Neuroscience

Fylla på en kalciumfärg i fröens nervändamål via nervstubben: Kalciumtransientregistrering i Neuromuskulär Junction

Published: July 8, 2017 doi: 10.3791/55122

Dmitry V. Samigullin^1,2,3, Eduard F. Khaziev^1,2,3, Nikita V. Zhilyakov^1,2, Ellya A. Bukharaeva^1,2, Eugeny E. Nikolsky^1,2,4

¹Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Russian Academy of Sciences, ²Open Laboratory of Neuropharmacology, Kazan Federal University, ³Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, ⁴Department of Medical and Biological Physics, Kazan State Medical University

Summary

Här beskriver vi en metod för att ladda ett kalciumkänsligt färgämne genom fröens nervstubbe i nervändarna. Vi presenterar också ett protokoll för inspelning och analys av snabba kalciumtransienter i perifera nervändarna.

Abstract

En av de mest genomförbara metoderna för mätning av presynaptiska kalciumnivåer i presynaptiska nervterminaler är optisk inspelning. Den baseras på användning av kalciumkänsliga fluorescerande färgämnen som förändrar deras utsläppsintensitet eller våglängd beroende på koncentrationen av fria kalcium i cellen. Det finns flera metoder som används för att fläcka celler med kalciumfärger. Mest vanliga är processerna för att ladda färgerna genom en mikropipett eller förinkubera med acetoximetylesterformerna av färgämnena. Dessa metoder är emellertid inte helt tillämpliga på neuromuskulära korsningar (NMJ) på grund av metodiska problem som uppstår. I den här artikeln presenterar vi en metod för att ladda ett kalciumkänsligt färgämne genom frönsnerven i groddarna i nervändarna. Eftersom inträde av yttre kalcium i nervterminalerna och den efterföljande bindningen till kalciumfärgen sker inom millisekundens tidsskala är det nödvändigt att använda ett snabbt bildningssystem för att registrera dessa interaktionerns. Här beskriver vi ett protokoll för registrering av kalciumtransienten med en snabb CCD-kamera.

Introduction

Kalciumjoner (Ca ²⁺ ) deltar i många neuronal signaleringsprocesser, inklusive initiering, underhåll och plasticitet av mediatorfrisättning ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Vid ankomsten av åtgärdspotentialet går extracellulär Ca2 ⁺ in i nervterminalen och initierar frigöring av neurotransmittor. I vissa synapser kan kalciumströmmen mätas direkt med elektrofysiologiska metoder ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . I fallet med den neuromuskulära korsningen (NMJ) kan man inte använda direkt patch-klämma och tvåelektrodspänningsklemmeteknik på grund av minutens storlek på nervändarna.

Inspelningar av inåtgående Ca ²⁺ strömmar från nervändarna i NMJ kan utföras med indirekta elektrofyserIologiska metoder ⁹ ^, ¹⁰ . Dessa metoder kräver emellertid förbehandling av synaps med natrium- och kaliumjonkanalblockerare. Optiska metoder kräver inte den farmakologiska separationen av jonströmmar i nervterminalen och möjliggör inspelningar av Ca2 ⁺ -strömmen, utlöses av åtgärdspotentialer och den efterföljande höjningen av Ca2 ⁺ -joner i axoplasmen ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ . Dessa metoder är baserade på inspelningar av förändringar i fluorescensen hos specifika Ca2 ⁺ -sensitiva färgämnen vid bindningen av fria Ca2 ⁺ -joner ¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ .

Ca ²⁺ indikatorer kan laddas i cElls genom olika metoder, beroende på experimentets syfte. Forskare använder badapplikationen av membranpermeabla färgämnen ²⁰ ^, ²¹ , laddning via patchpipett ²² eller mikroinjektion ²³ ^, ²⁴ ^, ²⁵ . Alla dessa metoder har emellertid vissa begränsningar när det gäller NMJ på grund av dess särdrag i synaptisk arkitektonik. För NMJ är den mest praktiska och framgångsrika metoden att ladda färgämnet genom nervstubben, en framfyllningsmetod ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ²⁹ . Denna teknik kan användas för att ladda olika fluorescensfärger i perifera nervändarna. Denna metod användes framgångsrikt för Drosophila nervterminaler ²⁸ , ödemotornerven²⁸ och grovmotorens nervterminaler ¹⁷ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ³⁰ . Beroende på objektet som studeras kan metodiska detaljer variera. En glasmikro-pipett kan användas för små nerver från larverna ²⁸ . Flera forskare har beskrivit en metod ²⁷ ^, ²⁸ där en nyskuren ände av nerv som inerverar en muskel är nedsänkt i en brunn som är förfylld med ett färgämne. Preparatet lämnas sedan i flera timmar för att suga färgämnet. Färgen blöts upp av axonerna och transporteras till nervterminalerna. I det här dokumentet beskriver vi en metod för att ladda en fluorescensindikator i frösmotorens nervterminaler genom nervstubben. Vårt protokoll använder ett plastpipettips för inkubation av vävnaden med ett färgämne. Vi beskriver också hur man förvärvar och analyserar Ca ²⁺ fluorescens transients.

Protocol

Experiment utfördes på isolerade nervmuskelpreparat av musculus kutan pectoris från Rana ridibunda groda. Storleken hos båda könsdjuren var ca 5-9 cm. Experimentella förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna för användning av laboratoriedjur från Kazan Federal University och Kazan Medical University, i enlighet med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Försöksprotokollet uppfyllde kraven i rådets direktiv 86/609 / EEG och godkändes av den etiska kommittén för Kazan Medical University.

1. Förberedelse av lösningarna

Framställning av Ringers lösning.
1. Förbered Ringers lösning: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCOs och 1,8 mM CaCl2. Justera pH till 7,2-7,4.
2. Förbered Ringers lösning med låg Ca ²⁺ 2+ innehåll: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCOs, 6,0 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2. Justera pH till 7,2-7,4.
Framställning av färgämnesladdningslösningen.
1. Förbered den vattenbaserade lösningen som innehåller HEPES-Na vid 10 mM (pH 7,2-7,4).
2. Tillsätt 14 μL HEPES-lösningen till en flaska med färgämnet ³⁰ .
  OBS! Ca ²⁺ -indikatorns färgämne kommer i en 500 ml flaska med 500 μg pulver.
3. Vortex och snurra ner för att blanda grundligt.
4. Späd lösningen för att bringa den slutliga koncentrationen av Ca ²⁺ -indikatorn ner till 30 mM. Undvik exponering för ljus och lagra vid -20 ° C.

