تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

Summary

هنا، نحن تصف طريقة لتحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال الجذع العصب الضفدع في النهايات العصبية. كما نقدم بروتوكول لتسجيل وتحليل العابرين الكالسيوم سريع في النهايات العصبية الطرفية.

Abstract

واحدة من الطرق الأكثر جدوى لقياس مستويات الكالسيوم قبل المشبكي في محطات العصب بريسينابتيك هو التسجيل البصري. لأنه يقوم على استخدام الأصباغ الفلورية الحساسة الكالسيوم التي تغير شدة الانبعاثات أو الطول الموجي اعتمادا على تركيز الكالسيوم الحرة في الخلية. هناك العديد من الطرق المستخدمة لصبغ الخلايا مع أصباغ الكالسيوم. الأكثر شيوعا هي عمليات تحميل الأصباغ من خلال ميكروبيبيت أو قبل حضانة مع أشكال استر أسيتوكسيميثيل من الأصباغ. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا تنطبق تماما على التقاطعات العصبية والعضلية (نمجس) بسبب القضايا المنهجية التي تنشأ. في هذه المقالة، نقدم طريقة لتحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال الجذع العصب الضفدع العصب الضفدع في النهايات العصبية. منذ دخول الكالسيوم الخارجي في محطات العصب واللاحقة ملزمة لصبغة الكالسيوم تحدث داخل ميلي ثانية واحدة على نطاق و، فمن الضروري استخدام نظام التصوير السريع لتسجيل هذه التفاعلينانو ثانية. هنا، نحن تصف بروتوكول لتسجيل الكالسيوم عابرة مع كاميرا كسد سريعة.

Introduction

أيونات الكالسيوم (كا ^{2 +} ) المشاركة في العديد من عمليات الإشارات العصبية، بما في ذلك بدء والصيانة، والمرونة من إطلاق سراح ^{1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5} . عند وصول إمكانات العمل، خارج الخلية كا ^{2 +} يدخل محطة العصب ويبدأ الافراج العصبي. في بعض نقاط الاشتباك العصبي، يمكن قياس تيار الكالسيوم مباشرة بواسطة الطرق الكهربية ^{6 ، 7 ، 8} . في حالة تقاطع العصبية والعضلية (نمج)، لا يمكن للمرء أن استخدام المشبك التصحيح المباشر واثنين من القطب الكهربائي المشبك الجهد بسبب حجم دقيقة من النهايات العصبية.

تسجيلات كا ² الداخل ⁺ التيارات من النهايات العصبية في نمج يمكن أن يتم عن طريق إلكتروفيس غير مباشرةطرق إيولوجية ^{9 ، 10} . ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تتطلب المعالجة المسبقة من المشبك بواسطة الصوديوم والبوتاسيوم حاصرات قناة أيون. الطرق البصرية لا تتطلب الفصل الدوائي من التيارات الأيونية في محطة العصب وتسجيلات تسجيل كا ^{2 +} تدفق، الناجمة عن إمكانات العمل، والارتفاع اللاحق من كا ^{2 +} أيونات في الأكزوبلازم ^{11 ، 12 ، 13 ، 14} . وتستند هذه الأساليب على تسجيلات التغيرات في مضان محددة كا ^{2 +} أصباغ حساسة على ملزمة خالية كا ^{2 +} الأيونات ^{15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19} .

