो को कैप्चर करने के लिए आवश्यक समय के लिए खुला है। प्रति विशिष्ट तंत्रिका टर्मिनल के लिए बीस श्रृंखला प्राप्त करें। इसका उद्देश्य नियंत्रण समूह में एक ही साइटों की निगरानी करना और दवा वितरण के बाद है।
  2. माइक्रोस्कोप के 4 एक्स उद्देश्य लेंस के तहत, मांसपेशियों और तंत्रिका शाखाओं को देखने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र के शासन का उपयोग करें।
  3. 40 एक्स उद्देश्य लेंस पर स्विच करें और, एफ़िफ्लोरेसेंस शासन का उपयोग करें और 488 एनएम की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, डाई लोडेड तंत्रिका अंत की खोज करें। रुचि के एक तंत्रिका-अंत क्षेत्र को पहचानें
  4. त्रिकोणीय ट्यूब ओ परमाइक्रोस्कोप च, प्रकाश पथ विनिमय स्तर चुनें: 100% कैमरे के लिए प्रकाश।
  5. सीसीडी कैमरा के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें
  6. "लाइव" मोड के अंतर्गत, ROI को ढूंढें और फ़ोकस समायोजित करें।
  7. मेनू "बदलें" सेटिंग्स का चयन करें
  8. 1000 फ़्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) पर "मूल कॉन्फ़िगरेशन" का उपयोग करें, जिसमें 80 x 80 का संकल्प है।
  9. इनपुट फ्रेम्स की संख्या को 500 पर सेट करें
  10. प्रयोग का नाम दर्ज करें।
  11. चुनें "बाहरी ट्रिगर।"
  12. प्री-ट्रिगर समय को 10 एमएस तक सेट करें
  13. दोबारा की संख्या को 20 में सेट करें
  14. मोनोक्रोमेटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, 488 एनएम और "बाहरी ट्रिगर रोशनी" मोड का एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य चुनें।
  15. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर चलाएं
  16. उत्तेजना प्रोटोकॉल लोड करें
  17. वीडियो रिकॉर्ड करने से पहले, वीडियो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गहरा फ्रेम कैप्चर करें।
  18. उत्तेजना प्रोटोकॉल चलाएं
  19. आरओआई और चेक का चयन करेंकश्मीर दर्ज संकेत

5. डेटा विश्लेषण

नोएटी: डेटा विश्लेषण के लिए, सीसीडी कैमरा सॉफ्टवेयर और इमेजजे का उपयोग करें; डेटा स्प्रेडशीट प्रोग्राम में एक वक्र के रूप में दर्शाया गया है। सीसीडी कैमरा सॉफ्टवेयर में, औसत 20 दोहराता है और परिणाम को एक छविज समर्थन फ़ाइल में निर्यात करते हैं। ImageJ में, आरओआई और पृष्ठभूमि का चयन करें। ROI से पृष्ठभूमि घटाएं अनुपात के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करें: (ΔF / एफ 0 -1) एक्स 100%, जहां ΔF उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति की तीव्रता है और एफ 0 बाकी पर प्रतिदीप्ति की तीव्रता है।