2. Färgladdningsförfarande

Dissect den kutana pectoris muskeln med en del av pectoralis proprius nerv.
OBS: Proceduren för dissektion är tillgängligI en gratis nedladdning av papperet av Blioch et al. , 1968 ³¹ .
1. För dissektionsförfarandet, använd två fina pincett och hornhinnesax (se Materialetabellen ). Överför den dissekerade vävnaden till en kiselelastomerbelagd petriskål fylld med Ringers lösning och fixa vävnaden med fina rostfria stiftstiften så att den är något sträckt i skålen.
2. Fyll på Petri-skålen med en ny alikvot av Ringers lösning. Ta bort bindväven. Skada inte nerven.
Förbered fyllpipetten: Använd ett rakblad, skär ut en ~ 2 mm lång bit av den koniska delen av en vanlig plast 10 μL pipettspets.
Förbered en bit av modelleringslera för att montera fyllpipetten på petriskålen.
Anslut packettens baksida till en plastspruta via silikonrör och plastförbindningsadaptrar gjorda av pipettspetsar.
Före dDu laddar proceduren, ta bort Ringers lösning från Petriskålen med en plastpipett. Torka muskelnerven med en fin spruta; Detta kommer att förhindra utspädningen av Ca2 ⁺ -färgen vid efterföljande påfyllning av fyllpipetten.
Ta bort Ca ²⁺ -indikatorns injektionsflaska från frysen och låt den tina vid rumstemperatur på en mörk plats.
Under stereomikroskopkontroll med låg förstoring (10 ×), upptäcka korsningen mellan muskeln och nerven. Med fina pincett och sax skar du pectoralis propriusnerven nära muskelytan (se steg 2.1). Lämna en nervstubbe ca 2 mm lång.
Fixa påfyllningspipetten fäst på röret och sprutan på petriskålen med hjälp av modelleringslera.
Flytta pipettens spets nära nervstubben.
Utan att klämma den, försiktigt försiktigt nervstubben i spetsen på fyllpipetten.
Ta bort sugröret från blunganT slutet på fyllpipetten.
Ta försiktigt bort överskottslösningen från påfyllningspipetten med en spruta med en lång nål (se Materialetabellen ). Knippa inte nervstubben.
Höj vertikalt toppen av påfyllningspipetten något och håll nerverstubben i aspirationen i spetsen.
Isolera den aspirerade delen av nervstubben från utsidan av fyllpipettipsen med hjälp av petroleumjelly.
Torka upp nervstubben som är isolerad i påfyllningspipetten vid behov: Aspirera försiktigt överflödet av lösning från fyllpipetten med en spruta med en lång nål.
Rita 0,5 μL av färgämnesladdningslösningen (se steg 1) med hjälp av en pipett med en lång pipettspets.
Sätt försiktigt pipettspetsen med laddningslösningen i fyllpipetten. Utsätt blandningen direkt på nervstubben.
Tät den öppna änden av fyllpipetten med petroleumgel.
Lägg till en liten alikvot av Ringers sOlja till petriskålen för att hålla förberedelsen våt.
Inkubera beredningen vid rumstemperatur under mörka och våta förhållanden under 5 timmar.
Ta bort fyllpipetten med laddningslösningen, skölj preparatet med Ringers lösning och håll det över natten i kylskåp vid 8 ° C.

3. Förbered vävnaden för mikroskopi

Montera preparatet i kiselelastomert belagd kammare och fäst den med stålmikronålar så att den är något sträckt.
Skölj vävnaden med en alikvot av fräsch Ringers lösning.
Använd en sugelektrod för att stimulera nerven; Konstruktion av elektroden är tillgänglig från fri nedladdning av papperet av Kazakov et al. , 2015 ³² . Placera elektrodspetsen nära den sneda änden av nerven och aspirera nervstubben i elektrodöppningen.
Montera förberedningskammaren på mikroskopsteget. PlacE temperaturproben och inlopps- och utloppsändningarna i kammaren.
Anslut nätsladden till Peltier-elementet.
För att superfusa förberedelsen, använd ett enkelt tyngdkraftsdriven system. För att avlägsna överskottslösningen, sätt på perfusionssugpumpen.
Slå på termokontrollenheten.
Ställ in temperaturreglaget till 20 ° C.
Montera det ultravioletta skyddsskärmen.
Anslut den stimulerande trådelektroden till den elektriska stimulatorn och observera de muskulära sammandragningarna under mikroskopet med en 4x objektivlins.
Fyll upp perfusionssystemet med Ringers lösning med lågt Ca ²⁺ och hög Mg ²⁺ -halt.
OBS: Denna lösning används för att förhindra muskelkontraktioner. En minskning av koncentrationen av yttre kalcium och en höjning av yttre magnesium resulterar i reduktionen av amplituden av Ca2 ⁺ transienter. ^Men baserat på tidigare erfarenhet, 0,9 mM CaCl2 + transienter. Det är värt att nämna att det finns några andra sätt att minska muskelkontraktioner utan att minska Ca 2 ⁺ -koncentrationen. Till exempel skulle användningen av d-tubokurarin eller alfa-bungarotoxin, specifika blockerare av nikotinacetylkolinreceptorer, helt eller delvis blockera muskeltraktioner ¹⁷ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ^30. Dock kan tillsatsen av dessa toxiner också påverka presynaptisk kalciuminmatning ³³ . För att undvika detta kan μ-konotoxin GIIIA användas ²⁷ .
Slå på pumpen och starta superfusionen av preparatet med Ringers lösning med låg Ca ²⁺ och hög Mg ²⁺ .
Byt till 40 × objektivlinsen på mikroskopet.
Slå på t Han monokromator (se Materialetabellen ).
Välj en emissionsvåglängd på 488 nm och ett kontinuerligt belysningsalternativ i monokromatorstyrprogrammet.
Under hög förstoring i fluorescensläge, se till att nervterminalerna laddades med färgämnet.