كا ²⁺ مؤشرات يمكن تحميلها في جمن خلال مجموعة متنوعة من الأساليب، اعتمادا على الغرض من التجربة. يستخدم الباحثون تطبيق حمام من أشكال صبغ غشاء نفاذية ^{20 ، 21} ، تحميل عبر ماصة التصحيح ²² ، أو ميكروينجكتيون ^{23 ، 24 ، 25} . ومع ذلك، كل هذه الأساليب لديها بعض القيود في حالة نمج بسبب خصوصياتها في الهندسة المعمارية متشابك. ل نمج، الأسلوب الأكثر ملاءمة وناجحة هو تحميل الصبغة من خلال الجذع العصب، وطريقة ملء الأمام ^{26 ، 27 ، 28 ، 29} . هذه التقنية يمكن استخدامها لتحميل الأصباغ مضان مختلفة في النهايات العصبية الطرفية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لمحطات العصب ذبابة الفاكهة ²⁸ ، العصب المحرك السحلية²⁸ ، ومحطات العصب المحرك الضفدع ^{17 ، 26 ، 27 ، 30} . اعتمادا على الكائن قيد الدراسة، يمكن أن تختلف التفاصيل المنهجية. ويمكن استخدام ماصة الزجاج الصغيرة للأعصاب الصغيرة من اليرقات ²⁸ . وقد وصف العديد من الباحثين طريقة ^{27 ، 28} التي يتم فيها مغمورة نهاية قطع حديثا من العصب تعصب العضلات في بئر مملوءة مسبقا مع صبغ. ثم يترك الإعداد لعدة ساعات لامتصاص الصبغة. يتم غارقة الصبغة حتى من قبل محاور عصبية ونقلها إلى محطات العصب. في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة تحميل مؤشر مضان في محطات العصب المحرك الضفدع من خلال الجذع العصب. يستخدم بروتوكول لدينا طرف ماصة البلاستيك لحضانة الأنسجة مع صبغ. نحن أيضا وصف كيفية الحصول على تحليل كا ^{2 +} مضان تراnsients.

Protocol

أجريت التجارب على الاستعدادات العصبية العضلية المعزولة للعضلات الجلدية العضلية من الضفدع رنا ريديبوندا . كان حجم الحيوانات من كلا الجنسين حوالي 5-9 سم. وقد أجريت الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات المختبرية من جامعة كازان الاتحادية وجامعة كازان الطبية، في الامتثال لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وقد استوفى البروتوكول التجريبي متطلبات توجيهات مجلس الاتحاد الأوروبي 86/609 / إيك وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة كازان الطبية.

1. إعداد الحلول

1. إعداد حل رينغر.
   1. إعداد حل رينغر: 113.0 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 3.0 ملي ناهكو ₃ ، و 1.8 ملي كاكل ₂ . ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4.
   2. إعداد حل رينغر مع انخفاض كا ^{2 +} 2+ المحتوى: 113.0 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 3.0 ملي ناهكو ₃ ، 6.0 ملي مغكل ₂ ، 0.9 ملي كاكل ₂ . ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4.
2. إعداد حل الصبغة التحميل.
   1. إعداد الحل القائم على المياه التي تحتوي على هيبيس-نا في 10 ملم (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4).
   2. إضافة 14 ميكرولتر من الحل هيبيس إلى قارورة مع صبغ ³⁰ .
      ملاحظة: صبغ مؤشر كا ^{2 +} يأتي في قارورة 500 ميكرولتر مع 500 ميكروغرام من مسحوق.
   3. دوامة وتدور باستمرار إلى مزيج دقيق.
   4. تمييع الحل لتحقيق التركيز النهائي من مؤشر كا ^{2 +} وصولا الى 30 ملم. تجنب التعرض للضوء ومخزن في -20 درجة مئوية.