  1. सीसीडी कैमरा के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, फाइल> औसत फाइलों पर क्लिक करें फ़ाइलों का चयन करें और उन्हें औसत करें।
  2. "फिटिंग फ़ाइल के रूप में सहेजें" पर क्लिक करके एक। फ़ाइल फ़ाइल के रूप में औसत फ़ाइल सहेजें।
  3. ImageJ सॉफ़्टवेयर चलाएं निम्न चरणों का पालन करें:
  4. छवि> समायोजन> चमक / कंट्रास्ट पर क्लिक करें
  5. छवि> ढेर> उपकरण> पर क्लिक करें; स्टैक सॉर्टर
  6. विश्लेषण> उपकरण> आरओआई प्रबंधक क्लिक करें
  7. ImageJ खिड़की में औसत फ़ाइल निकालें और ड्रॉप करें।
  8. बेहतर दृश्य के लिए विंडो पर ज़ूम इन करें
  9. कर्सर को स्थानांतरित करके, आखिरी फ्रेम का चयन करें और इसे हटा दें (यह अंधेरे फ्रेम है)
  10. पृष्ठभूमि के रूप में माना जाता है कि क्षेत्र पर एक आयताकार आरओआई चुनें इसे आरओआई प्रबंधक में जोड़ें
  11. अधिक> बहु उपाय पर क्लिक करके पृष्ठभूमि को मापें MEAN नोट करें डेटा की प्रतिलिपि बनाएं, इसे एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में निर्यात करें, और एक अनुपात के लिए सीमा के औसत मूल्य की गणना करें।
  12. प्रक्रिया> मुख्य> घटाएं क्लिक करके ढेर से दहलीज घटाएं थ्रेशोल्ड के औसत मूल्य दर्ज करें
  13. एक तंत्रिका टर्मिनल के आसपास एक आयताकार आरओआई चुनें इसे आरओआई प्रबंधक में जोड़ें
  14. अधिक> बहु उपाय पर क्लिक करके उपाय करें MEAN नोट करें कॉपी करें और इसे एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में निर्यात करें।
  15. औसत संकेतों की ऑफसेट
    नोट: का उपयोग करेंउत्तेजना के बिना बेस डाई प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करने वाले कई दर्जन अंक; यह बाकी पर प्रतिदीप्ति है
  16. बाकी पर प्रतिदीप्ति द्वारा संकेतों को विभाजित करें
  17. "1" घटाएं और 100% तक गुणा करें
  18. सिग्नल प्लॉट करें और Ca 2 + क्षणिक के आयाम की गणना करें।

Representative Results

डाई लोड हो रहा है और मोटर तंत्रिका उत्तेजना पर, फ्लोरोसेंट सिग्नल के आयाम में वृद्धि (सीए 2 + क्षणिक) तंत्रिका टर्मिनलों ( चित्रा 2 देखें) में पाया जा सकता है। सीए 2 + ट्रांसमीटर के पैरामीटर तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। मात्रात्मक रूप से, हमारे अध्ययन में मापा जाने वाले सीए 2 + ट्रैंटरों के पैरामीटर, ठंडे हुए जानवरों 15 , 34 के संक्रमण के अन्य वैज्ञानिकों द्वारा प्राप्त आंकड़ों के करीब हैं। सीए 2+ ट्रैटेटर्स के मापदंड, डाई और बाद में पृथक्करण के साथ Ca 2+ के बंधन की दर पर निर्भर करते हैं। सीए 2 + के प्रवेश की दर तंत्रिका अंत में, डाई के साथ संपर्क, और साइटोप्लाज्म में प्रसार सभी Ca 2 + क्षणिक के उदय समय को प्रभावित करते हैं। फ्लोरोसेंट सिग्नल का क्षय समय डाई की आत्मीयता पर निर्भर करता है,सीए 2 + इंट्रासेल्युलर बफ़र्स के साथ संपर्क की गति, और आयन पंप्स 35 द्वारा हटाने कैओसियम एंट्री पर विभिन्न पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सीए 2 + ट्रैंटरों के आयाम विश्लेषण का उपयोग किया जा सकता है जो न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 33 में भाग लेता है।

चित्र 2
चित्रा 2 : औसत Ca 2+ क्षणिक मेंढक NMJ में मापा सीए 2 + क्षणिक की गणना 13 मेंढक एनएमजे से संकेतों के औसत के आधार पर की गई थी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

शिखरΔ एफ / एफ (%) उदय समय 20% -80% (एमएस) Τ (एमएस)
12,6 ± 1,1 (एन = 13) 4.6 ± 0.5 (एन = 13) 115.3 ± 8.3 (एन = 13)

तालिका 1: सीए 2 + क्षणिक के औसत पैरामीटर डेटा को ± एसई मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; एन अलग एनएमजे में माप की संख्या है चोटी Δ एफ / एफ Δ एफ / एफ का औसत आयाम है