Figur 1
Figur 1 : Nerv och terminaler med laddad Ca ²⁺ indikator. ( A ) Nervärde fylld med Ca ²⁺ indikator efter laddningsproceduren. Skalstång = 200 μm. ( B ) Nervändningar fyllda med Ca ²⁺ indikator. Skala bar = 20 μm. ( C ) Ca ²⁺ -indikatorns fluorescens är tydligt synlig i nervänden. Skala bar = 20 μm._blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Låt preparatet jämviktas i minst 30 minuter i lösningen med låg Ca ²⁺ och hög Mg ²⁺ .

4. Videoinspelning med den digitala CCD-kameran

Obs! Detaljerna för att fånga fluorescenssignaler är specifika för varje mikroskop och kameratyp, men det viktigaste är att bildfångsthastigheten ska beaktas.

Använd 1 kHz som minsta infångningsfrekvens för inspelningar av enskilda Ca ²⁺ transienter i NMJ.
OBS! Snabba digitala CCD-kameror är nödvändiga för fluorescensbilder (se materialet ). Datainsamlingssystemet och programvaran (se Materialetabellen ) användes här för synkronisering av kameran, monokromator och stimulator. I korthet tillåter detta protokoll genereringen av synkroniseringspulser på dataens digitala utgångarAnskaffningssystem för att öppna slutaren, ta in videosignalen och initiera stimulering. Alla temporala parametrar kan ställas in i protokollen och / eller på apparaterna. Ett typiskt protokoll är en serie på 500 bilder som förvärvats vid 1 kHz (80 x 80 pixlar). Belysning med excitationsljus kan bleka ut Ca ²⁺ -indikatorn och fotodamage cellvävnaden. Undvik sålunda långa exponeringar mot exciteringsljus. I det här protokollet är slutaren endast öppen för den tid som behövs för att fånga upp videoklippet. Förvärva tjugo serier per specifik nervterminal. Syftet är att övervaka samma platser i kontrollgruppen och efter leverans av läkemedel.
Under 4X objektivlinsen i ett mikroskop, använd ljusfältregimen för att visualisera muskel- och nervgrenarna.
Byt till 40X objektivlinsen och använd epifluorescensregimet och en exciteringsvåglängd på 488 nm för att söka efter färgämnesbelastade nervändar. Identifiera en nerveändande region av intresse.
På trinokulärröret oF mikroskopet, välj ljusväxlingsnivåerna: 100% ljus till kamera.
Starta förvärvsprogrammet för CCD-kameran.
Under "Live" -läget, hitta avkastningen och justera fokusen.
Välj menyn "Ändra" inställningar.
Använd "Basic Configuration" på 1000 bilder per sekund (fps), med en upplösning på 80 x 80.
Ställ in antalet inmatningsramar till 500.
Ange experimentets namn.
Välj "Extern utlösare".
Ställ in förtryckstiden till 10 ms.
Ställ in antalet upprepningar till 20.
I monokromatorstyrningsprogrammet väljer du en emissionsvåglängd på 488 nm och "extern triggerljus" -läge.
Kör dataöverföringsprogrammet.
Ladda stimuleringsprotokollet.
Innan du spelar in videoklippet tar du in den mörka ramen med videofångstprogrammet.
Kör stimuleringsprotokollet.
Välj avkastning och checK den inspelade signalen.