2. صبغ التحميل الإجراء

1. تشريح الجلد الصدرية العضلات مع قطعة من العصب الصدري بروبريوس .
   ملاحظة: إجراء تشريح متاحفي تحميل مجاني للورقة من قبل بليوتش وآخرون. ، 1968 ³¹ .
   1. لإجراء تشريح، استخدم ملقط غرامة ومقص القرنية (انظر جدول المواد ). نقل الأنسجة تشريح في السيليكون المغلفة المطاط الصناعي طبق بتري قبل شغل الحل رينغر وإصلاح الأنسجة مع دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ غرامة بحيث يتم امتدت قليلا في الطبق.
   2. إعادة ملء طبق بتري مع قسامة جديدة من الحل رينغر ل. إزالة الأنسجة الضامة. لا تضر العصب.
2. إعداد ماصة ملء: باستخدام شفرة حلاقة، وقطع قطعة ~ 2 ملم طويلة من الجزء المخروطية من البلاستيك القياسية 10 ميكرولتر ماصة طرف.
3. إعداد قطعة من الطين النمذجة لتركيب ماصة ملء على طبق بتري.
4. ربط الجزء الخلفي من ماصة ملء إلى حقنة بلاستيكية عن طريق أنابيب السيليكون والبلاستيك ربط محولات مصنوعة من نصائح ماصة.
5. قبل دأنت تحميل الإجراء، وإزالة الحل رينغر من طبق بتري باستخدام ماصة بلاستيكية. تجفيف إعداد العضلات العصبية باستخدام حقنة غرامة. وهذا سيمنع التخفيف من كا ^{2 +} صبغ على التحميل اللاحقة من ماصة التعبئة.
6. إزالة قارورة مؤشر كا ²⁺ من الفريزر والسماح لها أن تذوب في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم.
7. تحت السيطرة ستيريوميكروسكوب مع التكبير المنخفض (10 ×)، والكشف عن تقاطع بين العضلات والعصبية. مع ملاقط ومقص غرامة، وقطع العصب بروبريوس الصدرية قريبة من سطح العضلات (انظر الخطوة 2.1). ترك الجذع العصبي حوالي 2 مم طويلة.
8. إصلاح ماصة ملء تعلق على الأنابيب والمحاقن على طبق بتري باستخدام النمذجة الطين.
9. نقل غيض من إغلاق ماصة لجذع العصب.
10. دون معسر، نضح بلطف الجذع العصب في غيض من ماصة ملء.
11. إزالة أنابيب الشفط من بلونر نهاية ماصة التعبئة.
12. إزالة بعناية الحل الزائد من ماصة ملء باستخدام حقنة مع إبرة طويلة (انظر جدول المواد ). لا قرصة الجذع العصب.
13. عموديا رفع غيض من ماصة ملء قليلا، والحفاظ على جذع العصب يستنشق في الطرف.
14. عزل الجزء يستنشق من الجذع العصب من الخارج من طرف ماصة ملء باستخدام هلام البترول.
15. تجفيف جذع العصب معزول في ماصة ملء إذا لزم الأمر: نضح بلطف الزائدة من الحل من ماصة ملء باستخدام حقنة مع إبرة طويلة.
16. رسم 0.5 ميكرولتر من محلول صبغ تحميل (انظر الخطوة 1) باستخدام ماصة مع طرف ماصة طويلة.
17. إدراج بلطف غيض ماصة مع حل التحميل في ماصة التعبئة. إخراج الخليط مباشرة على الجذع العصب.
18. ختم نهاية مفتوحة من ماصة ملء مع هلام البترول.
19. إضافة قسامة صغيرة من قارع الأجراسحل إلى طبق بتري للحفاظ على إعداد الرطب.
20. احتضان إعداد في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف مظلمة ورطبة لمدة 5 ساعات.
21. إزالة ماصة ملء مع حل التحميل، وشطف إعداد مع الحل رينغر، والحفاظ عليه بين عشية وضحاها في الثلاجة عند 8 درجة مئوية.