Discussion

इस पत्र में, हमने तंत्रिका स्टंप के माध्यम से मेंढक तंत्रिका अंत में सीए 2 + -सेन्सिटिव डाई लोडिंग करने की विधि प्रस्तुत की। लोडिंग प्रक्रिया के अंत तक, तंत्रिका के समीपस्थ भाग में सभी टर्मिनल प्रतिदीप्ति के महत्वपूर्ण स्तर हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि जांच का अंतर-टर्मिनल एकाग्रता 40 और 150 माइक्रोन 17 के बीच भिन्न होता है।

ऊष्मायन प्रक्रिया दो चरणों में आयोजित की जाती है: कमरे के तापमान पर और फिर एक रेफ्रिजरेटर में कम तापमान पर। कमरे के तापमान पर डाई के साथ ऊतक ऊष्मायन के समय को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। तंत्रिका स्टंप की वास्तविक लंबाई, विशिष्ट रंग और तापमान पर निर्भर करते हुए, ऊष्मायन समय भिन्न हो सकता है। यदि ओवरेक्स्पोज़्ड होता है, तंत्रिका स्टंप के नजदीक समीपस्थ भागों में टर्मिनल ओवरलोड हो सकते हैं। हालांकि, तंत्रिका के मध्य भाग में, यह अभी भी संभव है कि जो टर्मिनल संतोषजनक रूप से लोड किए जाते हैं। के दौरानई रेफ्रिजरेटर में लंबी ऊष्मायन, डाई समान तंत्रिका अंत पर वितरित किया जाता है।

33 , 35 के साथ-साथ अन्य शोधकर्ताओं के आंकड़ों के अनुसार, पोस्टऑनटैप्टिक प्रतिक्रिया के आयाम या लघु अंत प्लेट क्षमता की आवृत्ति पर लदान प्रक्रिया के किसी भी प्रभावशाली प्रभाव की कमी साबित होते हैं। भरी हुई तैयारी में अच्छे दीर्घायु का दस्तावेजीकरण किया गया था। कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर हम ध्यान आकर्षित करना चाहते हैं। कटौती तंत्रिका के axons में प्रवेश करने के लिए डाई सक्षम करने के लिए छिद्र के बाद भीतर मिनट के भीतर डाई-लोडिंग समाधान में तंत्रिका स्टंप लगाने के लिए बहुत आवश्यक है; देरी अप्रभावी लोडिंग का कारण हो सकती है, संभाव्यतः तंत्रिका एक्सॉन 27 , 36 के शोधन के कारण। कुछ जांचकर्ताओं ने तंत्रिका स्टंप को 100 एमएम EDTA (एक सीए 2 + - और एमजी 2 + - सीएलएटर में विसर्जित कर दिया है)) ने शोधन से कट एक्सॉन को रोकने के लिए तंत्रिका के छानने के तुरंत बाद। बफर 1-2 मिनट के बाद निकाल दिया जाता है और डाई लोडिंग समाधान 37 के साथ बदल दिया जाता है। लोडिंग प्रक्रिया के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के बजाय पेट्रोलियम-जेली का उपयोग छोटे नर्व स्टंप के उपयोग की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, डाई के साथ HEPES समाधान में विसर्जित होने के बाद तंत्रिका काट दिया जाता है, और डाई समाधान 27 , 28 में द्विपक्षीय आयनों की कमी के कारण अक्षतंतु शोध नहीं करते हैं।

हमारे अध्ययन में, हमने डेक्सट्रान के बजाय सीए 2 + इंडिकेटर के पानी में घुलनशील नमक का इस्तेमाल किया। डेक्सट्रान संयुग्म अक्षांश में अधिक नम्र रूपों की तुलना में धीरे धीरे फैलता है। हालांकि, डेक्सट्रान संयुग्म का उपयोग तंत्रिका और एनएमजे द्वारा डाई कम्पोबर्टलैजेशन और हैंडलिंग को कम करता है। कैल्शियम ग्रीन 1-3,000 मेगावाट डेक्सट्रान संयुग्तु का एक अच्छा प्रसार दर है और कम कंपौटलाइजेशन दर्शाता है अप क्लास = "xref"> 38