5. Dataanalys

NoOTE: För data analys, använd CCD kamerans programvara och ImageJ; Data representeras som en kurva i ett kalkylprogram. I CCD-kameraprogrammet upprepas medelvärdet 20 och exporterar resultaten till en ImageJ-supportfil. I ImageJ väljer du avkastningen och bakgrunden. Dra tillbaka bakgrunden från avkastningen. Representera data som ett förhållande: (ΔF / F 0-1) x 100%, där ΔF är intensiteten av fluorescens under stimulering och FO är intensiteten av fluorescens i vila.

I förvärvsprogrammet för CCD-kameran klickar du på Arkiv> Genomsnittliga filer. Välj filerna och genomsnitts dem.
Spara den genomsnittliga filen som en .fit-fil genom att klicka på "Spara som passande fil."
Kör ImageJ-programvaran. Utför följande steg:
Klicka på Bild> justera> ljusstyrka / kontrast.
Klicka på Bild> staplar> verktyg>; Stack sorterare.
Klicka på Analys> verktyg> ROI-chef.
Dra och släpp den genomsnittliga .fit-filen i ImageJ-fönstret.
Zooma in på fönstret för en bättre vy.
Genom att flytta markören väljer du den sista ramen och tar bort den (det här är den mörka ramen)
Välj en rektangulär avkastning över det område som tros vara bakgrunden. Lägg till det i ROI-hanteraren
Mät bakgrunden genom att klicka på Mer> Multi Measure. Notera MEAN. Kopiera data, exportera det till ett kalkylprogram och beräkna medelvärdet av tröskeln för ett förhållande.
Dra av tröskeln från staplarna genom att klicka på Process> Main> Subtract. Ange tröskelvärdet för medelvärdet för tröskeln.
Välj en rektangulär avkastning runt en nervterminal. Lägg till det i ROI-hanteraren.
Åtgärd genom att klicka på Mer> Multi Measure. Notera MEAN. Kopiera och exportera det till ett kalkylarksprogram.
Medelvärdet av signalerna förskjuts.
OBS! AnvändFörsta flera dussinpunkter som demonstrerar basfärgfluorescens utan stimulering; Detta är fluorescensen i vila.
Dela signalerna genom fluorescens i vila.
Subtrahera "1" och multiplicera med 100%.
Plot signalen och beräkna amplituden för Ca ²⁺ transienten.

Representative Results

Efter färgtillförseln och vid motorisk nervstimulering kan en ökning i amplituden hos den fluorescerande signalen (Ca ²⁺ transient) detekteras i nervterminalerna (se figur 2 ). Parametrar för Ca ²⁺ transienter presenteras i tabell 1 . Kvantitativt är parametrarna för Ca ²⁺ transienterna uppmätta i vår studie nära de data som erhållits av andra forskare vid synapser av kallblodiga djur ¹⁵ ^, ³⁴ . Parametrarna för Ca2 ⁺ -transienterna beror på bindningsgraden för Ca2 ⁺ med färgämnet och den efterföljande dissociationen. Inträdeshastigheten av Ca2 ⁺ i nervänden, interaktion med färgämnet och diffusion i cytoplasman påverkar allt uppehållstiden för Ca2 ⁺ -transienten. Förlängningstiden för den fluorescerande signalen beror på färgens affinitet,Hastigheten för Ca2 ⁺ -interaktionen med intracellulära buffertar och avlägsnandet av jonpumpar ³⁵ . Amplitudanalysen av Ca ²⁺ transienter kan användas för att studera påverkan av olika substanser på kalciumintaget som deltar i neurotransmittorfrisättning ³³ .