3. إعداد الأنسجة للمجهر

1. جبل إعداد في السيليكون المطاط الصناعي المغلفة غرفة وإصلاحه مع الصلب الإبر الدقيقة بحيث يتم امتدت قليلا.
2. شطف الأنسجة مع قسامة حل رينغر الطازجة.
3. استخدام القطب شفط لتحفيز العصب. بناء القطب متاح من تحميل مجاني للورقة من قبل كازاكوف وآخرون. ، 2015 ³² . وضع طرف القطب قريبة من نهاية قطع من العصب ونضح الجذع العصب في فتحة القطب.
4. جبل غرفة إعداد على مرحلة المجهر. PLACه التحقيق في درجة الحرارة وإطلاق مداخل ومخرج في الغرفة.
5. قم بتوصیل سلك الطاقة بعنصر بلتيير.
6. ل سوبيرفوس إعداد، استخدام نظام يحركها الجاذبية بسيطة. لإزالة الحل الزائد، بدوره على مضخة شفط نضح.
7. قم بتشغيل وحدة التحكم الحرارية.
8. ضبط التحكم في درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية.
9. جبل الدرع حماية الأشعة فوق البنفسجية.
10. ربط القطب الكهربائي تحفيز إلى مشجعا الكهربائية ومراقبة تقلصات العضلات تحت المجهر مع عدسة الهدف 4x.
11. ملء نظام نضح مع الحل رينغر مع منخفضة الكالسيوم ²⁺ وعالية مغ ²⁺ المحتوى.
    ملاحظة: يستخدم هذا الحل لمنع تقلصات العضلات. انخفاض في تركيز الكالسيوم الخارجي وارتفاع من المغنيسيوم الخارجي نتيجة في الحد من اتساع كا ²⁺ العابرين.ومع ذلك، استنادا إلى الخبرة السابقة، 0.9 ملي كلوريد الصوديوم 2 لا تزال كافية لحل موثوق السعة كا ^{2 +} العابرين. ومن الجدير بالذكر أن هناك بعض الطرق الأخرى لتقليل تقلصات العضلات دون الحد من تركيز الكالسيوم ²⁺ .على سبيل المثال، فإن استخدام د-توبوكورارين أو ألفا-بنغاروتوكسين، حاصرات محددة من مستقبلات أستيلين النيكوتين، وكتلة كليا أو جزئيا العضلات الشقوق ^{17 ، 27 ، 28 ، 30.} ومع ذلك، فإن إضافة هذه السموم يمكن أن تؤثر أيضا على دخول الكالسيوم قبل المشبكي ³³ . لتجنب هذا، μ-كونتوككسين جييا يمكن استخدامها ²⁷ .
12. التبديل على مضخة والبدء في سوبيرفوسيون من إعداد مع الحل رينغر مع انخفاض كا ^{2 +} وارتفاع مغ ²⁺ .
13. التبديل إلى عدسة موضوعية 40 × على المجهر.
14. قم بتشغيل t هو أحادي اللون (انظر جدول المواد ).
15. حدد الطول الموجي الانبعاثات 488 نانومتر ووضع مستمر من الإضاءة في برنامج التحكم أحادي اللون.
16. تحت التكبير عالية في وضع مضان، تأكد من أن المحطات العصبية تم تحميلها مع الصبغة.

الشكل 1 : العصب ومحطات مع تحميل كا ^{2 +} المؤشر. ( A ) العصبية مليئة كا ^{2 +} مؤشر بعد إجراء التحميل. شريط مقياس = 200 ميكرون. ( ب ) النهايات العصبية مليئة كا ^{2 +} المؤشر. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( C ) كا ^{2 +} -المعان مضان واضح للعيان في نهاية العصب. شريط مقياس = 20 ميكرون._blank "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

17. السماح للتحضير لتتوازن لمدة 30 دقيقة على الأقل في منخفض الكالسيوم ²⁺ وعالية مغ ²⁺ الحل.

4. التقاط الفيديو مع كاميرا كسد الرقمية

ملاحظة: تفاصيل التقاط إشارات مضان محددة لكل المجهر ونوع الكاميرا، ولكن الاعتبار الرئيسي هو سرعة التقاط الصور.