टिशू के फ्लोरोसेंट रोशनी की लंबी अवधि से बचने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उसके स्वास्थ्य और अस्तित्व को प्रभावित करता है। हम तंत्रिका टर्मिनलों की खोज के लिए दृश्य-प्रकाश चैनल में नोर्मास्की ऑप्टिक्स का उपयोग करते हैं। रिकॉर्डिंग के दौरान, हम एक डायाफ्राम का उपयोग करके प्रबुद्ध क्षेत्र को सीमित करते हैं।

यह उल्लेखनीय है कि यह लोडिंग पद्धति केवल तैयारी के लिए उपयुक्त है, जो लंबे समय तक इनक्यूबेशन का सामना कर सकती है। डाई लोडिंग के समय को कम करने के लिए जब अधिक नाजुक ऊतकों ( उदाहरण के लिए, गर्म रक्त वाले जानवरों के संक्रमण) पर अध्ययन किया जा रहा है, तो तंत्रिका स्टंप लंबाई को कम करने और 29 , 3 9 लोड करने के लिए माइक्रोप्रोपेटेस का उपयोग करने के लिए आवश्यक है।

यह लोडिंग तकनीक साइटोसोलिक सीए 2 + में इमेजिंग बदलावों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जिसमें एकल तंत्रिका उत्तेजना और तालबद्ध अन्तर्ग्रथनी गतिविधि दोनों के तहत फ्लोरोसेंट संकेतकों के साथईईएफ "> 17 , 27 , 35. सीए 2 + ट्रान्सियंट आयाप का विश्लेषण कैल्शियम एंट्री पर विभिन्न पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज 33 में भाग लेता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह अनुसंधान रूसी सरकार के कार्यक्रम के लिए कज़ान संघीय विश्वविद्यालय के प्रतियोगी विकास के लिए और मूल अनुसंधान के लिए रूसी फाउंडेशन (16-04-01051, 16-34-00817, 15-04-02983) से अनुदान के तहत किया गया था। पांडुलिपि के पहले ड्राफ्ट पर सहायक टिप्पणियां प्रदान करने के लिए हम चार अनाम समीक्षकों का धन्यवाद करते हैं। हम आवाज रिकॉर्डिंग के लिए यूलिया अरात्स्काय के लिए हमारी कृतज्ञता व्यक्त करते हैं। हम कई उपयोगी टिप्पणियों और पांडुलिपि के अंतिम संपादन के साथ मदद के लिए डॉ। विक्टर इलिन के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ca2+ indicator Molecular Probes, USA Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 500 μg
Silicone Elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184 elastomer
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10µL
Pipette tip Fisher Scientific, USA 02-707-175 10µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10µL
Razor Blade Fisher Scientific, USA 12-640
Minutien Pins Fine scince tools, Canada 26002-20
Corneal Mini-Scissors MT MEDI CORP, Canada S-1111
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9610
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9611
Modelling clay local producer can be replaced by any local producer
Petroleum jelly local producer can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400  Biosan, Latva BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latva BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40mm
Syrynge local producer 0.5 ml
HEPES  Sigma-Aldrich, USA H0887 100ml
Microscope, BX51 Olympus, Japan
Data acquisition system  Molecular Devices, USA Digitdata 1550
software Molecular Devices, USA pClamp software, Version 10 protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.
RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler Experimental Builder can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ 
Monochromator Till Photonics, Germany Polychrome V no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software Till Photonics, Germany Polycon
Digital CCD camera Redshirt imaging, USA Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera Redshirt imaging, USA Turbo SM software
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel 

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References

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कैल्शियम डाई में मेंढक तंत्रिका अंत में तंत्रिका स्टंप के माध्यम से लोड करना: मेंढक न्यूरोमस्कुलर जंक्शन में कैल्शियम क्षणिक पंजीकरण
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