Figur 2
Figur 2 : Den genomsnittliga Ca ²⁺ Övergående mätt i grodan NMJ. Ca ²⁺ transienten beräknades baserat på medelvärdet av signaler från 13 groda NMJs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

ToppΔF / F (%)	Stigningstid 20% -80% (ms)	T (ms)
12,6 ± 1,1 (n = 13)	4,6 ± 0,5 (n = 13)	115,3 ± 8,3 (n = 13)

Tabell 1: De genomsnittliga parametrarna för Ca ²⁺ transienten. Data presenteras som medelvärdet ± SE; N är antalet mätningar i olika NMJ. Toppen AV / F är den genomsnittliga amplituden av AV / F.

Discussion

I det här dokumentet presenterade vi metoden att utföra Ca ²⁺ -sensitiv färgning i fröens nervändar genom nervstubben. Vid slutet av laddningsproceduren har alla terminaler i den proximala delen av nerven signifikanta nivåer av fluorescens. Det har uppskattats att sondens intra-terminala koncentration varierar mellan 40 och 150 uM ¹⁷ .

Inkubationsproceduren utförs i två steg: vid rumstemperatur och sedan vid en lägre temperatur i kylskåp. Det är viktigt att kontrollera tiden för vävnadsinkubation med färgämnet vid rumstemperatur. Beroende på den faktiska längden på nervstubben kan det specifika färgämnet och temperaturen inkubationstiden variera. Om överexponerade kan terminaler i de proximala delarna nära nervstubben vara överbelastade. Men i mitten av delen är det fortfarande möjligt att hitta terminaler som är tillfredsställande laddade. Under thEn lång inkubation i kylskåp, färgen är jämnt fördelad över nervändarna.

Våra egna observationer ³³ ^, ³⁵ samt data från andra forskare ³⁰ bevisar avsaknaden av något märkbart inflytande av laddningsförfarandet på amplituden för det postsynaptiska svaret eller på frekvensen för miniatyrändplattans potentialer. God livslängd dokumenterades i de laddade förberedelserna. Det finns några viktiga punkter som vi vill uppmärksamma. Det är väldigt viktigt att placera nervstubben i färgämne-laddningslösningen inåtgående minuter efter excision för att möjliggöra att färgämnet kommer in i axonen hos den skurna nerven; Förseningar kan orsaka ineffektiv laddning, förmodligen på grund av återföringen av nervaxonerna ²⁷ ^, ³⁶ . Några undersökare fördjupa nervstubben i 100 mM EDTA (en Ca 2 ⁺ - och Mg ²⁺ -kelator) Omedelbart efter excisionen av nerven för att förhindra att de skurna axonerna återförs. Bufferten avlägsnas efter 1-2 minuter och ersätts med en färgämneslösning ³⁷ . Användningen av en petroleumgelbrunn i stället för plaströr för laddningsproceduren möjliggör användning av en kortare nervstubbe. Under användningen av detta tillvägagångssätt skärs nerven efter det att den nedsänktes i HEPES-lösningen med färgämne, och axonerna försluts inte på grund av bristen på divalenta joner i färglösningen ²⁷ ^, ²⁸ .

I vår studie använde vi den vattenlösliga saltformen av Ca ²⁺ -indikatorn istället för dextran. Dextrankonjugaten diffunderar i axonen långsammare än saltformerna. Användningen av dextran-konjugatet minskar emellertid färgkammarisering och hantering av nerven och NMJ. Kalciumgrönt 1-3 000 MW dextran-konjugat har en god diffusionshastighet och visar minskad avdelning Up class = "xref"> 38.

Det är mycket viktigt att undvika en lång period av fluorescerande belysning av vävnaden, eftersom det påverkar dess hälsa och överlevnad. Vi använder Nomarski optik i synlig ljuskanal för att söka efter nervterminaler. Under inspelningen begränsar vi det upplysta fältet med ett membran.