1. استخدم خز 1 كحد أدنى لتكرار الالتقاط لتسجيلات عابرة كا ²⁺ في نمج.
   ملاحظة: كاميرات كسد الرقمية السريعة ضرورية للتصوير مضان (انظر جدول المواد ). وقد تم استخدام نظام الحصول على البيانات والبرمجيات (انظر جدول المواد ) هنا لمزامنة الكاميرا، أحادي اللون، ومحفز. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول توليد نبضات التزامن على النواتج الرقمية للبياناتونظام اكتساب لفتح مصراع الكاميرا، والتقاط إشارة الفيديو، والشروع في التحفيز. يمكن تعيين جميع المعلمات الزمنية في البروتوكولات و / أو على الأجهزة. والبروتوكول النموذجي عبارة عن سلسلة من 500 إطار تم الحصول عليها عند خز 1 (80 × 80 بكسل). الإضاءة مع الإثارة الضوء يمكن التبييض من مؤشر كا ^{2 +} و فوتوداماج الأنسجة الخلية. وهكذا، تجنب التعرض الطويل للضوء الإثارة. في هذا البروتوكول، مصراع مفتوح فقط للوقت اللازم لالتقاط الفيديو. الحصول على سلسلة عشرين في محطة العصب محددة. والهدف هنا هو مراقبة نفس المواقع في المجموعة الضابطة وبعد تسليم الدواء.
2. تحت عدسة الهدف 4X من المجهر، واستخدام نظام حقل مشرق لتصور العضلات والأعصاب الفروع.
3. التبديل إلى عدسة الهدف 40X، وذلك باستخدام نظام إبيفلورزنس وطول موجي الإثارة من 488 نانومتر، والبحث عن النهايات العصبية محملة صبغ. تحديد المنطقة التي تنتهي الأعصاب من الفائدة.
4. على أنبوب ترينوكولار سو المجهر، حدد مستويات تبادل مسار الضوء: 100٪ ضوء للكاميرا.
5. بدء برنامج اكتساب للكاميرا كسد.
6. ضمن وضع "مباشر"، ابحث عن عائد الاستثمار وضبط التركيز.
7. حدد القائمة "تغيير" الإعدادات.
8. استخدام "التكوين الأساسي" في 1000 لقطة في الثانية (إطارا في الثانية)، مع دقة 80 × 80.
9. تعيين عدد إطارات الإدخال إلى 500.
10. أدخل اسم التجربة.
11. اختر "الزناد الخارجي".
12. تعيين وقت ما قبل الزناد إلى 10 مللي ثانية.
13. تعيين عدد مرات التكرار إلى 20.
14. في برنامج التحكم أحادي اللون، حدد الطول الموجي الانبعاثات من 488 نانومتر ووضع "الزناد الخارجية".
15. تشغيل برنامج الحصول على البيانات.
16. تحميل بروتوكول التحفيز.
17. قبل تسجيل الفيديو، التقاط الإطار المظلم باستخدام برنامج اقتناء الفيديو.
18. تشغيل بروتوكول التحفيز.
19. حدد عائد الاستثمار والشيكk الإشارة المسجلة.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: لتحليل البيانات، استخدم برنامج كاميرا كسد و إيماجيج. يتم تمثيل البيانات كمنحنى في برنامج جدول بيانات. في برنامج كاميرا كسد، متوسط ​​20 يكرر وتصدير النتائج إلى ملف دعم إيماجيج. في إيماجيج، حدد عائد الاستثمار والخلفية. اطرح الخلفية من عائد الاستثمار. تمثيل البيانات كنسبة: (ΔF / F ₀ -1) × 100٪، حيث ΔF هو شدة مضان أثناء التحفيز و F ₀ هو شدة مضان في الراحة.

1. في برنامج اكتساب كاميرا كسد، انقر فوق ملف> متوسط ​​الملفات. حدد الملفات ومتوسطها.
2. احفظ الملف المتوسط ​​كملف .fit بالنقر على "حفظ كملف صالح".
3. تشغيل برنامج إيماجيج. قم بتنفيذ الخطوات التالية:
4. انقر على الصورة> ضبط> السطوع / التباين.
5. انقر على الصورة> الأكوام> الأدوات>. كومة الفرز.
6. انقر على تحليل> أدوات> مدير عائد الاستثمار.
7. سحب وإسقاط ملف .fit متوسط ​​في إطار إيماجيج.
8. يمكنك التكبير في النافذة للحصول على عرض أفضل.
9. عن طريق تحريك المؤشر، حدد الإطار الأخير وحذفه (هذا هو الإطار المظلم)
10. حدد عائد استثمار مستطيل فوق المنطقة التي يعتقد أنها الخلفية. أضفه إلى مدير عائد الاستثمار
11. قم بقياس الخلفية بالنقر فوق المزيد> مولتي مياسور. لاحظ مين. انسخ البيانات وقم بتصديرها إلى برنامج جدول بيانات وحساب متوسط ​​قيمة العتبة لنسبة.
12. اطرح العتبة من الأكوام من خلال النقر على معالجة> الرئيسية> طرح. أدخل القيمة المتوسطة للعتبة.
13. حدد عائد استثمار مستطيل حول محطة العصب. أضفه إلى مدير عائد الاستثمار.
14. قياس عن طريق النقر فوق المزيد> قياس متعددة. لاحظ مين. نسخها وتصديرها إلى برنامج جدول بيانات.
15. متوسط ​​إزاحة الإشارات.
    ملاحظة: استخدمأول عدة عشرات نقطة مما يدل على قاعدة صبغ مضان دون التحفيز. هذا هو مضان في الراحة.
16. تقسيم الإشارات عن طريق مضان في الراحة.
17. طرح "1" وتضاعف بنسبة 100٪.
18. مؤامرة إشارة وحساب السعة من كا ^{2 +} عابرة.

Representative Results

بعد تحميل الصبغة وعلى تحفيز العصب الحركي، ويمكن الكشف عن زيادة في السعة من إشارة الفلورسنت (كا ^{2 +} عابرة) في محطات العصب (انظر الشكل 2 ). وترد في الجدول 1 معلمات كا ²⁺ العابرين. كميا، المعلمات من العابرين كا ²⁺ تقاس في دراستنا هي قريبة من البيانات التي تم الحصول عليها من قبل علماء آخرين في نقاط الاشتباك العصبي من الحيوانات ذات الدم البارد ^{15 ، 34} . المعلمات من كا ²⁺ العابرين تعتمد على معدل ملزمة من كا ^{2 +} مع الصبغة والتفكك اللاحقة. معدل دخول كا ²⁺ في نهاية العصب، والتفاعل مع الصبغة، ونشرها في السيتوبلازم تؤثر جميعها على ارتفاع وقت الكالسيوم ²⁺ عابرة. وقت الاضمحلال من إشارة الفلورسنت يعتمد على تقارب الصبغة،وسرعة التفاعل كا ^{2 +} مع المخازن داخل الخلايا، وإزالة بواسطة مضخات أيون ³⁵ . تحليل السعة من كا ²⁺ العابرين يمكن استخدامها لدراسة تأثير المواد المختلفة على دخول الكالسيوم الذي يشارك في الافراج العصبي ³³ .

الشكل 2 : متوسط ​​كا ^{2 +} عابرة تقاس في الضفدع نمج. تم حساب كا ^{2 +} عابرة على أساس متوسط ​​إشارات من 13 نمجس الضفدع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قمةΔF / F (٪)	ارتفاع الوقت 20٪ -80٪ ​​(مللي ثانية)	τ (مللي ثانية)
12،6 ± 1،1 (ن = 13)	4.6 ± 0.5 (ن = 13)	115.3 ± 8.3 (ن = 13)

الجدول 1: المتوسطات المتوسطة لكا ²⁺ العابرة. وتعرض البيانات على أنها متوسط ​​± سي؛ n هو عدد القياسات في نمجس متميزة. وتكون الذروة ΔF / F هي متوسط ​​السعة ΔF / F.

Discussion

في هذه الورقة، قدمنا ​​طريقة أداء كا ^{2 +} -حساسية صبغ تحميل في الضفدع النهايات العصبية من خلال الجذع العصب. وبحلول نهاية إجراء التحميل، وجميع المحطات في الجزء القريب من العصب لديهم مستويات كبيرة من مضان. وقد قدر أن تركيز داخل محطة من التحقيق يختلف بين 40 و 150 ميكرومتر ¹⁷ .

يتم إجراء الحضانة في خطوتين: في درجة حرارة الغرفة ثم عند درجة حرارة أقل في الثلاجة. من المهم السيطرة على وقت حضانة الأنسجة مع الصبغة في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على الطول الفعلي للجذع العصب، صبغ معين، ودرجة الحرارة، قد تختلف فترة حضانة. إذا التعرض المفرط، والمحطات في الأجزاء القريبة على مقربة من الجذع العصب يمكن أن تكون مفرطة. ومع ذلك، في الجزء الأوسط من العصب، فإنه لا يزال من الممكن العثور على المحطات التي يتم تحميلها بشكل مرض. خلال ثه حضانة طويلة في الثلاجة، وتوزع الصبغة بالتساوي على النهايات العصبية.