Det är anmärkningsvärt att denna laddningsmetod endast är lämplig för preparat som tål långa inkubationer. För att minska färgad laddningstid när studier utförs på mer bräckliga vävnader ( t.ex. synapser av varmblodiga djur), är det nödvändigt att nedskalera nervstubbanlängden och använda mikropipetter för att ladda ²⁹ ^, ³⁹ .

Denna laddningsteknik är väl lämpad för avbildningsändringar i cytosolisk Ca ²⁺ , med fluorescerande indikatorer under både enkel-nervstimulering och rytmisk synaptisk aktivitetEf "> 17 ^, ²⁷ ^, ^35. Analysen av Ca ²⁺ -transientamplituden kan användas för att studera påverkan av olika substanser på kalciumintaget som deltar i neurotransmittorfrisättning ³³ .

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning utfördes under den ryska regeringens program för konkurrenskraftig tillväxt av Kazans federala universitet och ett bidrag från den ryska grunden för grundforskning (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Vi tackar fyra anonyma granskare för att ge användbara kommentarer om tidigare utkast till manuskriptet. Vi uttrycker vår tacksamhet till Yuliya Aratskaya för röstinspelningen. Vi är tacksamma för Dr Victor Ilyin för de många hjälpsamma kommentarerna och hjälpen med manuskriptets slutliga redigering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ca2+ indicator	Molecular Probes, USA	Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806	500 μg
Silicone Elastomer	Dow Corning, USA	Sylgard 184 elastomer
Pipette	Biohit, Russia	720210	0.5-10µL
Pipette tip	Fisher Scientific, USA	02-707-175	10µL
Pipette tip	Biohit, Russia	781349	10µL
Razor Blade	Fisher Scientific, USA	12-640
Minutien Pins	Fine scince tools, Canada	26002-20
Corneal Mini-Scissors	MT MEDI CORP, Canada	S-1111
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9610
Jeweler Forceps	MT MEDI CORP, Canada	F-9611
Modelling clay	local producer		can be replaced by any local producer
Petroleum jelly	local producer		can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400	Biosan, Latva	BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000	Biosan, Latva	BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles	Bbraun	100 Sterican	0.4×40mm
Syrynge	local producer		0.5 ml
HEPES	Sigma-Aldrich, USA	H0887	100ml
Microscope, BX51	Olympus, Japan
Data acquisition system	Molecular Devices, USA	Digitdata 1550
software	Molecular Devices, USA	pClamp software, Version 10	protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler	Experimental Builder		can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/
Monochromator	Till Photonics, Germany	Polychrome V	no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm
monochromator control software	Till Photonics, Germany	Polycon
Digital CCD camera	Redshirt imaging, USA	Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems, USA
Acquisition software for CCD camera	Redshirt imaging, USA	Turbo SM software
ImageJ	National Institutes of Health, USA		http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program	Microsoft, USA	Microsoft Office Excel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. Science. 256, 677-679 (1992).
Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release? Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).
Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).
Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).
Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse. Nature. 383, 431-434 (1996).
Borst, J. G., Sakmann, B. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem. J Physiol. 506, 143-157 (1998).
Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).
Molgó, J., Mallart, A. Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse. Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).
Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction. J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).
Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).
Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).
Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).
DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. J Physiol. 505, 585-592 (1997).
Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).
Suzuki, S. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).
Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).
Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).
Macleod, G. T. Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).
Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with Patch Pipettes. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).
Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).
Macleod, G. T. Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).
Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation. Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).
Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10, 465-473 (1993).
Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).
Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).
Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).
Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse. J Physiol. (1), 11-35 (1968).
Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).
Khaziev, E. Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).
Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs. J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).
Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).
Angleson, J. K., Betz, W. J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).
Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction. J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).
Troncone, L. R., et al. Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom. J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).
Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).

Neuroscience

Fylla på en kalciumfärg i fröens nervändamål via nervstubben: Kalciumtransientregistrering i Neuromuskulär Junction

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.