ملاحظاتنا الخاصة ^{33 ، 35} ، فضلا عن البيانات من الباحثين الآخرين ³⁰ ، تثبت عدم وجود أي تأثير ملموس من إجراءات التحميل على اتساع استجابة ما بعد المشبكي أو على وتيرة إمكانيات لوحة نهاية مصغرة. تم توثيق العمر الجيد في التحضيرات المحملة. هناك بعض النقاط الهامة التي نود لفت الانتباه إليها. فمن الضروري جدا لوضع الجذع العصب في محلول صبغ تحميل في غضون دقائق بعد الاستئصال لتمكين الصبغة للدخول في محاور عصبية قطع. والتأخير يمكن أن يسبب التحميل غير فعالة، ويفترض بسبب إعادة ختم المحاور العصبية ^{27 ، 36} . بعض المحققين تزج الجذع العصبي في 100 ملي إدتا (كا ²⁺ - و مغ ^{2 +} -chelator) مباشرة بعد استئصال العصب لمنع محاور قطع من ختم. تتم إزالة المخزن المؤقت بعد 1-2 دقيقة واستبداله محلول صبغ تحميل ³⁷ . استخدام البتروليوم هلام جيدا بدلا من الأنابيب البلاستيكية لإجراء التحميل يسمح استخدام أقصر العصب الجذع. أثناء استخدام هذا النهج، يتم قطع العصب بعد مغمورة في الحل هيبيس مع صبغ، والمحاور عصبية لا تختتم بسبب عدم وجود أيونات ثنائي التكافؤ في محلول صبغ ^{27 ، 28} .

في دراستنا، استخدمنا شكل الملح القابل للذوبان في الماء من مؤشر كا ^{2 +} بدلا من ديكستران. ديكستران تقارن منتشر في محور عصبي أكثر ببطء من أشكال الملح. ومع ذلك، فإن استخدام مترافق ديكستران يقلل من صبغ المقصورة والمناولة من قبل العصب و نمجس. الكالسيوم الأخضر 1-3،000 ميغاواط ديكستران متقارن لديه معدل نشر جيد ويوضح انخفاض التقسيم أوب كلاس = "كريف"> 38.

من المهم جدا لتجنب فترة طويلة من الإضاءة الفلورسنت من الأنسجة، لأن هذا يؤثر على صحتها والبقاء على قيد الحياة. نحن نستخدم البصريات نومارسكي في قناة الضوء المرئي للبحث عن محطات العصب. خلال التسجيل، ونحن نحد من حقل مضيئة باستخدام الحجاب الحاجز.

ومن الجدير بالذكر أن طريقة التحميل هذه مناسبة فقط للاستعدادات التي يمكن أن تصمد أمام الحضانات الطويلة. لتقليل الوقت صبغ التحميل عندما تجري الدراسات على الأنسجة أكثر هشاشة (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي من الحيوانات ذات الدم الحار)، فمن الضروري تقليص طول الجذع العصبي واستخدام ميكروبيبيتس لتحميل ^{29 ، 39} .

تقنية التحميل هذه مناسبة تماما للتغيرات التصوير في كا ² عصاري خلوي، مع مؤشرات الفلورسنت تحت كل من التحفيز العصب واحد والنشاط متشابك الإيقاعيإف "> 17 ^{، 27 ، 35.} يمكن استخدام تحليل السعة الكالسيوم ²⁺ -transient لدراسة تأثير المواد المختلفة على دخول الكالسيوم الذي يشارك في الإفراج العصبي ³³ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca2+ indicator	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806	500 μg
Silicone Elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184 elastomer
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
Pipette tip	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10µL
Razor Blade	Fisher Scientific, USA	12-640
Minutien Pins	Fine scince tools, Canada	26002-20
Corneal Mini-Scissors	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
Modelling clay	local producer		can be replaced by any local producer
Petroleum jelly	local producer		can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400	Biosan, Latva	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latva	BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40mm
Syrynge	local producer		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100ml
Microscope, BX51	Olympus, Japan
Data acquisition system	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
software	Molecular Devices, USA	pClamp software, Version 10	protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler	Experimental Builder		can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/
Monochromator	Till Photonics, Germany	Polychrome V	no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software	Till Photonics, Germany	Polycon
Digital CCD camera	Redshirt imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera	Redshirt imaging, USA	Turbo SM software
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel